核酸標(biāo)記方法

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)核酸化學(xué)結(jié)課論文題日:核酸的各種標(biāo)記方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較學(xué)院:生命科學(xué)學(xué)院班級:生物技術(shù)1003班姓名:陳冠旭學(xué)號:20105491指導(dǎo)老師:高齡2014/5/5摘要本文綜述了幾種常用的DNA/RNA遺傳標(biāo)記及其在遺傳多樣性研究中的應(yīng)用。幾種標(biāo)記方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，都能從某個角度反映生物的某些遺傳特性，在科研中應(yīng)根據(jù)研究目的和背景選用恰當(dāng)?shù)臉?biāo)記方法，或不同的標(biāo)記聯(lián)合使用，以獲得全面的信息。關(guān)鍵詞：DNA探針，RNA探針，優(yōu)缺點(diǎn)正文核酸探針根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為DNA和RNA探針;根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物的與否，可分為放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針;根據(jù)是否存在互補(bǔ)鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況,可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。下面將介紹各種類型的探針及標(biāo)記方法。一、雙鏈DNA探針及其標(biāo)記方法分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應(yīng)用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機(jī)引物合成法。切口平移法(nicktranslation)當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時,E.coliDNA聚合酶I就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'一3'的核酸外切酶活性，能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補(bǔ)上核苷酸，從而使切口沿著DNA鏈移動，用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨?。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響：(a)產(chǎn)物的比活性取決于[a-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b)DNA酶I的用量和E.coliDNA聚合酶的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。(c)DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性，故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。隨機(jī)引物合成法隨機(jī)引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，產(chǎn)物平均長度為400-600個核苷酸。利用隨機(jī)引物進(jìn)行反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是：Klenow片段沒有5'-3'外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。反應(yīng)時對模板的要求不嚴(yán)格，用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物的比活性較高，可達(dá)4x109cpm/pg探針。隨機(jī)引物反應(yīng)還可以在低熔點(diǎn)瓊脂糖中直接進(jìn)行。二、單鏈DNA探針用雙鏈探針雜交檢測另一個遠(yuǎn)緣DNA時，探針序列與被檢測序列間有很多錯配。而兩條探針互補(bǔ)鏈之間的配對卻十分穩(wěn)定，即形成自身的無效雜交，結(jié)果使檢測效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種：⑴以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成單鏈探針；(2)以RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針。從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針合成單鏈DNA探針可將模板序列克隆到噬?；騇13噬菌體載體中，以此為模板，以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物，在[a-32P]-dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射標(biāo)記探針，反應(yīng)完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內(nèi)或下游用限制性內(nèi)切酶切割這些長短不一的產(chǎn)物，然后通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開。雙鏈RF型M13DNA也可用于單鏈DNA的制備，選用適當(dāng)?shù)囊锛纯芍苽湔溁蜇?fù)鏈單鏈探針。從RNA合成單鏈cDNA探針cDNA單鏈探針主要用來分離cDNA文庫中相應(yīng)的基因。用RNA為模板合成cDNA探針?biāo)玫囊镉袃煞N：用寡聚dT為引物合成cDNA探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA，并且產(chǎn)生的探針極大多數(shù)偏向于mRNA3'末端序列?？捎秒S機(jī)引物合成cDNA探針。該法可避免上述缺點(diǎn),產(chǎn)生比活性較高的探針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子，所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復(fù)雜得多，應(yīng)預(yù)先盡量富集mRNA中的目的序列。反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA/DNA雜交雙鏈經(jīng)堿變性后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段，經(jīng)SephadexG-50柱層析即可得到單鏈探針。三、 末端標(biāo)記DNA探針1、 利用本方法可對DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)記，利用它可定位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DNA片段。2、 對DNA的純度不很嚴(yán)格，少量制備的質(zhì)粒也可進(jìn)行末端標(biāo)記合成探針。3、 末端標(biāo)記還有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶標(biāo)記脫磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用該酶進(jìn)行交換反應(yīng)標(biāo)記5'末端。四、 寡核苷酸探針利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點(diǎn)突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種:單一已知序列的寡核苷酸探針和許多簡并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫。單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準(zhǔn)確配對，可以準(zhǔn)確地設(shè)計雜交條件，以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交，對于一些未知序列的目的片段則無效。五、各種miRNA標(biāo)記方法的優(yōu)缺點(diǎn)及適用條件標(biāo)記方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用條件直接標(biāo)記法操作簡單,RNA用量少，對miRNA含量及比例的保真性好,且不破壞miRNA本身的結(jié)構(gòu)標(biāo)記效率可能受miRNA核苷酸構(gòu)成比的影響檢測RNA較少或較珍貴，且miRNA核苷酸構(gòu)成比相近的樣品中的miRNA表達(dá)譜基于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的標(biāo)記方法操作較簡單，標(biāo)記效率受核苷酸構(gòu)成比的影響較小標(biāo)記效率的穩(wěn)定性較差，標(biāo)記產(chǎn)物含量及比例可能與原始樣品之間存在偏差檢測miRNA核苷酸構(gòu)成比差異大，且對結(jié)果的特異性要求不高的樣品中的miRNA表達(dá)譜基于miRNA克隆擴(kuò)增的標(biāo)記方法能夠更加敏感地檢測出樣品之間的miRNA表達(dá)差異操作復(fù)雜,RNA需要量大，標(biāo)記產(chǎn)物含量及比例可能與原始樣品之間存在偏差檢測RNA來源豐富的不同參比樣品之間miRNA表達(dá)的細(xì)微差異總結(jié)每種遺傳標(biāo)記都能反映生物遺傳特性的某些方面，都各有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍。在實(shí)際應(yīng)用中相互結(jié)合、相互補(bǔ)充，采用各種不同的遺傳標(biāo)記研究生物的遺傳結(jié)構(gòu)和控制機(jī)制,才能從各個角度揭示生物的遺傳本質(zhì)以及遺傳結(jié)構(gòu)和功能的內(nèi)在聯(lián)系,更深入全面地了解與我們的生存密切相關(guān)的生物世界,更好地保護(hù)生物資源。參考文獻(xiàn)李祥龍，張亞平，陳圣偶等.1997.山羊品種間線粒體DNA限制性片段長度多態(tài)性研究.動物學(xué)研究，18(4):421?428李祥龍，張亞平，陳圣偶等.1999.山羊mtDNA多態(tài)性及其起源分化研究.畜牧獸醫(yī)學(xué)報,30(4):313?319趙興波，儲明星，李寧等.2001.綿羊線粒體DNA控制區(qū)5'端序列PCR-SSCP與序列分析.遺傳學(xué)報,28(3):225?228[4]張于光,李迪強(qiáng)，饒力群等.2003.東北虎微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記的篩選及在親子鑒定中的應(yīng)用.動物學(xué)報,49(1):118?123張英杰、趙有璋，劉月琴等.2004.3個山羊群體中4個微衛(wèi)星DNA多態(tài)性及其與雜種優(yōu)勢的關(guān)系.遺傳,26(5):631?636賈斌，陳杰，趙茹茜等.2003.新疆8個綿羊品種遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的微衛(wèi)星分析.遺傳學(xué)報,30(9):847?854王吉振,儲明星，王愛國等.2004.用4個微衛(wèi)星標(biāo)記分析7個綿羊群體之間的遺傳關(guān)系.遺傳,26(5):637?643梁永紅，鄧彥昌，熊遠(yuǎn)著.2000.DNA指紋技術(shù)用于湖北白豬群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究.畜牧獸醫(yī)學(xué)報,31(2):106?112王昕,曹紅鶴，耿社民等.2002.利用微衛(wèi)星標(biāo)記對中國4種小型豬的遺傳多樣性研究.畜牧獸醫(yī)學(xué)報,33(6):530?532方盛國，馮文和，張安居等.1994.大熊貓親子鑒定 DNA指紋技術(shù)的應(yīng)用.四川大學(xué)學(xué)報,31(3):389?395郭澤坤，郭繼彤，安志興等.2002.體細(xì)胞克隆山羊微衛(wèi)星DNA分析.生物化學(xué)與生