分子生物學(xué)：5第六章DNA轉(zhuǎn)錄2

第六章RNA轉(zhuǎn)錄后加工第一節(jié)原核生物RNA加工mRNA前體加工原核生物中，mRNA轉(zhuǎn)錄之后立即翻譯，一般沒(méi)有轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程。mRNA的5’端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3’端沒(méi)有或只有較短的多聚（A）結(jié)構(gòu)。mRNA的壽命非常短，大多數(shù)半衰期只有幾分鐘。rRNA前體加工原核生物中有三種rRNA（5S，16S，23S），其基因rDNA與tRNA的基因tDNA混合排列在一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中。tRNA前體加工“斬頭”，形成5′末端；去尾，形成3′-OH末端。缺-CCA的tRNA要用tRNA核酸轉(zhuǎn)移酶加-CCA。修飾：通過(guò)甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等進(jìn)行修飾，RNA酶ⅢRNA酶PRNA酶DtRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶參與tRNA加工相關(guān)的酶RNA酶Ⅲ：負(fù)責(zé)切開(kāi)間隔序列。RNA酶P：是一種內(nèi)切酶，能使tRNA產(chǎn)生成熟的5’末端。RNA酶D：是一種核酸外切酶，能逐個(gè)切除tRNA3’端多余的核苷酸，使CCA暴露。tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶（tRNA

nucleotidyl

transferase)：以ATP和CTP為前體，催化tRNA的3’末端生成CCA。在大腸桿菌中，該酶常用于對(duì)CCA末端降解的修復(fù)作用第二節(jié)真核生物RNA前體加工真核生物rRNA前體加工45S的5’端序列被切除，產(chǎn)生41S前體41S前體被切割分成兩部分，20S前體和32S前體20S3’端序列被切除，產(chǎn)生18SrRNA32SrRNA被切割生成5.8S和28SrRNA5.8S和28SrRNA互補(bǔ)配對(duì)真核生物mRNA前體加工5’端形成帽子結(jié)構(gòu)；3’端添加polyA尾巴；通過(guò)剪接除去內(nèi)含子序列；5’端形成帽子結(jié)構(gòu)：帽子結(jié)構(gòu)RNA鏈長(zhǎng)度超過(guò)20-30nt之前，其5’端經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾被加上一個(gè)7-甲基鳥(niǎo)苷殘基，這種修飾稱為帽子結(jié)構(gòu)。催化這一反應(yīng)的酶是mRNA鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)移酶。帽子結(jié)構(gòu)中，GMP通過(guò)5’-5’三磷酸橋與RNA鏈相連帽子0:N7－甲基鳥(niǎo)苷酸以5’－5’三磷酸二酯鍵和第一個(gè)核苷酸相連，所有真核生物都有。帽子1:如在第二個(gè)核苷酸(原mRNA5’第一位)的2’-OH位上加另一個(gè)甲基，這步反應(yīng)由2’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶完成。一般把有這兩個(gè)甲基的結(jié)構(gòu)稱為1類帽子。真核生物中以這類帽子結(jié)構(gòu)為主。帽子2:除了上述條件，第二個(gè)核苷酸2’－OH位上也產(chǎn)生甲基化帽子的合成核苷酸磷酸水解酶從mRNA前體5’端三磷酸脫去一個(gè)磷酸在鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶(Guanylyl

transferase）作用下和一個(gè)GTP反應(yīng)生成5’－5’三磷酸二酯鍵

并釋放一個(gè)PPi在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，產(chǎn)生帽子結(jié)構(gòu)S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine,SAM,AdoMet)是一種甲基基團(tuán)供體帽子功能：帽子結(jié)構(gòu)增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNA免遭5’外切核酸酶的降解；有助于mRNA越過(guò)核膜，進(jìn)入胞質(zhì)；；翻譯時(shí)供IFⅢ（起始因子）和核糖體識(shí)別，是翻譯所必需的。3’端添加polyA尾巴Poly

A概況：除組蛋白基因外，真核生物mRNA的3’末端都有多聚(A)序列，其長(zhǎng)度因mRNA種類不同而變化，一般為40-200個(gè)左右。由多聚(A)聚合酶催化的；它是在轉(zhuǎn)錄后加上的；Poly(A)被特異的蛋白質(zhì)PABP結(jié)合。在高等生物中(酵母除外)在poly(A)上游11-30nt處有一特殊序列AAUAAA，這一序列是高度保守的,對(duì)于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準(zhǔn)確切割及加多聚(A)是必需的。>AF030704TTTCGATGTGGTATTCATGGGAGAGTAGTTAGAGTCAGATCTAGAACAGATAGAAGAAATAGACTTCCACCAAAGAGAGTTGTTAAGAAGACTAATAAGCAACAAGCAGTCAAACCATCTACTGAAGCTGTTAAAGTTGAAGTTCCAGCTGATGTAGTTACTGCACCAAAAGTTGCTAGCCAAAAAGAAAGACCATTTAAATTCTTACAATAAATTAAGTCTGATCTGTTGTGTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAPolyA合成一個(gè)由4個(gè)亞基組成的特異性因子CPSF，與包含AAUAA的RNA序列結(jié)合；CPSF識(shí)別結(jié)合于AAUAA序列，并激活其它因子活性。CstF

與切割位點(diǎn)下游的富含G·U區(qū)結(jié)合；CFI和CFII具有核酸內(nèi)切酶活性，切除3’末端序列；PolyA聚合酶（PAP）添加A殘基，合成約200個(gè)A；PABP（polyA結(jié)合蛋白）與polyA結(jié)合。Poly

A功能：有助于穩(wěn)定mRNA分子，因此，與mRNA的壽命相關(guān)。但poly（A）的長(zhǎng)度與mRNA壽命沒(méi)有相關(guān)性。是mRNA由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必需的形式；為核糖體提供識(shí)別mRNA的信號(hào)。它可促進(jìn)核糖體的有效循環(huán)。有利于翻譯。polyA在分子生物學(xué)操作技術(shù)中有很大應(yīng)用價(jià)值：分離mRNAmRNA前體剪接從mRNA前體中去除內(nèi)含子，把外顯子連接成成熟mRNA的過(guò)程稱為RNA的剪接（RNAsplicing）。hnRNA（heterogenousnuclearRNA)：真核生物RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小差異很大，表現(xiàn)出不均一性，該轉(zhuǎn)錄群體統(tǒng)稱為核內(nèi)不均一RNA。其中主要是前mRNA（pre-mRNA）。hnRNA合成后很快被蛋白質(zhì)包裹形成hnRNP。hnRNP有助于保持hnRNA的單鏈狀態(tài)，并輔助各種RNA加工反應(yīng)。斷裂基因發(fā)現(xiàn)不久，Crick（1978年）就提出了一系列發(fā)人深思的問(wèn)題：（1）剪切作用若是通過(guò)酶來(lái)進(jìn)行的，那么這種剪接酶是怎樣識(shí)別RNA上特定的位點(diǎn)？（2）剪切酶有沒(méi)有特異性？對(duì)不同的RNA是否需要不同的酶？（3）切除的RNA是以線狀還是環(huán)狀存在的？切下的RNA的命運(yùn)將如何？

Chambon等分析比較了大量結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)含子切割位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)特點(diǎn)：（1）內(nèi)含子的兩個(gè)末端并不存在同源或互補(bǔ)。（2）連接點(diǎn)具有很短的保守序列,亦稱邊界序列。

100種內(nèi)含子的5′端都是GU；3′端都是AG，因此稱為GU-AG法則（GU-AGrule），又稱為Chambon法則。

GU-AG法則（GU-AGrule）不適用于線粒體、葉綠體的內(nèi)含子，也不適用于酵母的tRNA基因。除了邊界序列之外，外顯子與內(nèi)含子交界處的序列，內(nèi)含子內(nèi)部的部分序列都有可能參與內(nèi)含子的剪接。核mRNA內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：真核生物內(nèi)含子GT-AG法則：內(nèi)含子以GU開(kāi)始，以AG告終；剪接位點(diǎn)（splicingsite）：指內(nèi)含子與外顯子交界處的序列。內(nèi)含子上游的剪接點(diǎn)稱為5’剪接點(diǎn)或左剪接點(diǎn)或供體位點(diǎn)（donorsite），下游方向的剪接點(diǎn)稱為3’剪接點(diǎn)或右剪接點(diǎn)或受體位點(diǎn)（acceptorsite）；分枝點(diǎn)序列：具有分枝點(diǎn)序列，位于內(nèi)含子3’端上游18-50nt處，序列為Py80NPy87Pu75APy95，其中A為百分之百的保守，且具有2’-OH。內(nèi)含子5′端有一保守序列(5′GUAAGUA3’)可以和U1snRNA的5’端的保守序列3’CAUUUCAU5’互補(bǔ)。剪接過(guò)程（兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)）：分支位點(diǎn)中的一個(gè)腺苷酸殘基的2′-OH攻擊5′剪接位點(diǎn)的磷酸二酯鍵使其斷裂，形成一個(gè)2′，5′-磷酸二酯鍵；上游外顯子的3′-OH攻擊3′剪接位點(diǎn)的磷酸二酯鍵，使外顯子1和外顯子2連接在一起，并將內(nèi)含子以套索形式釋放。剪接體（spliceosome）哺乳動(dòng)物的細(xì)胞核中有富含U的小RNA，被命名為U1、U2、U4、U5和U6snRNA，這些RNA的長(zhǎng)度在107至201nt之間，分別與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核內(nèi)小核糖核蛋白（smallnuclearribonuleoprotein,snRNP）。這些snRNP與其他蛋白質(zhì)因子一起按嚴(yán)格的程序組裝成剪接體（spliceosome），完成兩步剪接反應(yīng)。細(xì)胞核中的小分子RNA稱為細(xì)胞核小RNA（smallnuclearRNA,snRNA);位于細(xì)胞質(zhì)中的稱為細(xì)胞質(zhì)小RNA(smallcytoplasmicRNA,

scRNA)。在自然狀態(tài)下，它們以核糖核蛋白顆粒（SnRNP和scRNP）的形式存在。在核仁中也存在著一類小的RNA，稱為核仁小RNA(smallnucleolarRNA,snoRNA),它們?cè)趓RNA的加工中起作用。snRNA參與剪接過(guò)程，并與其它蛋白一起構(gòu)成一個(gè)大的顆粒復(fù)合體,稱為剪接體(splicesome)。SPLICEOSOME(剪接體)Catalyzespre-mRNAsplicinginnucleus.Thespliceosomecomprisesabout150proteins(splicingfactorsetc.)

and

fivesnRNAs(U1,U2,U4,U5andU6),andthepre-mRNAbeingassembled.ThecomplexesofsnRNAandproteinsarecalled

smallnuclearribonuclearproteins(snRNP,

pronounces“snurps”).THREEROLESOFSNRNPSINSPLICING1.Recognizing

the5’splicesiteandthebranchsite.2.Bringing

thosesitestogether.3.Catalyzing

(orhelpingtocatalyze)theRNAcleavage.RNA-RNA,RNA-proteinandprotein-proteininteractionsareallimportantduringsplicing.真核生物MRNA前體中內(nèi)含子剪接過(guò)程示意圖由U1snRNA以堿基互補(bǔ)的方式識(shí)別mRNA前體5’剪接點(diǎn)，由結(jié)合在3’剪接點(diǎn)上游富嘧啶區(qū)的U2AF（U2auxiliaryfactor）識(shí)別3’剪接點(diǎn)并引導(dǎo)U2snRNP與分支點(diǎn)相結(jié)合，形成剪接前體（pre-spliceosome）。剪接前體進(jìn)一步與U4、U5、U6snRNP三聚體相結(jié)合，形成剪接體。內(nèi)含子剪接異常引起疾病

例如：

地中海貧血病人的珠蛋白基因中，大約有1/4的核苷酸突變發(fā)生在內(nèi)含子的5’或3’邊界保守序列上，或者直接干擾了前體mRNA的正常剪接。內(nèi)含子的變位剪接

ALTERNATIVESPLICING

在高等真核生物個(gè)體發(fā)育或細(xì)胞分化過(guò)程中可以有選擇性地越過(guò)某些外顯子或某個(gè)剪接點(diǎn)進(jìn)行變位剪接，產(chǎn)生出組織或發(fā)育階段特異性mRNA。脊椎動(dòng)物中大約有5%的基因能以這種方式進(jìn)行剪接，保證各同源蛋白質(zhì)之間既具有大致相同的結(jié)構(gòu)或功能域，又具有特定的性質(zhì)差異，進(jìn)而拓展了基因所攜帶的遺傳信息。Alternativesplicing(可變剪接):somepre-mRNAscanbesplicedinmorethanoneway,generatingalternativemRNAs.60%ofthehumangenesaresplicedinthismanner.DROSOPHILADSCAMGENECANBESPLICEDIN38,000ALTERNATIVEWAYSDIFFERENTWAYSOFALTERNATIVESPLICINGtRNA加工酵母tRNA基因酵母的272個(gè)tRNA基因中，有59個(gè)為斷裂基因剪接過(guò)程：前體tRNA在核酸酶作用下，切除內(nèi)含子序列，生成兩個(gè)半分子tRNA反密碼子環(huán)形成在RNA連接酶作用下生成成熟tRNA分子酶切和連接過(guò)程：核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生2’，3’－環(huán)磷酸基和5’－羥基末端環(huán)磷酸二酯酶打開(kāi)環(huán)；激酶在外顯子5’羥基添加磷酸基團(tuán)連接酶將AMP加到5’磷酸基團(tuán)連接酶將外顯子共價(jià)連接磷酸酯酶除去2’－磷酸基團(tuán)反式剪接反式剪接（trans-splicing）：不同基因的外顯子剪接后相互連接錐蟲(chóng)(trypanosome)的可變表面糖蛋白（VGS）基因成熟RNA的5‘端上游結(jié)合了一段35nt的外來(lái)RNA。第三節(jié)自我剪切內(nèi)含子

——I、II類內(nèi)含子I類內(nèi)含子的自我剪切四膜蟲(chóng)rRNA具有自我剪切活性1981年，切赫Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)rRNA前體具有高度專一的催化活性，能在沒(méi)有蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行自我剪接功能。剪接只需要GTP和陽(yáng)離子，無(wú)需酶催化。ThomasR.CechNobelPrizeforChemistry1989Group

I自我剪切過(guò)程G的3′-OH攻擊內(nèi)含子的5′末端；外顯子A的3′-OH攻擊外顯子B的5′末端；內(nèi)含子3’-OH攻擊5’末端附近的鍵。L19RNA的酶活性I類內(nèi)含子特點(diǎn)：其邊界序列為5’U-G3’內(nèi)含子中具有內(nèi)部引導(dǎo)序列（internalguidesequence)。I類內(nèi)含子常分布于低等真核生物的細(xì)胞器中，如四膜蟲(chóng)、絨泡菌的rRNA等。II類內(nèi)含子的自我剪接II類內(nèi)含子特點(diǎn)：邊界序列為5’GU-AG3’，無(wú)需鳥(niǎo)苷的輔助，但需鎂離子的存在。Ⅱ類內(nèi)含子分布在：真核生物線粒體葉綠體rRNA基因II類內(nèi)含子的剪接分枝點(diǎn)腺苷酸的2’-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子5’端的磷酸二酯鍵，內(nèi)含子5′的邊界序列上的G以5′磷酸和分枝點(diǎn)A的2′-OH形成磷酸二酯鍵，從而產(chǎn)生了套索（lariat）結(jié)構(gòu)。上游外顯子的3’-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子3’位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使套索結(jié)構(gòu)完全解離。上下游兩個(gè)外顯子通過(guò)新的磷酸二酯鍵相連。

酵母tRNAI類內(nèi)含子Ⅱ類內(nèi)含子核mRNA前體邊界順序無(wú)5’U↓-G↓3’5’↓GU-AG↓3’5’↓GU-AG↓3’特殊順序C（莖上）－G(環(huán)上)內(nèi)部引導(dǎo)順序分支點(diǎn)序列分支點(diǎn)序列,5’外顯子順序二級(jí)結(jié)構(gòu)莖環(huán)構(gòu)象核心結(jié)構(gòu)5、6功能區(qū)連接體基因外的成分內(nèi)切酶，連接酶GTP，鎂離子鎂離子U1U2,U4,U5,U6能量要求ATP不不ATP中間型分子半分子tRNA環(huán)狀L-19IVS套索套索它導(dǎo)致了DNA所編碼的遺傳信息的改變。第四節(jié)RNA的編輯RNA的編輯(RNAEDITING)編輯（editing）是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入，丟失或轉(zhuǎn)換等現(xiàn)象。介導(dǎo)RNA編輯的兩種機(jī)制：位點(diǎn)特異性脫氨基作用；引導(dǎo)RNA指導(dǎo)的尿嘧啶插入或刪除。AspecificallytargetedCresiduewithinmRNAisconvertedintoUbythedeaminase

(脫氨酶).Theprocessoccursonlyincertaintissuesorcelltypesandinaregulatedmanner.哺乳動(dòng)物載脂蛋白基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的編輯

肝中剪接的mRNA編碼含4563aa的蛋白質(zhì)腸mRNA有UAA密碼子在第2153位密碼子終止合成哺乳動(dòng)物中RNA編輯的實(shí)例組織靶標(biāo)RNA所改變的堿基結(jié)果肝臟，腸載脂蛋白BC→U谷氨酰胺密碼子→終止子肌肉半乳糖苷酶