細胞生物學課件：第十六章 PCD與細胞

第十三章PCD與細胞衰老機體結(jié)構細胞增殖細胞分化細胞凋亡細胞信號轉(zhuǎn)導染色體（DNA與蛋白質(zhì)的相互作用）衰老Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis（Wood2000）程序性細胞死亡細胞衰老PRIZEDHorvitz,andSulstonsharePhysiologyorMedicineNobel（2002）

“fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath”1090–131=959(cells)第一節(jié)程序性細胞死亡對單細胞生物來說，細胞的死亡即為個體的死亡。對多細胞生物來講，細胞的死亡對于維持個體的更深生長發(fā)育及其生命活動是必需的?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，不論是單細胞生物還是多細胞生物，其細胞死亡都會受受到細胞內(nèi)某種由遺傳機制決定的“死亡程序”控制，也即“程序性細胞死亡”（Programmedcelldeath,PCD).一.細胞凋亡的研究歷史

1.

凋亡概念的形成和形態(tài)學的研究(1972）1972年Kerr等在英國癌癥雜志發(fā)表論文，首次提出細胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了對細胞凋亡的真正探索的開始。2．DNA的降解和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的參與。(1987）3.蛋白質(zhì)水解酶活化的研究(1995)4.細胞膜的變化(1997)5.線粒體的變化和分子生物學的研究(1998-)1)相關基因及調(diào)控2）信號轉(zhuǎn)導3）各種分子及其相互作用及相互關系4）疾病機制的闡明，以及新療法的探索及問世。

二.概念

細胞凋亡是在體內(nèi)外因素誘導下，由基因嚴格控制而發(fā)生的自主性細胞有序死亡。細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）

PCD最初是1956年發(fā)育生物學中提出的概念，是個功能性概念，強調(diào)的是其分子生物學和生理功能，一般指生理性細胞死亡。描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預定的，并受到嚴格程序控制的正常組成部分。細胞凋亡與壞死的區(qū)別

細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別特征細胞凋亡細胞壞死誘導因素生理及弱刺激強烈刺激受累范圍單個細胞丟失成群細胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細胞體積減少、固縮增大腫脹染色質(zhì)凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細胞器無明顯變化腫張破壞溶酶體保持完整破壞外溢細胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機降解大分子合成一般需要不需要基因調(diào)控有無后果不引起炎癥反應引起炎癥反應意義生理死亡方式病理死亡方式/三.細胞凋亡的生物學特征形態(tài)學變化生物化學變化

DNA片段化大分子的合成

tTG（組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）的積累并達到較高的水平。

細胞凋亡的形態(tài)特征（1）凋亡的起始：微絨毛的消失，細胞間接觸的消失，與周圍的細胞脫離；細胞質(zhì)中，線粒體大體完整，染色質(zhì)固縮；細胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素C到胞漿，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面（2）凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞膜所包圍（3）凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬胸腺細胞正常凋亡

細胞凋亡DNA的片段化四.細胞凋亡的過程及機理

接受凋亡信號凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡的級聯(lián)反應細胞凋亡的兩條通路：膜受體通路、線粒體通路誘導細胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線（紫外線，

射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學及生物因子：包括活性氧基團和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細胞生長因子，腫瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等細胞凋亡的分子調(diào)控機理

●線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進細胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1 ●Caspase家族與凋亡

●Bcl-2家族、線粒體與細胞凋亡●細胞凋亡的分子機理（1）．Caspase家族相當于線蟲的ced-3，是引起凋亡的關鍵酶。特點：①酶活性依賴于cys殘基的親核性；②總是在asp之后切斷底物，故名caspase（cysteine

aspartate-specificprotease）。③亞基由同一基因編碼，前體被切割后產(chǎn)生兩個活性亞基，組成異四聚體。Caspaseclassification（Zimmermann2001）ExecutioneroreffectorAutocatalyticinitiatorCaspase活化

Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點裂解活化或自身活化胱冬肽酶在細胞凋亡中的作用：滅活細胞凋亡發(fā)生的抑制劑直接破壞裂解細胞結(jié)構裂解某些功能性的酶蛋白Caspase作用底物（2）.細胞凋亡的兩種基本途徑死亡信號途徑線粒體途徑2．Apaf-1凋亡酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），線蟲的同源物為ced-4。作用：參與線粒體凋亡途徑，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細胞過多，腦畸形發(fā)育。Apaf-1與cytc、ATP/dATP結(jié)合后，召集caspase-9，形成凋亡體（apoptosome），激活caspase-3，啟動caspase級聯(lián)反應。3.Bcl-2基因家族含有1-4個Bcl-2同源結(jié)構域（BH1-4）。分兩類：抗凋亡基因，如：Bcl-2；促凋亡基因，如：Bax。促凋亡蛋白能引起線粒體外膜通透性改變，導致cytc釋放，引起凋亡。Bcl-2相當于線蟲的ced9。主要定位于線粒體膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。Bcl-2genefamily（Zimmermann2001）4.Fas

fas又稱作APO-1，屬TNF受體家族。1993年人白細胞分型國際會議統(tǒng)一命名為CD95。fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合激活caspase。Fas誘導的細胞凋亡Fas與配體結(jié)合發(fā)生三聚化，通過胞內(nèi)的DD區(qū)（Deathdomain）與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結(jié)合。FADDN端通過DED區(qū)（deatheffectordomain）與Caspase-8前體結(jié)合，Caspase-8通過自身剪接激活。5．P53基因組的守護者。輻射誘導的DNA損傷可通過ATM激活p53，阻斷細胞周期，并提高Fas的表達，誘導凋亡。6．Myc轉(zhuǎn)錄因子，生長因子存在，Bcl-2基因表達時，促進細胞增殖，反之引起細胞凋亡。7.ATM是DNA損傷檢驗的重要蛋白激酶，能激活P53。七.細胞凋亡的生物學意義

生長發(fā)育：組織與器官的塑造（趾的分化）；動物變態(tài)；皮膚角質(zhì)形成；免疫細胞分化：克隆選擇；防御：清除衰老細胞、DNA損傷的細胞、以及被病原體感染的細胞。免疫細胞凋亡胸腺細胞成熟過程中的凋亡陽性選擇陰性選擇激活誘導的細胞凋亡：（activation-inducedcelldeath，AICD）

CTL誘導靶細胞的凋亡：穿孔素介導的靶細胞死亡

Fas介導的靶細胞凋亡B細胞凋亡:經(jīng)過基因重排,92%的細胞凋亡

細胞凋亡與人類疾病細胞凋亡受抑制有關的疾病

惡性腫瘤:濾泡性淋巴瘤、乳腺癌、等白血病自身免疫性疾?。合到y(tǒng)性紅斑狼瘡、腎炎病毒感染性疾?。合俨《静?、庖疹病毒病細胞凋亡增多有關的疾病

艾滋?。荷窠?jīng)變性性疾?。涸缋闲赃t呆、帕金森病、小腦退化病骨髓發(fā)育不全性疾病

缺血性疾病

酒精中毒性肝炎PCD在植物體整個生長發(fā)育過程中普遍存在。植物體在胚胎發(fā)育、根、莖、葉、花等器官的形態(tài)建成、細胞增殖分化過程中,都伴隨有PCD的發(fā)生。營養(yǎng)生長中的PCD現(xiàn)象糊粉層細胞的退化消失

根冠細胞的死亡

導管分子的形成

葉片的形成與衰老

生殖生長中的PCD現(xiàn)象大小孢子的形成與發(fā)育

雌、雄配子體的發(fā)育

胚的發(fā)育

單性花的形成八.細胞凋亡的檢測方法.一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測.二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）三、線粒體膜勢能（mt）的檢測四、DNA片斷化檢測

五、TUNEL法六、Caspase-3活性的檢測

七、WB檢測八、凋亡相關蛋白TFAR19的表達和細胞定位分析

細胞凋亡的形態(tài)學檢測

1光學顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess

（488nm400）電鏡觀察凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構。細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

線粒體膜勢能（mt）的檢測

線粒體熒光染料：Rhodamine123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等對線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。DNA片段化分析

細胞凋亡時主要生物化學特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。第二節(jié)細胞的衰老又稱老化，指細胞隨著年齡的增加，機能和結(jié)構發(fā)生退行性變化，趨向死亡的不可逆的現(xiàn)象。衰老和死亡是生命的基本現(xiàn)象，衰老過程發(fā)生在生物界的整體水平、種群水平、個體水平、細胞水平以及分子水平等不同的層次。Hayflick界限(HayflickLimitation）概念：關于細胞增殖能力和壽命是有限的觀點細胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限。癌細胞或培養(yǎng)的細胞系是不正常細胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細胞細胞的增殖能力與供體年齡有關物種壽命與培養(yǎng)細胞壽命之間存在著一定的關系二倍體細胞的衰老是由細胞本身決定的

◆決定細胞衰老的因素在細胞內(nèi)部，不是外部的環(huán)境

◆是細胞核而不是細胞質(zhì)決定了細胞衰老細胞來源人胚肺成纖維細胞中年人成纖維細胞老年人成纖維細胞可增殖代數(shù)40-60202-4不同年齡來源的人成纖維細胞的增殖代數(shù)二、細胞在體內(nèi)條件下的衰老●在機體內(nèi)，細胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生;●正常情況下終生保持分裂的細胞，其分裂能力是否隨著有機體年齡的增高而下降？它們會不會衰老？

◆衰老動物體內(nèi)，細胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長;◆衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細胞的增殖和衰老; ◆骨髓干細胞移植實驗說明隨著年齡的增加，干細胞增殖速度也趨緩慢.一、細胞衰老的特征

（一）形態(tài)變化1.水分減少、體積改變2.生化代謝與化學組成的改變蛋白質(zhì)合成速度下降，酶含量減少或功能降低。3.代謝廢物——脂褐素的堆積脂褐素的堆積嚴重影響細胞的代謝活動。1.

DNA：復制與轉(zhuǎn)錄受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、斷裂、缺失和交聯(lián)，甲基化程度降低。2.

RNA：