擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP,Amplifiedrestrictionfragmentpolymorphism),是1993年荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)。文章主要講述該技術(shù)的原理、流程及特點(diǎn)，并從以下三個(gè)方面講述該技術(shù)的應(yīng)用情況：動(dòng)物學(xué)方面，講述其在動(dòng)物遺傳學(xué)，動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)，性別鑒定與繁殖行為研究上的應(yīng)用；植物學(xué)方面，講述其在種質(zhì)資源鑒定，作物育種上的應(yīng)用；醫(yī)學(xué)方面，講述其在腫瘤，遺傳病，流行病學(xué)方面的進(jìn)展。文章還分析了AFLP技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)并展望了其應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：AFLP，分子標(biāo)記技術(shù)，應(yīng)用目前遺傳標(biāo)記主要有4種類型，即形態(tài)標(biāo)記(MorphologicalMarkers)＞細(xì)胞標(biāo)記(CytologicalMarkers)、生化標(biāo)記(BiochemicalMarkers)和分子標(biāo)記(Mo1ecularMarkers)［1］。分子標(biāo)記一般指DNA標(biāo)記。分子標(biāo)記依據(jù)所用的分子生物學(xué)技術(shù)，大致分為三大類：(I)以電泳技術(shù)和分子雜交技術(shù)為核心，其代表性技術(shù)有RFLP和DNA指紋技術(shù)(DNAFingerprinting)。(11)以電泳技術(shù)和PCR技術(shù)為核心，其代表性技術(shù)有RAPD(RandomamplifiedpolymorphismDNA)、SSLP(Simplesequencelengthpolymorphism,或稱Sequence-taggedmicrosatellitesite,STMS)和AFLP。(III)基于DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)記，即SNP［2-4］。其中，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP，Amplifiedrestrictionfragmentpolymorphism)，是1993年荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法，已獲歐洲專利局的發(fā)明專利。該技術(shù)具有多態(tài)性豐富、靈敏度高、穩(wěn)定性好、可靠性高、不易受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各項(xiàng)研究中。1.AFLP分子標(biāo)記技術(shù)原理、流程及特點(diǎn)1.1.AFLP分子標(biāo)記技術(shù)原理AFLP技術(shù)是基于PCR反應(yīng)的一種選擇性擴(kuò)增限制性片段的方法。由于不同物種的基因組DNA大小不同，基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，用含有選擇性堿基的引物對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性，只有那些限制性位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無來檢驗(yàn)多態(tài)性［5］。Vos等(1995)曾對(duì)AFLP的反應(yīng)原理進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果檢測(cè)到的酶切片段數(shù)與預(yù)測(cè)到的酶切片段數(shù)完全一致，充分證明了AFLP技術(shù)原理的可靠性。進(jìn)行AFLP分析時(shí)，一般應(yīng)用兩種限制性內(nèi)切酶在適宜的緩沖系統(tǒng)中對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，一種為低頻剪切酶，識(shí)別位點(diǎn)為六堿基的rarecutter；另一種為高頻剪切酶，識(shí)別位點(diǎn)為四堿基的frequentcutter。雙酶切產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)度一般小于500bp，在AFLP反應(yīng)中可被優(yōu)先擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可被很好地分離，因此一般多采用稀有切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶與多切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶相搭配使用的雙酶切。目前常用的兩種酶是4個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的MseI和6個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的EcoRI。AFLP接頭和引物都是由人工合成的雙鏈核苷酸序列。接頭(Artificialadapter)一般長(zhǎng)14?18個(gè)堿基對(duì)，由一個(gè)核心序列(Coresequence)和一個(gè)酶?；蛄?Enzyme-specificsequence)組成。常用的多為EcoRI和MseI接頭，接頭和與接頭相鄰的酶切片段的堿基序列是引物的結(jié)合位點(diǎn)。AFLP引物包括三部分：5'端的與人工接頭序列互補(bǔ)的核心序列(coresequence，CORE)，限制性內(nèi)切酶特定序列(enzyme-specificsequence，ENZ)和3'端的帶有選擇性堿基的粘性末(selectiveextension，EXT)。1.2.AFLP分子標(biāo)記技術(shù)流程AFLP分子標(biāo)記技術(shù)包括3個(gè)步驟：(I)DNA的準(zhǔn)備。即DNA的酶切以及與人工合成的寡聚核甘酸接頭(artificialoligonucleotideadapter)連接。為了使酶切片段大小分布均勻，一般采用雙酶酶切，在基因組上分別產(chǎn)生低頻切口和高頻切口。(II)選擇性擴(kuò)增酶切片段。AFLP引物包括與人工接頭互補(bǔ)的核心序列(CORE)、限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列(ENZ)和3'端選擇性堿基三部分。一般用不帶或帶1個(gè)選擇性堿基的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，然后用帶2?3個(gè)選擇性堿基的引物進(jìn)行再擴(kuò)增。所用引物可用放射性或熒光標(biāo)記。(III)AFLP標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)。AFLP產(chǎn)物通過聚丙酰胺變性凝膠電泳(SDS—PAGE)檢測(cè)樣品的多態(tài)性，可靈敏地分辨只有一個(gè)堿基差異的不同DNA片段。[6](圖1)_接頭預(yù)擴(kuò)瑁逸擇性破基_接頭預(yù)擴(kuò)瑁逸擇性破基圖1.AFLP分子標(biāo)記技術(shù)流程圖1.3.AFLP分子標(biāo)記的特點(diǎn)DNA需要量少，檢測(cè)效率高，理論上可產(chǎn)生無限多的AFLP標(biāo)記。一個(gè)0.5mg的DNA樣品可做4000個(gè)反應(yīng)。由于AFLP分析可采用多種不同類型的限制性內(nèi)切酶及不同數(shù)目的選擇性堿基，因此理論上AFLP可產(chǎn)生無限多的標(biāo)記數(shù)并可覆蓋整個(gè)基因組。多態(tài)性高。AFLP分析可以通過改變限制性內(nèi)切酶和選擇性堿基的種類與數(shù)目，來調(diào)節(jié)擴(kuò)增的條帶數(shù)，具有較強(qiáng)的多態(tài)分辨能力。每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳可檢測(cè)到的標(biāo)記數(shù)為50?100個(gè)，能夠在遺傳關(guān)系十分相近的材料間產(chǎn)生多態(tài)性，被認(rèn)為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最豐富的一項(xiàng)技術(shù)。Becker等(1995)對(duì)多態(tài)性很差的大麥進(jìn)行AFLP分析，僅用16個(gè)引物就定位了118個(gè)位點(diǎn)［7］。)可靠性好，重復(fù)性高。AFLP分析采用特定引物擴(kuò)增，退火溫度高，使假陽(yáng)性降低，可靠性增高。AFLP標(biāo)記在后代中的遺傳和分離中遵守孟德爾定律；種群中的AFLP標(biāo)記位點(diǎn)遵循Hardy—Weinberg平衡。對(duì)DNA模板質(zhì)量要求高，對(duì)其濃度變化不敏感。AFLP反應(yīng)對(duì)模板濃度要求不高，在濃度相差1000倍的范圍內(nèi)仍可得到基本一致的結(jié)果。但該反應(yīng)對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求較為嚴(yán)格，DNA的質(zhì)量影響酶切、連接擴(kuò)增反應(yīng)的順利進(jìn)行。2.AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用AFLP作為一種較新的分子標(biāo)記，近10年來，AFLP技術(shù)獲得了很大進(jìn)步，并展示出良好的發(fā)展前景，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，如動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面。AFLP技術(shù)自發(fā)明以來，作為一種重復(fù)性好、分辨力高的DNA標(biāo)記，已經(jīng)成為生命科學(xué)各領(lǐng)域，尤其是分子遺傳學(xué)研究的一種重要工具和手段。近年來，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，該方法更加方便和易