大學(xué)生科技創(chuàng)新項目申請書董梅

一、基本情況項目名稱枇杷內(nèi)生真菌多樣性研究及其抗菌活性篩選主持人姓名董梅性別女民族漢出生年月1989年12月學(xué)號200913050517聯(lián)系電話主持人曾經(jīng)參與科研的情況參與指導(dǎo)教師“蒙自設(shè)施及保護地作物真菌病害多樣性調(diào)查及其病原鑒定”科研項目二、項目研究的目的意義植物內(nèi)生真菌(plantentophyticfungi)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌，被感染的宿主植物不表現(xiàn)或暫不表現(xiàn)出外在病癥，可通過組織學(xué)方法從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生。植物內(nèi)生真菌具有普遍存在性和生物多樣性,許多種類在植物體內(nèi)作為生防菌，能有效地防治植物病害,增強植物對病原菌的抗性。蒙自市枇杷種植歷史悠久，且隨著市場需求的不斷增加，枇杷種植規(guī)模不斷擴大，已成為當?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的經(jīng)濟支柱。但近年來枇杷根腐病嚴重發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟損失，制約著蒙自枇杷產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)蒙自市農(nóng)業(yè)局期路白農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心的調(diào)查研究，農(nóng)藥防治該病總是短期有效、治標不治本。另外，化學(xué)農(nóng)藥引起土壤、水體和大氣污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留:直接危害人類的健康及生存；而且，病原菌產(chǎn)生抗藥性。研究表明，內(nèi)生真菌不僅能促進寄主植物的快速生長，增強植物的抗逆性，而且能產(chǎn)生豐富的與寄主植物相同或相似的，并具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，因此為生物防治研究開辟了一個新的方向。三、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展動態(tài)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：植物內(nèi)生真菌普遍存在于植物的地上和地下部分，且只存在植物組織-真菌的互作界面。侵染根系的內(nèi)生真菌不形成明顯的結(jié)構(gòu)特征，此區(qū)別于菌根真菌，后者在植物根部組織中形成特定的功能性結(jié)構(gòu)。內(nèi)生真菌是一大類未被充分認識的真菌，在整個真菌學(xué)發(fā)展史上，內(nèi)生真菌的研究歷史并不長。1924年，Lewis首次報道禾本科植物葉片中存在內(nèi)生真菌，但此后的研究工作很少。1993年，美國科學(xué)家Stierle等⑴從短葉紅豆衫(Taxusbrevifolid的韌皮部分離到1株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌安德氏紫杉霉(Taxomycesandreana),從此掀起了人們對植物內(nèi)生真菌及其活性物質(zhì)開發(fā)的熱潮。植物內(nèi)生真菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成成分。它可以直接面對病菌的侵染，對病菌的致病因子或病菌本身發(fā)起攻擊，降解病菌致病因子或菌絲,產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性抑制病原物，而植物本身的基因并未發(fā)生改變，仍然可以保持天然性狀。另外，植物內(nèi)生真菌對寄主植物有促生作用。因此，植物內(nèi)生真菌是植物病害生物防治的天然資源菌，具有廣大的理論研究價值和開發(fā)應(yīng)用前景。目前，內(nèi)生真菌研究涉及如下幾個方面：植物內(nèi)生真菌具有普遍存在性植物內(nèi)生真菌普遍存在于目前已研究過的各種陸生及水生植物中，從低等的藻類植物、苔癬植物、蕨類植物到高等的裸子植物、被子植物的多種植物組織中，遍及整個植物界。自最早從禾本科植物牧草中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌以來，20世紀70年代后期，在一些重要的經(jīng)濟林木如針葉類的冷杉、云杉、紅杉、紫杉、松柏等，以及闊葉類的櫟樹、樺樹、榿木、桉樹植物樹皮、枝葉內(nèi)相繼發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌，并進行了廣泛的研究，進而在多種灌木、草本植物以及栽培作物、果樹甚至藻類、苔蘚和蕨類植物中也發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌⑵。植物內(nèi)生真菌的多樣性植物內(nèi)生真菌是一個多樣性十分豐富的生物類群，其多數(shù)屬于雙核菌門子囊菌亞門中的核菌綱(Pyrenomyetes)、盤菌綱(Discomycetes)和腔菌綱(Loculoascomycetes)及其無性的多種真菌，主要分布于植物的葉鞘、種子、花、莖、葉片和根等細胞間，多數(shù)情況下，在葉鞘和種子中分布量最多，而葉片和根含量極微［3］。內(nèi)生真菌主要通過菌絲生長進入子房胚珠，經(jīng)寄主植物種子傳播,或產(chǎn)生抱子,通過風(fēng)、降水等途徑傳播4］。植物內(nèi)生真菌具有分布廣、種類多的特點而且不同植物體內(nèi)分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量不同，少則十幾種，多則近百種。根據(jù)內(nèi)生真菌與宿主專一性分析，平均每種寄主有4?5種寄生菌，按地球目前已知的25萬種植物計算，內(nèi)生真菌的種類至少有10X106種。植物內(nèi)生真菌的生物多樣性和存在的普遍性為其研究提供了最基本的保證⑸。植物內(nèi)生真菌的生物活性3.1抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，一些來源于植物內(nèi)生真菌的天然產(chǎn)物具有抑制和殺滅許多病原微生物的作用，這些微生物包括感染人和動物的細菌、真菌、病毒等病原體以及植物病原菌等。3.1.1環(huán)肽抗生素［6］(Crytocandin)是一種多肽化合物，具有抗霉菌活性,是由分離自藥用植物雷公藤的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的。不僅對許多植物病原菌如核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum和灰葡萄抱(Botrydtiscinerea等有抗菌活性，還對一些重要的人類病原真菌如白假絲酵母(CandidaalbicanS、毛癬菌(Trichophytonspp.)等有抗菌活性，因而有望開發(fā)成抑制皮膚和指甲真菌感染的藥物。從番茄(Lycopersicumesculentu)i的根部分離得到內(nèi)生真菌尖鐮抱霉(Fusriumoxysporu)對病原菌有很好的抑制作用。從錫蘭肉桂［6］(Cinnanomumzeylanicun)中分離的一種內(nèi)生真菌(Muscodoralbus),通過產(chǎn)生多種揮發(fā)性物質(zhì)來抑制或殺滅一些植物和人體病原菌。Harper等⑺人從Terminaliamorobensis的內(nèi)生真菌中分離到了兩種化合物Pestacin和Isopestacin。實驗證實,兩者既具有抗菌活性，同時又有抗氧化活性。3.2抗腫瘤活性3.2.1紫杉醇［"(Taxol)是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種紫杉烷類二萜化合物。它能促進微管聚合,抑制微管解聚,使細胞有絲分裂停止在G2期和M期，從而發(fā)揮其對細胞生長的抑制作用。紫杉醇已成為近年來抗癌藥物研究中新的熱點，現(xiàn)已被許多國家用于治療化療無效的卵巢癌和乳腺癌。1993年和1996年，Stierle等z分別從寄生于太平洋紅豆杉(TaxusbrevifoliaNutt.)樹皮內(nèi)的真菌(Taxomycesandreanae的發(fā)酵液中和西藏紅豆杉(TaxuswallachianaZucc.)的內(nèi)生真菌中分離得到了紫杉醇。我國研究者對生長在長白山地區(qū)的東北紅豆杉(TaxuscuspidatasiebZucc.)內(nèi)生真菌進行了研究，發(fā)現(xiàn)其中一株絲狀真菌TCH68的發(fā)酵液，在體外細胞實驗中，能夠使細胞有絲分裂停止在中期,有可能從中獲得新的作用于微管的抗腫瘤抗生素［8］。從紅豆杉屬植物內(nèi)生真菌得到的紫杉醇,不僅解決了紫杉醇在紅豆杉植物中含量極低的問題，而且對我國紅豆杉屬植物資源起到了保護的作用。3.2.2長春堿［io.ii］(Vinblastine)、長春新堿(Vincristine)是五十年代末，從長春花(Catharanthusroseus(L.)Don)中發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤活性，尤其對白血病具顯著療效。此后，從長春花不同部位分離出100多種生物堿，但這些生物堿在植物體內(nèi)含量低，且植物生長緩慢，資源短缺，限制了抗癌藥物的進一步開發(fā)。而從長春花的內(nèi)生真菌中分離提取出長春新堿將解決這一難題。3.2.3喜樹堿［12］(Camptothesin)、羥基喜樹堿是從我國特有植物喜樹(CamptothecaacuminataDecne.)當中分離得到，喜樹堿在臨床上廣泛應(yīng)用于肝癌、胃癌、膀胱癌及白血病等的治療,是拓樸異構(gòu)酶I的專屬性抑制劑。喜樹中喜樹堿、羥基喜樹堿的含量極低(0.01%?0.10%),且結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以合成［13］,遠遠不能滿足臨床治療的需要。通過對喜樹的不同部位內(nèi)生真菌的分離情況看，喜樹的葉、枝條和果實的內(nèi)生真菌菌株的含量高。喜樹內(nèi)生真菌菌株進行體外抗腫瘤活性篩選，在篩選出的10個內(nèi)生菌株中，有7個內(nèi)生菌株發(fā)酵液能顯著抑制白血病細胞HL60的生長［13］。3.2.4美登素(Maytasine)%］是SMKupchan等首先從齒葉美登木(Maytanusserrata中獲得的高效、低毒、結(jié)構(gòu)新穎的抗癌有效成分。我國學(xué)者也獲得類似的研究成果從美登木(MhookeriLoes)中分到了美登素陰。但是，在美登木內(nèi)生真菌中并未得到美登素，張玲琪等級］首次報道了從美登木莖、葉中分離篩選到一株產(chǎn)球毛殼甲素的內(nèi)生真菌一球毛殼菌,球毛殼素是Sekita等［17］于1983年新發(fā)現(xiàn)的抗癌化合物。3.2.5鬼臼毒素［1&19］(Podophyllotoxin)含有獨特的反式內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，主要阻止細胞分裂前期(G2期)或從G2期進入分裂期的過程,屬于細胞周期特異性藥物；它是合成多種治療癌癥藥物的前體，具有顯著的抗腫瘤活性，因而具有較大的經(jīng)濟價值［20.21］。鬼臼毒素一直是從小檗科鬼臼亞科植物中提取，含量低,遠不能滿足要求，加之于對植物原料需求的增多，已使這類植物資源遭到嚴重破壞。李海燕等⑵］從桃兒七(Sinopodophyllumhexandrum)植株中分離得到28株真菌，其中，有兩株產(chǎn)鬼臼毒素類似物，它們分屬于青霉屬(Penicillium和鏈格抱屬(Alternaria2003年楊顯志等測］從四川八角蓮(Dysosmaveitchii)、南方山荷葉(Diphylleiasinensis)等產(chǎn)鬼臼毒素的植物中都分離到產(chǎn)鬼臼毒素的內(nèi)生真菌。3.2.6白灰制菌素A(Leucinostatina)是Strobel等⑵］在歐洲紫杉(Taxusbaccata的內(nèi)生真菌枝頂霉屬(Acremoniumsp.)中提取到一種白灰制菌素A,這種物質(zhì)除了具有殺真菌活性外,對人體的某些癌細胞具有很強的抑制作用，因此具有很好的推廣價值。3.2.7Torreyanicacid】25］是一種選擇性的具有細胞毒的苯醌二聚物，由一株分離自佛羅里達榧樹(Torreyataxifoli)的內(nèi)生真菌的研究發(fā)現(xiàn)，該化合物具有較強的抗腫瘤作用，并且可以通過誘導(dǎo)細胞凋亡而促進腫瘤細胞死亡。3.2.8異香豆素的內(nèi)生真菌海洋微生物的研究是一個新興的巨大領(lǐng)域，紅樹林海洋真菌是海洋微生物的重要組成部分。王軍等［26］從南海紅樹(RhizophorachinensisL.)的嫩葉中獲得一種內(nèi)生真菌No.2533，其代謝產(chǎn)物很豐富，其中分離獲得的異香豆素aviccruin-A是一種新化合物。異香豆素是一類廣泛存在于自然界的天然產(chǎn)物，其中某些化合物具有通便、退熱等藥理作用和明顯的抗癌活性。3.2.9胞松素類化合物（屬于生物堿類物質(zhì)）Wagenaar等加］人從傳統(tǒng)藥用植物雷公藤（Tripterygiumwilfordii中分離了一種內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生三種結(jié)構(gòu)新穎的胞松素。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這三種化合物都具有抗腫瘤活性。Huangyaojian等⑵］從南方紅豆杉（Taxusmairei和香榧（TorreyagrandiS等藥用植物中分離了擬青霉菌屬（Paecilomycessp.）內(nèi)生真菌,通過MTT法檢測到這種內(nèi)生真菌具有很高的抗癌活性,對人體癌細胞有抑制作用。通過對抗腫瘤藥用植物內(nèi)生真菌的研究，可以得到與宿主植物相同活性的物質(zhì)，不僅可以擴大藥用資源,同時也彌補了某些藥用植物資源和瀕危藥物物種的短缺。解決了藥用植物資源生長周期長，不能滿足人們預(yù)防及治療疾病的需求問題。3.3殺蟲活性3.3.1Nodulisporicacids［28］是一種吲哚二萜類化合物，是從植物Bontiadaphnoides的內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)的，它具有殺滅大蒼蠅幼蟲的活性。3.3.2香豆酮衍生物 Findlay等四］人從伏臥白株樹（Gaultheriaprocumben》中分離的內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)了兩種香豆酮衍生物，兩者都對云杉蚜蟲具有毒性。3.3.3萘萘是由藤蔓植物（Paullinapaulliniod?啲內(nèi)生真菌產(chǎn)生的跑。實際上，該化合物是一種廣泛使用的驅(qū)蟲劑一樟腦球的有效成分。3.3.4抗瘧疾物質(zhì)OsterhogeC.wi］從綠藻類石莼（Ulvalactncal植物內(nèi)生真菌中分離出一種新的結(jié)構(gòu)異常的四聚體酸（AscosalipyrrolidinonesA）（1）對瘧原蟲FalciparumstrainKl和NF54有抗性。從內(nèi)生真菌Geotrichumsp.的發(fā)酵液中分離出三種新的二氫異香豆素衍生物和從內(nèi)生真菌Phomopsissp.BCC1323中分離出的兩種新的二聚體，都具抗瘧疾作用，同時這兩種物質(zhì)還有抗結(jié)核的作用。植物內(nèi)生真菌與寄主的關(guān)系由于植物內(nèi)生真菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境，與宿主協(xié)同進化，二者形成相互共生的關(guān)系：（1）植物為內(nèi)生真菌提供光合作用產(chǎn)物和礦物質(zhì)，并對內(nèi)生真菌起到保護的作用。（2）內(nèi)生真菌的代謝物能刺激宿主植物的生長發(fā)育，增強宿主植物對生物（食草動物、昆蟲、病原菌）脅迫及非生物（高溫、干旱、高鹽等）的脅迫抗性阿。植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生多種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)如植物生長素、赤霉素、細胞激動素等，可直接促進宿主植物的生長［33］。在低水平氮源的土壤中，可增加宿主對氮元素的吸收。植物內(nèi)生真菌可以提高宿主植物對非生物脅迫的對抗性可以增加其抗旱、抗高溫的能力。植物內(nèi)生真菌可增加宿主植物對病蟲害的抵抗能力，對有害昆蟲和對植物致病菌都有抗性[34]由于內(nèi)生真菌存在于植物組織內(nèi),不受外界環(huán)境的影響，對植物生長發(fā)育、抵抗病蟲害等具有廣泛的生物學(xué)作用，是一類應(yīng)用前景廣闊的天然微生物資源。因此，從植物內(nèi)真菌中篩選有價值的生防菌，進行生物防治具有非常重要的意義。我們相信在不久的將來，利用內(nèi)生真菌進行生物防治將是一種趨勢。參考文獻:StierleA,StrobelG,StierleD,TaxolandtaxaneproductionbyTaxomycesandr-eanae,anendophyticfungusofPacificyew[J].Science,1993,260:21H216楊玉鋒，李保利.植物內(nèi)生真菌在植物病害生物防治中的作用[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011,40(3):25?28CarrolG,Fungalendophytesinstemsandleaves:fromlatentpathogentomut-ualisticsymbiont[J].Ecology,1998,69:29李明.植物內(nèi)生菌[J].生物學(xué)教學(xué),2003,28(5):1?3官珊,鐘國華.植物內(nèi)生真菌的研究進展[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報.2005,18(1):61?66StrobelGA,DirkseE,SearsJ,etal.VolatileantimicrobialsfromMuscodoralbus,anovelendophyticfungus[J].Microbiology,2001,147(11):294?350ZhangB,SalituroG,SzalkowskiD,etal.Discoveryofsmallmoleculeinsulinmimeticwithantidiabeticactivityinmice[J].Science,1999,284:974?981姜威,金文藻.東北紅豆杉內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)研究[J].中國抗生素雜志,1998,23(4):263?266StrobelG,YangXS,SearsJ,etal.TaxolandtaxaneproductionbyTaxomycesanreanae.AnendophyticfungusofTaxuswallachiana[J].Microbiology.1996,142(2):435BarryVC,SecondaryProductsfromPlantTissueCulture[J].Oxfoed.1990:224SchieO,BerlinJ,PlantCellTissueOrganCult[J].1987,8(2):153RivoryLP,RobertJ,Molecular,cellular,andclinicalaspectsofthepharmacolpgyof20(S)camptothecinanditsderivatives[J].PharmacolTher,1995,68:264296ChavanSP,SivappaR,Asynthesisofcamptothecin[J].2004,45:31143115KupchanSM,etal.Maytansine,anovelantileukemicansamacrolidefrommaytenusovatus[J].Jamchem.Soc.l972,94(4):1354?1356周韻麗，黃麗英,周倩如，等?云南美登木中美登素和美登普林的分離和鑒定科學(xué)通報[J].1980,25(9):48張玲琪，王海昆，邵華，等?美登木內(nèi)生真菌產(chǎn)抗癌物質(zhì)球毛殼甲素的分離及鑒定[J].中國藥學(xué)雜志，2002,37(3):172?175StrobelEG,STIERLEA,STIERLED,etal.Taxomycesandreanae,aproposednewtaxonforabulbilliferoushyphomyceteassociatedwithpacificyew(Taxusbreviflia)[J].Mycotaxon,1993,47:71楊倉良?毒藥本草[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社,1993,132?133中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1979,246?252暢行若，胡之璧.草藥窩兒七化學(xué)成分研究[J].藥學(xué)學(xué)報，1980,15(3):158?161楊新波.鬼臼毒素抗腫瘤作用研究進展[S].國外醫(yī)藥植物藥分冊,1996,11(4):158?159李海燕，曾松榮，張玲琪?云南桃兒七植株地下莖內(nèi)生真菌多樣性及有價值菌株的篩[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999,12(4):123?125楊顯志，郭仕平,張玲琪，等.鬼臼類植物產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌的篩選[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2003,(5):419?422StrobelGA,DirkseE,SearsJ,etal.VolatileantimicrobialsfromMuscodoralbus,anovelendophyticfungus[J].Microbiology,2001,147(11):294?350WangenaarM,CorwinJ,Strobel,GA,etal.ThreenewchytochalasinaproducedbyanendophyicfungusinthegenusRhinocladiella[J].JNatprod2000,63:1692?1695王軍，林永成,吳雄宇，等?從南海紅樹林內(nèi)生真菌No.2533分離出新的異香豆素[J].中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2001,40(1):127?128Huangyaojian,Wangjianfeng,Liguiling,etal.AntitumorandantifungalactivitiesinendphyticfungiisolatedfrompharmaceuticalplantsTaxusmairei,CephalataxusfortuneiandTorreyagrandis[J].FEMSImmunologyandMedicalmicrobiology,2001,31(2):163?167StrobelG,DaisyB,CastilloU,etal.Naturalproductsfromendophyticmicroorga-nisms[J].Jnatprod.2004,67(2):257?268DsisyBH,StrobelGA,CastilloU,etal.Naphthalene,aninsectrepellentisproducedbyMuscodorvifignus,anovelendophyticfungus[J].Microbio,2002,148:373"HarpreJK,FordEJ,strobelga,eal.Pestacin:al,3-dihydroisobenzofuranfrom