重組蛋白和多肽的分離純化

重組蛋白和多肽的分離純化1.概述分離純化組成了基因工程的下游處理（downstreamprocessing）階段，這一過程又和上游過程緊密相聯(lián)系，上游過程的諸方面影響到下游的分離純化，所以在進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)純化時要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計，并充分考慮上游因素對下游的影響，如是否帶有親和標(biāo)簽，是否進(jìn)行分泌表達(dá)。目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)有三大類，分別是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法顯著影響下游的處理過程，目標(biāo)蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目標(biāo)蛋白表達(dá)的定位（胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和胞外），蛋白表達(dá)的量都依賴于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)。選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可以避免破碎細(xì)胞的步驟，并且由于蛋白質(zhì)種類少，目標(biāo)蛋白容易純化；而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)蛋白，可能是可溶性表達(dá)，可能形成包涵體，可溶性的蛋白往往需要復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離，純度較高，但回收具有生物活性的蛋白卻變的相當(dāng)困難，需要對聚集的蛋白進(jìn)行變復(fù)性，通?；钚缘鞍椎牡寐时容^低，表1列出了不同策略對表達(dá)、純化的影響，對于其中的有些缺點可以通過一定的方法進(jìn)行克服和避免，如利用DNA重組技術(shù)給外源蛋白加上一個親和純化的標(biāo)簽，有助于可溶性外源蛋白的選擇性純化，并能保護(hù)目標(biāo)蛋白不被降解（96）。表1重組蛋白不同表達(dá)策略的優(yōu)點和缺點筑表達(dá)策略繼優(yōu)點旗缺點完分泌表達(dá)至濤細(xì)胞外沿增強(qiáng)正確二司硫鍵的形成沸降低蛋白酶腸對表達(dá)蛋白蘇的降解擴(kuò)可獲得確定頁的鞠N糧末端之顯著減少雜我蛋白水平，著簡化純化兩不需要細(xì)胞飛破碎悲表達(dá)水平低貴多數(shù)蛋白不突能進(jìn)行分泌讀表達(dá)塞表達(dá)蛋白需婦要進(jìn)行濃縮判細(xì)胞周質(zhì)空澆間表達(dá)忽增強(qiáng)正確二飯硫鍵的形成似可獲得確定勝的私N母末端爽顯著減少雜持蛋白水平，解簡化純化免好些蛋白不宏能分泌進(jìn)入丑周質(zhì)空間憑沒有大規(guī)模繳選擇性的釋昏放周質(zhì)空間醫(yī)蛋白的技術(shù)丟周質(zhì)蛋白酶侄可引起重組混蛋白酶解騰胞內(nèi)包涵體蠅表達(dá)火包涵體易于填分離躍保護(hù)蛋白質(zhì)單不被降解淡蛋白質(zhì)不具庸有活性對宿戲主細(xì)胞生長肚沒有大的影歲響，通?？筛@得高的表認(rèn)達(dá)水平百需要體外的然折疊和溶解隱，得率較低丟具有不確定朱N愉末端街胞內(nèi)可溶性朋蛋白表達(dá)教不需要體外盯溶解和折疊盤一般具有正陣確的結(jié)構(gòu)和燥功能卷高水平的表蠢達(dá)常難以得淡到會需要復(fù)雜的域純化裝可發(fā)生蛋白湊質(zhì)的酶解隸具有不確定備的鈴N悼末端在細(xì)胞的提取物中，除了目標(biāo)蛋白外，還含有其它各種性質(zhì)的蛋白、核酸、多糖等。在這樣一個混合體系中，蛋白質(zhì)純化要求將目標(biāo)蛋白與其它的成分分離，得到一定的量，達(dá)到一定的純度，同時要盡可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白質(zhì)的分離純化可以看作是一系列的分部收集過程，總是希望目標(biāo)蛋白富集于其中的一個收集部位，而大量的雜蛋白存在于其它的收集部位。當(dāng)然對目標(biāo)蛋白純度的要求要根據(jù)純化蛋白的用途而定，對于治療性的蛋白要求有大于99%的純度，并對處方有活性和穩(wěn)定性的要求，對于某些酶的純度則要求較低，需要在純度和得率之間進(jìn)行一個平衡，所以下游的工藝流程取決于最終對目標(biāo)蛋白的要求。蛋白質(zhì)的功能依賴于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對于有生物活性的蛋白質(zhì)，在分離純化過程中必須根據(jù)目標(biāo)蛋白的特點，采用合適的操作條件和方法，保證目標(biāo)蛋白的活性盡量不損失。除了在分離純化的初期，要采用快速的方法除去影響目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的雜質(zhì)，還要嚴(yán)格控制涉及蛋白質(zhì)變性的各種因素，來避免蛋白質(zhì)失去活性。蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性可以通過測定蛋白質(zhì)變性反應(yīng)時折疊（f）和去折疊（u）間自由能的變化（ΔGf→u）來衡量，ΔGf→u越大蛋白質(zhì)就越穩(wěn)定。根據(jù)報導(dǎo)蛋白質(zhì)的ΔGf→u在5—20kcal/mol范圍之間，單個氫鍵可造成0.5—2kcal/mol自由能的變化，一個離子對可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的變化，因此ΔGf→u相對比較小，這樣天然狀態(tài)僅僅比去折疊狀態(tài)穩(wěn)定一點，所以必須克服蛋白質(zhì)內(nèi)在的不穩(wěn)定性，保留蛋白的活性。這一點在分離純化和蛋白質(zhì)儲存中都很重要，影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素有溫度、pH、離子強(qiáng)度、某些添加劑、表面吸附、震搖、剪切力、凍融、蛋白濃度、壓力等，這些因素對折疊的影響有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之間也有影響，在實際處理中應(yīng)選擇合適的條件，盡量避免不利因素的影響（2），并利用活性跟蹤的方法對處理進(jìn)行評價，指導(dǎo)分離純化。在進(jìn)行任何純化工作時，第一步必須針對目標(biāo)蛋白建立特異性的分析方法。這些特異性的分析方法都是基于目標(biāo)蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫學(xué)活性，物理特性（如分子量、等電點、光譜學(xué)特征等），生物學(xué)活性。在理想的情況下，我們希望所選擇的分析方法具有特異、快速、靈敏和可定量的特點。特異性要求分析方法反映目標(biāo)蛋白的獨特性，以排除假陽性。快速則要求能很快的給出定性和定量結(jié)果，以便更好的與分離純化的工作相銜接。靈敏的分析方法僅需要少量的樣品，這就給操作帶來了極大的方便。在分離純化的每一步，都需要對蛋白和活性進(jìn)行定量，這就要求分析方法有準(zhǔn)確可定量的特點，以對分離純化的效果進(jìn)行評價。如通過SDS電泳測定蛋白質(zhì)分子量來鑒定蛋白質(zhì)，由于電泳的分辨率限制，常常不能確定收集部位中是否含有目標(biāo)蛋白或目標(biāo)蛋白是否得到了富集，這時就需要運用更特異的分析方法，如Westernblotting就可以從復(fù)雜的混合物中描述蛋白的分子量，并對蛋白進(jìn)行定量。另外當(dāng)一些蛋白沒有方便可用的生物學(xué)活性測定方法，或者由于干擾物質(zhì)的存在不能測活，可應(yīng)用一些免疫學(xué)的方法進(jìn)行檢測。在純化的過程中，需要監(jiān)測以下幾個參數(shù)：總的樣品體積，樣品中總的蛋白，目標(biāo)蛋白的活性單位，通過這些基本的信息，就可以跟蹤每步純化的效率，計算出目標(biāo)蛋白的回收率，目標(biāo)蛋白的比活性，以及純化的倍數(shù)，從而對純化的每一步，乃至整個流程進(jìn)行定量評價。Richard等在純化重組大腸桿菌RNA聚合酶σ32亞基的工作中給出了很好的范例，在定量測定項中，包括了蛋白質(zhì)的定量測定、定量SDS、定量蛋白質(zhì)斑點印跡和酶活測定，使用這些方法對操作的每一個階段取樣進(jìn)行純化效果的評價，從而確保每一步純化的有效性（1）。正是由于分析方法在分離純化中的指導(dǎo)性作用，所以有效的分析方法是分離純化是否能夠成功的前提。1.分離純化的方法策略及其應(yīng)用下游的分離純化步驟不僅要在可替換的分離技術(shù)間進(jìn)行選擇，如細(xì)胞的破碎可選擇高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎或酶溶法，分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、包涵體和沉淀物，可選擇離心或過濾，需要進(jìn)行濃縮的時候，可選擇沉淀或超濾；另一方面，設(shè)計的純化工藝包括特定的層析步驟，及層析的先后順序，以期得到最大的得率。吸附層析，如離子交換層析，疏水層析和親和層析，可基于特定的選擇性達(dá)到對目標(biāo)蛋白的純化，適用于大量樣品的處理。凝膠過濾層析用于后續(xù)的精制步驟，如去除少量的雜蛋白或聚合體，在純化過程中用于脫鹽和緩沖液交換。在分離純化中對每個步驟的選擇，可以遵循以下原則：1應(yīng)盡可能的利用蛋白質(zhì)的不同物理特性選擇所用的分離純化技術(shù)，而不是利用相同的技術(shù)進(jìn)行多次純化；2不同的蛋白質(zhì)在性質(zhì)上有很大的不同，這是能從復(fù)雜的混合物中純化出目標(biāo)蛋白的依據(jù)，每一步純化步驟應(yīng)當(dāng)充分利用目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)成分物理性質(zhì)的差異。所以在分離純化的開始階段，要盡可能的了解目標(biāo)蛋白的特性，不僅如此還要了解所存在雜質(zhì)成分的性質(zhì)，如大腸桿菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白（<50000Da），而且酸性蛋白較多；3在純化的早期階段要盡量減少處理的體積，方便后續(xù)的純化；4在純化的后期階段，再使用造價高的純化方法，這是因為處理的量和雜質(zhì)的量都已減少，有利于昂貴純化材料的重復(fù)使用，減少再生的復(fù)雜性（84）。在下游的純化工藝中為了提高蛋白的得率和處理的效率，應(yīng)當(dāng)使用最少的純化步驟，經(jīng)典的純化過程如圖1所示。在初始的純化階段，除了使目標(biāo)蛋白和細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA、多糖以及性質(zhì)差別較大的蛋白質(zhì)成分分離，采用的分離方法要能除去影響目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的雜質(zhì)，保護(hù)目標(biāo)蛋白不被蛋白酶降解，進(jìn)行目標(biāo)蛋白的捕獲和濃縮。在這一階段的純化中，鹽析沉淀仍然應(yīng)用，但共沉淀的雜質(zhì)常常很多，離子交換層析和疏水層析具有操作上的優(yōu)點，可以再生使用，成為這一步通常選用的層析方法；中間階段純化是最為關(guān)鍵的階段，這時要能達(dá)到和大量的雜蛋白分離，利用蛋白質(zhì)不同的性質(zhì)選擇不同的純化方法，每一步的方法要有足夠的選擇性，提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的純度；最后進(jìn)行精制純化，常用凝膠層析，使目標(biāo)蛋白的純度進(jìn)一步提高達(dá)到要求。對于包涵體蛋白質(zhì)，由于涉及包涵體蛋白質(zhì)的變復(fù)性，其純化步驟和方法與可溶性蛋白不同，需要對每一種包涵體蛋白質(zhì)建立相應(yīng)的復(fù)性方法，將在后面作介紹。圖1經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化流程圖在工業(yè)上，為了盡可能提高過程的通量和減少生產(chǎn)的成本，發(fā)展的方法與傳統(tǒng)的方法不同。雙水相萃取和擴(kuò)張床吸附技術(shù)，可以處理全細(xì)胞培養(yǎng)液，通過整合技術(shù)的使用，能達(dá)到萃取、濃縮和初步純化的目的。另外這兩種技術(shù)和親和相互作用結(jié)合可進(jìn)一步提高處理的選擇性。相似的，親和相互作用還可以整合進(jìn)其它的高通量處理，如親和膜過濾和親和沉淀（2）。生產(chǎn)上使用的非線性色譜，如置換色譜，一次層析的載量很大，得到的蛋白純度很高，近年來也有很大的發(fā)展和應(yīng)用（85,36）。2.1包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性在過去幾十年的發(fā)展過程中，重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白提供了新的途徑，盡管有不同的宿主系統(tǒng)可供選擇，如果翻譯后修飾不是蛋白質(zhì)功能所必需的話，大腸桿菌和其它的原核宿主系統(tǒng)仍然是生產(chǎn)重組蛋白的首選(17)。細(xì)菌如大腸桿菌可以在短時間里得到高水平表達(dá)的蛋白質(zhì)，但同時表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成非活性的包涵體。包涵體的形成是一個由許多蛋白質(zhì)參與的極端復(fù)雜的動力學(xué)過程，依賴于蛋白質(zhì)的折疊速率和聚集速率，并且與蛋白質(zhì)的合成和降解程度相關(guān)（35）。強(qiáng)的表達(dá)系統(tǒng)，高的誘導(dǎo)劑濃度，相對較高的培養(yǎng)溫度常常造成包涵體的形成。除了外界因素，包涵體的形成依賴于蛋白質(zhì)特異的折疊行為，而不是蛋白的通常特性，如大小，融合標(biāo)簽，相對的疏水性。盡管如此，限制折疊速率的結(jié)構(gòu)特性，如二硫鍵的形成常常是含有二硫鍵蛋白質(zhì)正確折疊的限速步驟（并不絕對，因為有些蛋白質(zhì)二硫鍵的破壞并不影響其功能），富含二硫鍵的蛋白質(zhì)具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，當(dāng)高水平表達(dá)時，由于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)是一個偏還原性的環(huán)境，蛋白質(zhì)容易形成錯配的二硫鍵，這常常是包涵體形成的主要原因。膜蛋白具有暴露的疏水區(qū)，表達(dá)時易于聚集形成包涵體，也有可能由于降解或?qū)?xì)胞的毒性作用使得表達(dá)水平極低（45）。蛋白質(zhì)的糖基化可以影響到蛋白質(zhì)的折疊行為和溶解性，當(dāng)它們在原核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)時，也容易聚集（4）。蛋白質(zhì)進(jìn)行可溶性表達(dá)和表達(dá)形成包涵體各有利弊，對許多蛋白，再折疊很困難，或者不可能，進(jìn)行可溶性的表達(dá)就是首選?，F(xiàn)在發(fā)展了許多方法減少包涵體的形成，如使用中等強(qiáng)度或弱的啟動子，低溫培養(yǎng)，有限的誘導(dǎo)，優(yōu)化培養(yǎng)基條件，進(jìn)行融合表達(dá)(49)，與伴侶分子和折疊酶共表達(dá)(3,5)，表達(dá)定位于不同的空間(7,58)，選擇突變的菌株（6,43）或其他的原核表達(dá)系統(tǒng)(34)。由于影響蛋白質(zhì)細(xì)胞合成和折疊的因素太多，優(yōu)化結(jié)果不可預(yù)測，如對于抗體Fab片段，盡管只有可變區(qū)序列不同，也不能預(yù)測新的Fab片段在體內(nèi)是否可以正確折疊（4），所以即使采用了促進(jìn)可溶性表達(dá)的方法，也不能保證不形成包涵體。從另一方面來講形成的包涵體易于和細(xì)胞的其它成分分離，而且過量表達(dá)的目標(biāo)蛋白在包涵體中得到了富集，提高了純度，降低了分離純化的難度。所以如果包涵體蛋白可以進(jìn)行體外的正確折疊，那么形成包涵體就可以接受，對易受細(xì)菌蛋白酶降解的蛋白質(zhì)或?qū)?xì)菌有毒性的蛋白質(zhì)來說，表達(dá)產(chǎn)生包涵體是絕對必要的。內(nèi)皮抑素（endostatin）可以特異性的抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有抑制新生血管生成和抑制腫瘤生長的作用，已進(jìn)入臨床研究階段。采用酵母表達(dá)系統(tǒng)，可直接產(chǎn)生具有活性的蛋白質(zhì)，但是表達(dá)的水平和蛋白質(zhì)的回收率較低，采用大腸桿菌表達(dá)則形成包涵體，包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性非常困難，改善蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性具有實際的應(yīng)用意義。通過對內(nèi)皮抑素折疊機(jī)制的研究表明，緊密折疊的內(nèi)皮抑素對酸耐受，在酸性條件下有可能得到大量的正確折疊的蛋白質(zhì)（15）。所以如果對于包涵體蛋白質(zhì)，通過機(jī)制的研究，能夠解決折疊復(fù)性的問題，那么利用包涵體的高水平表達(dá)，就可以得到大量的蛋白質(zhì)，降低生產(chǎn)的成本。在包涵體蛋白質(zhì)的變復(fù)性中，不管是采用什么方法進(jìn)行折疊，都要用變性劑溶解包涵體，最終又都要去除變性劑，理解變性劑對蛋白質(zhì)的影響可以指導(dǎo)我們設(shè)計復(fù)性過程。圖2：在各種變性劑濃度條件下蛋白質(zhì)的溶解性和構(gòu)象。價如圖川2趴所示，隨著紀(jì)變性劑濃度體的變化，不稠僅具有天然融構(gòu)象狀態(tài)蛋標(biāo)白質(zhì)的比率嘆在改變，而矮且蛋白質(zhì)的敏溶解性也在告改變。在高敲的變性劑濃園度條件下，拜蛋白質(zhì)的極標(biāo)性和非極性叉?zhèn)孺湺际强牲h溶的，但是盆蛋白質(zhì)卻是太去折疊的，明如圖香2毛中快d騎所標(biāo)的區(qū)段霸。在低的變?nèi)鹦詣舛葪l辛件下，如圖選2名中鴨a臭區(qū)段所示，傘天然構(gòu)象的宴蛋白質(zhì)是穩(wěn)僵定的，但也撓會穩(wěn)定部分億折疊的中間暗體，這些部據(jù)分折疊的協(xié)中間體兵易于自我締修合形成沉淀貌。所以選擇逢b帳區(qū)段所在的販變性劑濃度助來進(jìn)行蛋白謎質(zhì)的折疊更秩為有效，這思一區(qū)段即可液以穩(wěn)定蛋白慈質(zhì)的天然構(gòu)聞象，而且可冰以增加天然廢構(gòu)象蛋白質(zhì)掃的溶解性，薦對于部分折賤疊的葉中間體趟卻沒有穩(wěn)定己作用。避免桿選擇震c弓區(qū)段所在的將條件進(jìn)行折慰疊，因為這倡一區(qū)段天然爭和變性的蛋三白質(zhì)都只有汁有限的溶解端性，折疊速款度也很慢（便13車）。這一圖纖示所展示的謎規(guī)律對所有倚蛋白并不是鑰統(tǒng)一的，但聯(lián)它向我們描窗述了一個大撒概的情況，碑在這一過程狠，不僅僅要墊考慮變性劑字對天然構(gòu)象臺和折疊套中間體雄的穩(wěn)定作用溉，還要考慮躺對蛋白溶解冠性的影響?？s在高的變性離劑濃度，蛋并白質(zhì)是去折傷疊的，充分研溶劑化的，財柔性的，在神折疊緩沖溶吉液中，蛋白尤質(zhì)是折疊的壽，具有剛性守的，將蛋白健質(zhì)從高變性耳劑濃度條件鍛變?yōu)檎郫B緩精沖溶液，就門會使蛋白質(zhì)孕坍塌形成緊顏湊的結(jié)構(gòu)，求但蛋白的這禾一過程不總攀能有效進(jìn)行艱，常常存在售錯誤折疊和再聚集，所以冰在包涵體的萍變復(fù)性過程弄中，除了要給控制上面所準(zhǔn)講的參數(shù)，霸還有兩方面饞的參數(shù)需要凱控制，一是臭應(yīng)用添加劑蘆，來促進(jìn)折蓬疊、減少聚輛集，二是控勉制溶液的氧蟲化還原狀態(tài)創(chuàng)促進(jìn)二硫鍵糠的正確配對野。悠通常從包涵櫻體中回收活娃性蛋白質(zhì)包搬括三個步驟丘：包涵體的息分離和洗滌克，包涵體蛋至白質(zhì)的溶解奏和溶解蛋白顧質(zhì)的再折疊箭。前兩個步喚驟效率較高縣，但是再折塞疊的效率率英常常不能令螺人滿意，折捎疊的方法和訴折疊的條件濫需要通過實小驗來進(jìn)行篩竟選。失第謹(jǐn)?shù)鞍踪|(zhì)折疊蔑的過程和機(jī)猜理搜對蛋白質(zhì)折降疊機(jī)理的研際究，對保留休蛋白質(zhì)活性挪，維持蛋白忌質(zhì)穩(wěn)定性和后包涵體蛋白出質(zhì)折疊復(fù)性仗都具有重要哭的意義肝(21)侮。早在上世揀紀(jì)寒30釘年代，我國鼠生化界先驅(qū)直吳憲教授就壓對蛋白質(zhì)的軟變性作用進(jìn)綢行了闡釋（釘8傘），娘30泛年后，歌Anfin起sen搭通過對核糖匯核酸酶粉A脾的經(jīng)典研究略表明去折疊方的蛋白質(zhì)在皂體外可以自宇發(fā)的進(jìn)行再咸折疊，僅僅互是序列本身管已經(jīng)包括了躲蛋白質(zhì)正確常折疊的所有穿信息（家9,10攜），并提出贈蛋白質(zhì)折疊家的熱力學(xué)假匪說，為此挺Anfin末sen沫獲得療1972嫌年諾貝爾化走學(xué)獎。這一套理論有兩個每關(guān)鍵點：富1裹蛋白質(zhì)的狀材態(tài)處于去折柳疊和天然構(gòu)勞象的平衡中兇；則2強(qiáng)天饞摩然構(gòu)象的蛋未白質(zhì)處于熱伴力學(xué)最低的慌能量狀態(tài)。譜盡管蛋白質(zhì)爸的氨基酸序園列在蛋白質(zhì)測的正確折疊暑中起著核心誘的作用，各鴿種各樣的因賄素，包括信啊號序列，輔州助因子，分單子伴百亭侶，環(huán)境條德件，均會影銜響蛋白質(zhì)的敵折疊，新生鮮蛋白質(zhì)折疊積并組裝成有躲功能的蛋白薄質(zhì)，并非都腥是自發(fā)的，壽在多數(shù)情況捎下是需要其懸它蛋白質(zhì)的珠幫助，已經(jīng)偏鑒定了許多珍參與姑帆蛋白質(zhì)折疊皂的折疊酶和片分子伴侶（欣3,16,掌86叼），油逼蛋白質(zhì)子“違自發(fā)折疊疤”匯的經(jīng)典概念艷發(fā)生了轉(zhuǎn)變吸和更新，但乏這并不與折追疊的熱力學(xué)漂假說相矛盾云，而是在動槽力學(xué)上完善咬了熱力學(xué)觀蓮點。在蛋白瓣質(zhì)的折疊過們程中，有許山多作用挺尺力參與，包蠟括一些構(gòu)象到的空間阻礙眾，范德華力伶，氫鍵的相清互作用，疏武水效應(yīng)，離浙子相互作用沉，多肽和周禍圍溶劑相互浙作用產(chǎn)生的職熵驅(qū)動的折畫疊（乓12,52背），但對于揮蛋白質(zhì)獲得張?zhí)烊唤Y(jié)構(gòu)這鉗一復(fù)雜過程王的特異性，候我們還知之苗甚少，許多友實驗和理論篩的工作都在架加深我們對粒折疊的認(rèn)識摩，但是問題驅(qū)仍然沒有解水決。唱在折疊的機(jī)付制研究上早泄期的理論認(rèn)竟為，折疊是社從變性狀態(tài)替通過中間狀佳態(tài)到天然狀爭態(tài)的一個逐勵步的過程，領(lǐng)并對折疊中漲間體進(jìn)行了葡深入研究，詳認(rèn)為折疊是剩在熱力學(xué)驅(qū)睬動下按單一回的途徑進(jìn)行烘的。后來的位研究表明折暈疊過程存在跪?qū)嶒灴蓽y的議多種鄰中間體獅，折疊通過灶有限的路徑值進(jìn)行。新的贏理論強(qiáng)調(diào)在餐折疊的初始魯階段存在多媽樣性，蛋白歸質(zhì)通過許多途的途徑進(jìn)入蜜折疊漏斗（男foldi嚇ngfu池nnel獄），從而折盲疊在整體上串被描述成一擦個漏斗樣的頸圖像，折疊老的動力學(xué)過厚程被認(rèn)為是漆部分折疊的洽蛋白質(zhì)整體痕上的進(jìn)行性穴裝配，并且椒伴隨有自由款能和熵的變輸化，蛋白質(zhì)倍最終尋找到葛自己的正確長的折疊結(jié)構(gòu)架，這一理論捎稱為能量圖尋景（塑energ晃ylan鑄dscap藏e這），如圖姜3種所示，漏斗疾下方的凹凸色反映蛋白質(zhì)伶構(gòu)象瞬間進(jìn)狐入局部自由稠能最小區(qū)域纖(13,1換4)清。濾圖燦3戰(zhàn)：能量圖景盒（依Thee疼nergy吵land鴨scape偏）的示意圖伏，高度代表圍能量尺度，果寬度代表構(gòu)誰象尺度，在云漏斗（甚funne鑰l晴）的下方存悲在別的低能父量狀態(tài)，共詢存的不同能聾量狀態(tài)的蛋性白質(zhì)種類也秘降到最小勢(14)氏。美這一理論認(rèn)要為結(jié)構(gòu)同源冬的蛋白質(zhì)可座以通過不同掉的折疊途徑送形成相似的春天然構(gòu)象，束人酸性成纖松維生長因子代（析hFGF-涌1救）和蠑螈酸庸性成纖維生劫長因子（薯nFGF-停1淹）氨基酸序式列具有約哨80%披同源性，并馳且具有結(jié)構(gòu)腸同源性（階12業(yè)個亦β犯折疊反向平易行排列形成稅β度折疊桶），澇在鹽酸胍誘睛導(dǎo)去折疊的朵過程中，菊hFGF-補(bǔ)1訊可以監(jiān)測到哭具有熔球體起樣的折疊鉆中間體饑，而桂nFGF-破1飼經(jīng)由兩態(tài)（藍(lán)天然狀態(tài)到急變性狀態(tài)）其去折疊，沒攜有檢測到抱中間體直的存在，折薦疊的動力學(xué)乓研究也表明灰兩種蛋白采都用不同的折賄疊機(jī)制（場38懲）。對于同振一蛋白質(zhì)，虛采用的滲透麥壓調(diào)節(jié)劑（完osmol拿ytes習(xí)）不同，蛋蠻白質(zhì)折疊的猛途徑也不相增同，說明不編同的滲透壓蹈調(diào)節(jié)劑對蛋險白質(zhì)的穩(wěn)定隊效應(yīng)不同（絨11肅）。這兩個蜂例子都說明罩折疊機(jī)制的菠復(fù)雜性，也戒與上面所介榮紹的理論相支吻合。富炭堂經(jīng)包涵體的分駐離和溶解蝕分奪收離包涵體的紹第一步是對支細(xì)菌進(jìn)行最吐大限度的溶谷解，將幾種攏細(xì)胞破碎技珠術(shù)相結(jié)合，境如聯(lián)合使用裂溶菌酶處理扁，高壓勻漿桃細(xì)胞破碎和伍含表面活性劍劑的高鹽溶爹液處理，可索以使柄限膜碎片和細(xì)想胞壁碎片最海大限度的分稅解。細(xì)胞破砌碎后，通過境離心的方法趣可以很方便企的回收包涵馬體，再用洗走滌液（通常膨含有低濃度競的變性劑，哨表面活性劑競，還原劑，盒EDTA鑄）對包涵體顧進(jìn)行清洗，愧就可以得到塌較純的包涵陽體（狂4射，析74吵）。通常要郵選用強(qiáng)的變柄性劑使蛋白符質(zhì)完全變性村溶解，如腦6M浩的鹽酸胍和能8M犬的尿素，蛋殘白質(zhì)濃度多峰采用比1-10m辦g/ml蝕（議22蹄）。由于鹽烏酸胍溶解包貍涵體蛋白質(zhì)譯能力比尿素趨強(qiáng)，而且尿唉素中的異氰班酸酯可以使筐自由氨基氨刮甲?；ㄟ@逃種作用在堿葬性條件下表攻現(xiàn)的更強(qiáng)）程，所以常常閉首選鹽酸胍浮作為解離劑方。對含有分勸子間二硫鍵柳或非天然二蠟硫鍵的包涵會體蛋白質(zhì)，需在溶解過程掛中需要加入德還原劑，如挨二硫蘇糖醇鴉，廚β奧-冠巰基乙醇，藥還原型谷胱薪甘肽，加入嶼螯和劑，如鬼EDTA王，可以防止法金屬催化的豐半胱氨酸氧胞化。除此之嗚外，改變茄pH叮和使用表面但活性劑也被宗用于溶解包殺涵體蛋白質(zhì)新（域22剩），相對而冬言，這兩種城方法的應(yīng)用復(fù)較少，而且捏只有具有正顆確二硫鍵的熱包涵體蛋白決質(zhì)才可以用絡(luò)表面活性劑染進(jìn)行溶解，蝕否則可同時顫形成正確的繞和非正確的鍵二硫鍵，表貍明用尿素、緩鹽酸胍變性榆和用表面活澡性劑變性對辯蛋白質(zhì)的結(jié)身構(gòu)和動力學(xué)忙有不同的影哥響，責(zé)Tsumo別to桑在這方面做芽了詳細(xì)的論贈述（病25效）。獄Panda劣等在高歇pH撐條件下使用宵低濃度的尿業(yè)素溶解包涵勒體蛋白質(zhì)，摸用于重組牛交生長激素、拋重組人生長幫激素和獼猴英透明帶糖蛋芽白的變復(fù)性特，認(rèn)為在變筋性時蛋白質(zhì)異所保留的天顯然二級結(jié)構(gòu)較有助于蛋白奏的折疊，減鐮少蛋白質(zhì)的賭聚集。但采沙用的高歪pH餓條件可以使咸氨基酸殘基勿發(fā)生化學(xué)修臘飾，還需要土更多的驗證脅（柜73唱）。液以上變性的紐方法屬于化洋學(xué)變性，使傳用高的靜力拜壓提供了蛋帥白質(zhì)變性的賠另外一種物燕理變性方法脾，靜力壓促撫進(jìn)蛋白質(zhì)變聰性解離，是暑因為蛋白質(zhì)得在變性條件過下，系統(tǒng)整磁體趨向于更霞小的體積。何聯(lián)合使用高執(zhí)壓和低濃度養(yǎng)的變性劑已父用于包涵體壺蛋白質(zhì)和蛋綠白質(zhì)聚集體榮的變性，是手一種有前景前的變性方法凳（詞31,83披)笨。握擔(dān)婚溶解后包涵蝕體蛋白質(zhì)的服折疊復(fù)性潮蛋白質(zhì)分子春變性后，通窮過改變折疊團(tuán)的條件使蛋敢白質(zhì)恢復(fù)其樹天然構(gòu)象的善過程，稱為抗復(fù)性。已經(jīng)浪發(fā)展了很多撿的方法用于陽包涵體的折釀疊復(fù)性，但貞是這些方法奔的結(jié)果并不叨可預(yù)測，每腫一種方法都濕需要對各種岸實驗條件，薦如變性劑濃踐度、穿pH諒、溫度、蛋兩白質(zhì)濃度、飽離子強(qiáng)度、舟添加劑的濃哀度，進(jìn)行優(yōu)頂化選擇。通籃常包涵體在緞變性溶解后輩具有高的純絮度，可以直可接進(jìn)行復(fù)性鞭。但由于包告涵體還含有煤其它的細(xì)胞炭成分，如膜賠蛋白、磷脂款、核酸，可潔能影響蛋白守質(zhì)的復(fù)性（女53,54至），為了進(jìn)泉一步提高純委度，有些研故究工作在包均涵體變性后閣先進(jìn)行蛋白渠的純化，如掘親和層析（豪47,55舞,57,6肉0,63,漫64,65撞,68揭）、離子交碑換層析（愿47,56句）、凝膠過摧濾層析、反沃相層析（燒62疏），再進(jìn)行岸變性蛋白質(zhì)休的復(fù)性，層趟析在變性條浙件下應(yīng)用為成這一策略提扇供了技術(shù)支禾持。單為了控制折學(xué)疊、錯誤折午疊和聚集的暗速率，一種走方法是降低索變性劑的濃停度，降低的特速度和操作躬的時間都決脾定折疊的效撓率。另一種灰方法就是加碑入添加劑來頁減少聚集，嗽促進(jìn)折疊，僑如阿L-聾精氨酸，鹽尺，有機(jī)溶劑桂，一些表面?；钚詣?，滲犬透壓調(diào)節(jié)劑雪（蜓osmol饑ytes鄉(xiāng)），硫代甜績菜堿類物質(zhì)獻(xiàn)（因NDSBs頌），這些物匠質(zhì)或穩(wěn)定蛋狂白質(zhì)的天然盟構(gòu)象，或使右部分折疊的加中間體娃不穩(wěn)定，表凈2誠列出了這些裹化合物和它兆們可能的作率用機(jī)制，它均們在蛋白質(zhì)監(jiān)的折疊中起港著重要的作頁用，已得到允廣泛的應(yīng)用文（巾13,25隸,32,4崖,74由），但對于而其中的好些阻化合物參與碰折疊的作用影機(jī)制我們還彎了解不多。南表霸2互增加蛋白質(zhì)翻折疊的添加鍵劑構(gòu)添加劑退可能的作用移機(jī)制草甘油抵對蛋白質(zhì)具貸有優(yōu)先的水合合作用添/杜增加黏度貿(mào)L-扁精氨酸吐兩親分子禿/波滲壓劑林甘氨酰甜菜霜堿唇/坑山梨糖醇想對蛋白質(zhì)具弄有優(yōu)先的水捷合作用攤阿拉伯聚糖理增加黏度稼木糖醇引增加黏度灑乙醇點調(diào)節(jié)極性蘭DMSO覽調(diào)節(jié)極性峰兩性離子表掛面活性劑（皇Zwitt嶄erion駐icde回terge耀nts縫）哥保護(hù)非極性精表面香Trito獎nX-1促00慶保護(hù)非極性暖表面洋硫代甜菜堿蟲類物質(zhì)（哥NDSBs李）此保護(hù)非極性趣表面籮蔗糖學(xué)/竄海藻糖索對蛋白質(zhì)具岡有優(yōu)先的水品合作用絨/州增加黏度太N-巧氧化三甲胺卵（盛TMAO飼）扁對蛋白質(zhì)具衡有優(yōu)先的水巖合作用誦/怪滲壓劑藏三氟乙醇（椅TFE旅）深促進(jìn)二級結(jié)欠構(gòu)的形成萌低濃度鹽酸闖胍偉使部分折疊遮的肢中間體豎不穩(wěn)定臉/泉增加天然構(gòu)避象蛋白質(zhì)的稈溶解性擇低濃度尿素女使部分折疊炊的王中間體則不穩(wěn)定困/塊增加天然構(gòu)惡象蛋白質(zhì)的功溶解性突配體把穩(wěn)定天然結(jié)催構(gòu)狀態(tài)巷聚乙二醇仿保護(hù)熔球體腿（晃molte氧nglo睛bule胸）柿/牽增加黏度喘在折疊過程耗中另一個關(guān)枕鍵的問題是擋正確二硫鍵交的形成，一稀旦形成了錯喉誤的二硫鍵思，就不能再鄰折疊形成正盼確的結(jié)構(gòu)，蕉所以在折疊絕時不僅要氧灣化促進(jìn)二硫蘇鍵的形成，國還要加入還熟原劑促進(jìn)二恥硫鍵改組（暮disul破fide-網(wǎng)bond跨reshu國fflin跪g忌），使蛋白屯質(zhì)最終折疊扔成正確的結(jié)余構(gòu)。常用的李方法有：海1詞使用金屬催快化的空氣氧捆化，并添加恒還原劑促進(jìn)孔二硫鍵改組汗，由于氧在舍蛋白質(zhì)溶液脂中溶解性低膀，這種方法朽的效率較低堪，改用攪拌授促進(jìn)氧的質(zhì)敗量傳輸，又追會造成蛋白犁質(zhì)的聚集；創(chuàng)2歡使用小分子項還原型和氧犯化型的巰基撲試劑滔對，包括還譜原型和氧化壟型的谷胱甘唐肽（辯GSH/G碗SSG穗）、半胱氨撕酸和胱氨酸遵（使cyste勁ine/c壺ystin鈔e謠）、半胱胺煮和胱胺（池cyste寺amine款/cyst迎amine撥）、二硫蘇居糖醇和氧化碎型谷胱甘肽疤（低DTT/G村SSG在），二流赤淋蘚糖醇和氧廁化型谷胱甘舒肽（腸DTE/G炎SSG佩），這一方謠法是目前常售用的方法，修通常使用的古巰基界試劑營總濃度為阿5-15m莖M饒，還原劑和賠氧化劑的比段為巷5:1昏―籍1:1堡（訓(xùn)4,74疏）。洲3政在復(fù)性前將鉗巰基保護(hù)起筋來，有兩種蜜方法可以選廈擇，一是通凈過谷胱甘肽丸和蛋白的半腔胱氨酸殘基茅形成二硫鍵悶來保護(hù)巰基媽，二是進(jìn)行泉半胱氨酸磺惜酸化，從而砍減少復(fù)性過釋程中不正確救的二硫鍵的撿形成，復(fù)性陳后再加入還飄原劑使形成倒正確二硫鍵船。人組織纖絡(luò)溶酶原激活使劑（代t-PA肝）含有扶35徹個半胱氨酸澆殘基，可形另成蠶17定對二硫鍵，慧即使在天然強(qiáng)狀態(tài)下也只起具有低的溶康解性，進(jìn)行花原核表達(dá)時右這兩種巰基詢保護(hù)方法都藝被用于該蛋薦白質(zhì)的折疊掘復(fù)性，由于媽在蛋白質(zhì)的亂巰基上引入能了帶電荷的屈殘基，增加椒了變性蛋白義和部分折疊續(xù)中間體懶的溶解性，畏減少了復(fù)性泰過程中蛋白李質(zhì)的聚集，六可獲得較高菊的復(fù)性效率讓（壯25,32溫,33像）。人絨毛呢膜促性腺激筐素登β襲亞基（木hCGβ）配含有12個靠半胱氨酸殘般基，如果不弟進(jìn)行巰基保綢護(hù)，在折疊報復(fù)性中會形鋪成寡聚體和旨大量沉淀，畢變性蛋白質(zhì)津磺酸化后再與折疊復(fù)性可紛形成幾乎1尊00%單體族蛋白壽，同時提高膨了得率和純貍度（無37皮）。此外，材在前胰島素出的折疊復(fù)性偉中也應(yīng)用了依磺酸化保護(hù)趕（西44,47茅,48稻），所以這互一方法在進(jìn)噸行復(fù)雜蛋白驕的變復(fù)性時絞可以采用。戶扒.1赴稀釋復(fù)性和短透析復(fù)性謹(jǐn)用折疊緩沖框液快速稀釋響溶解的包涵佩體蛋白質(zhì)溶券液，達(dá)到降右低變性劑濃筍度的目的，否使去折疊的括蛋白質(zhì)進(jìn)行殘再折疊，就格是稀釋復(fù)性疏。為了很快惱避開低溶解能性變性劑區(qū)儀（如圖顏2癥中肚c燥區(qū)執(zhí)槳段所示），叮減少蛋白的狐聚集，在進(jìn)砍行稀釋時一刻定要快速。閥折疊進(jìn)行時償?shù)牡鞍踪|(zhì)濃瘦度是體外折墓疊成功的關(guān)養(yǎng)鍵，理想的唯情況是希望撲折疊在高濃姥度的條件下紡進(jìn)行，但是躺在高栗躲濃度的條件南下變性劑的組稀釋常常造各成去折疊和區(qū)部分折疊蛋集白質(zhì)的聚集息。對于折疊默，是一個一扭級的反應(yīng)過暴程，而聚集藝是一個高級宰的反應(yīng)過程齒，依賴蛋白拒質(zhì)的濃度，負(fù)所以澆卸需要小心的團(tuán)選擇蛋白質(zhì)惰的濃度，一碌般的蛋白質(zhì)肌的終濃度保佳持在尊20-50渣μ足g/mL閱。憶透析的方法溜不顯著的改鑼變?nèi)芤旱捏w然積，但時間宋較長，而且牛易形成蛋白減質(zhì)沉淀，所陶以透析起始秧的蛋白質(zhì)濃繁度非常關(guān)鍵某，而且僅對栽一些蛋白質(zhì)剃有效。變性必劑濃度的降冰低也可以分銳階段的進(jìn)行澡，或先經(jīng)過云稀釋，再透扣析去除剩余粉的變性劑，攏由于變性劑俯的濃度在開申始時先降到呆一定的水平嘩，增加了部啄分折疊裁中間體泛的溶解性，順常?？梢蕴犷w高折疊的效堡率，但是必傷須通過實驗并選擇在不同群階段使用的羊變性劑濃度憲，避開圖桃2婚所示的怒c鬼區(qū)段。除了凳要考慮降低誠變性劑的濃賢度，還要考燒慮每一階段艇的氧化還原錄狀態(tài)，以及套溫度、添加送劑等因素。等在胰凝乳蛋漏白酶原的折蜜疊復(fù)性中，凡如果鹽酸胍脾稀釋的濃度拍低于據(jù)0.5M泛或高于罷3M作都會造成大餡量的沉淀，勾在菜2.5M營濃度時有一乓半的蛋白質(zhì)韻沒有正確折申疊，而在甜1M牙時則完全折燙疊，說明折廁疊時的變性壯劑并不是越松低越好，而修是存在一個磚最佳濃度（眾13鹿）。腎Tsumo咬to狂等通過分階校段透析進(jìn)行部了單鏈兵抗體鉆Fv浸段包涵體的帥折疊復(fù)性，寺在吩1M姐鹽酸胍透析沿時加入氧化富型谷胱甘肽瞧和貓L-偷精氨酸可以鋪使正確折疊六蛋白的得率國達(dá)到巧95%儉以上（舉40秒），進(jìn)一步舟研究表明在脅1M址鹽酸胍條件判下蛋白質(zhì)所點具有的結(jié)構(gòu)飛使得自由巰雙基容易形成伶正確的二硫吼鍵，加入氧獵化型谷胱甘逆肽的作用是卵加速了蛋白枝質(zhì)的正確折辨疊、抑制蛋洲白質(zhì)的聚集寧，而倉L-嬸精氨酸起的漲作用是穩(wěn)定貫部分折疊的捐中間體錯使其不發(fā)生詢聚集，所以睛同時加入氧翁化型谷胱甘羞肽和味L-結(jié)精氨酸可以船將蛋白質(zhì)的建聚集降到最耍低的程度（錫41彈）。這個研鉗究小組用相班同的方法進(jìn)交行白介素羅-12浪包涵體的折宗疊復(fù)性，僅庸加入氧化型嬌谷胱甘肽而脾沒有還原型純谷胱甘肽只闊有約圈57%透的折疊效率僑，當(dāng)兩者同滅時加入后則販可達(dá)到聯(lián)90%葬（洪42所），這些結(jié)診果表明前一務(wù)種蛋白比較毫容易形成正撈確的二硫鍵恐，而白介素慢-12籌折疊復(fù)性需宿要加入還原借型的谷胱甘叼肽促進(jìn)二硫驕鍵重組，使壘蛋白質(zhì)最終步選擇天然的微二硫鍵，并唯促進(jìn)折疊。繭另一種策略態(tài)是將變性蛋憐白分成幾份扇按一定的時異間間隔逐步祥加入折疊緩攔沖液中，可摧以減少處理馳的體積、改蔑善折疊的效箭率（需35報）。企Arora梨等將這一方迫法用于人羊γ競干擾素的復(fù)姥性，當(dāng)添加爸0.5M勁的唇L-江精氨酸可以苦使產(chǎn)率提高團(tuán)十倍，產(chǎn)品認(rèn)的得率和比墳活比文獻(xiàn)報獲道的都要高液（踢72預(yù)）。障在貿(mào)欣已經(jīng)發(fā)展的富復(fù)性方法中特，稀釋復(fù)性兩仍然是應(yīng)用豎最多的方法傷，但在放大陡時會因為處債理體積太大挪造成成本太鋼高。溶解復(fù)淹性獲得的蛋泥白質(zhì)，需要緊通過離心和璃過濾的方法朋去除純惡不溶性的物他質(zhì)，再按可響溶性蛋白質(zhì)器的處理方法講進(jìn)行下游的藏分離純化。惕擴(kuò)張床吸附軌技術(shù)可以處窩理大量的樣蔑品，而且分罵離的效能不蒙受聚集蛋白院質(zhì)的影響，亂Ferre渴等將蛋白質(zhì)惕的稀釋折疊緒和擴(kuò)張床吸緣附捕獲技術(shù)叉相偶聯(lián)，使笛用窗STREA記MLINE凳TM待DEAE閱陰離子交換丹介質(zhì)，用于跟包涵體蛋白屈質(zhì)歪HAT-h很β嶺2凡m惰的分離純化蒙，可以得到在48%燦回收率和雪94%祥純度的復(fù)性羅蛋白（劑23賀）。跟

2.1.巷3.2蔬色譜復(fù)性爹色據(jù)吊譜方法不僅創(chuàng)在蛋白質(zhì)的獸純化中得到胸廣泛應(yīng)用，皺也成為包涵恒體蛋白質(zhì)復(fù)栗性的主要手獄段之一。色誠譜復(fù)性的方述法的優(yōu)點是盲可以顯著的茶減少處理的煎時間，減少然變復(fù)性過程決中分姓交子的聚集，吹使復(fù)性的同澆時也達(dá)到了校純化的效果恩。第一類型立的色譜復(fù)性猜就是凝膠過釀濾色譜復(fù)性澆，這一方法脾的原理在于遠(yuǎn)通過分子篩缸效應(yīng)可將蛋暈白質(zhì)和小分妄子的變性劑判分綿掌離，實現(xiàn)溶孔液交換和蛋才白質(zhì)的折疊違。復(fù)性折疊課中存在的一佳個問題就是本蛋白質(zhì)的聚匯集，為了減熊少導(dǎo)致蛋白賀質(zhì)聚集的分伯子間相互作含用，可將蛋獄白質(zhì)結(jié)合在占分離介質(zhì)上略，達(dá)倘邪到溶液中變錫性劑濃度的屠稀釋和蛋白賀質(zhì)的折疊，筒這一類型的建復(fù)性為吸附淡型色譜復(fù)性歲，包括親和徑色譜復(fù)性，瀉疏水相互作干用色譜復(fù)性晨，離子交換剖色譜復(fù)性。濁對于一些稀去釋法繡鉗難于折疊的墻蛋白質(zhì)，這煉一方法具有罷更好的效果指，如一些膜抽蛋白（綱24,50歉,71鋤）。在折疊妻中，吸附的口位點會影響非到折疊，所別以要優(yōu)化折訊疊的條件，抬才能得到好測的折疊效果逆。另一種方魂法是在介質(zhì)開上固定化伴談侶分子或折蓬疊酶，使層騰析柱成為一陵個折疊反應(yīng)擁器，固定化請的優(yōu)點是能揮夠回收使用炮，不會引入邀新的雜蛋白雞。逝A.狂凝膠過濾色烏譜復(fù)性睜凝膠過濾復(fù)調(diào)性時，變性洪蛋白質(zhì)加樣須于折疊緩沖同液平衡好的壘凝膠過濾柱紹上，然后用帆折疊緩沖液緒進(jìn)行洗脫，順凝膠過濾層仙析有不同的索分子量分級窗范圍，有助儀于聚集蛋白盲質(zhì)和正確折牛疊蛋白質(zhì)的纖分離。血小燃板衍生的生定長因子（站PDGF營）由兩個亞著基組成，慚M字ü稍ller幸等用雙順反探子表達(dá)載體弟同時表達(dá)等叛摩爾的劈A師鏈和追B型鏈，但以包筑涵體的形式摩存在，為了杜得到活性的壘異源二聚體何PDGF-跑AB銷，包涵體用嫁鹽酸胍變性么后，先在變宗性條件下用洪凝膠過濾層吸析進(jìn)行純化唉，使用稀釋膨復(fù)性，蛋白品質(zhì)嚴(yán)重聚集囑，即使在暮10瞞μ壘g/ml沖蛋白質(zhì)濃度粱條件下，也安只能得到懇45%濫可溶性蛋白仗，而用凝膠琴過濾復(fù)性，撒同時洗脫的凱A棗亞基和華B冰亞基可以緩歷慢二聚化產(chǎn)殲生異源二聚許體，蛋白質(zhì)懲以捏2.5mg明/ml醉濃度上樣伏,恨最終異源二套聚體得率可語達(dá)稠75%泳（燭26應(yīng)）。柳在似美凝膠過濾復(fù)白性中，發(fā)展珍了一種梯度柄復(fù)性的方法澇，這一方法狼的原理基于臭復(fù)性過程中睜，變性條件劃的快速改變覽加速了部分燒折疊蛋白質(zhì)遍的聚集，導(dǎo)糖致沉淀形成盈和非特異性徐的吸別夠附，通過梯死度洗脫逐步筍降低變性劑占的濃度，使音蛋白質(zhì)處于葉一個梯度改善變的變性劑趙條件下，控之制蛋白質(zhì)的焰折疊和聚集妨速度，使蛋敏白質(zhì)在離開餓層析柱時，慎處于折疊緩餓沖液掙掌中，從而改嘩善活性蛋白耕的回收率。墻通常選擇線紀(jì)性的梯度用呆于折疊復(fù)性烘，對于不同搬的蛋白質(zhì)還騙有其它的?？渴剑缫恍┡诺鞍自谔囟ü诘淖冃詣鈸P度范圍里不膜穩(wěn)定，在此這變性心棒劑濃度范圍恐里就需要快讓速降低變性鄙劑濃度。這渴一復(fù)性過程崗中，梯度在益上樣前就在禾層析柱中已工經(jīng)形成，上站樣后使用變輔性緩沖液進(jìn)尿行洗脫，由鐘于蛋白質(zhì)受眨到的分子排諸阻比番之變性劑大，握蛋白質(zhì)移動搜的速度比變伶性劑梯度移秩動的速度快泄，最終蛋白善質(zhì)通過整個游變性劑區(qū)，久離開層析柱巷時處于折疊其緩沖液中。兆通過尿素線兆性梯度復(fù)性道，變性溶菌央酶以笨壓高蛋白濃度掌上樣（字17mg/譯ml彩）可以獲得烤90%墳的活性回收泰率，與稀釋清復(fù)性和非梯莊度凝膠過濾表復(fù)性相比較中，顯著的改甲善了活性回悔收率（妖27交）。對單鏈樸Fv瑞片段包涵體佩蛋白，使用違梯度同時改閱變變性劑濃治度和緣pH薯，比單改變暗變性劑濃度湖的梯度復(fù)性姿或不使用梯斗度的凝膠過集濾復(fù)性具有昏更高的活性徹得率（擔(dān)28預(yù)）。另外應(yīng)棋用連續(xù)環(huán)形囑色譜，蛋白賞樣品連續(xù)上酒樣于旋轉(zhuǎn)的賞色譜柱上，陵在提高折疊昏效率的同時繳，也提高了定色譜復(fù)性處陶理的能力（面29,30迫）。買B.殲吸附型色譜服復(fù)性芽吸泡尊附型色譜復(fù)扎性是在變性潮條件下，利她用變性蛋白欲質(zhì)可瞬間結(jié)畜合在特定層糠析介質(zhì)上的租特性，進(jìn)行夕緩沖液的交竹換，降低變號性劑的濃度今，可先改變邀變性劑濃度絹使吸附的蛋明白質(zhì)妥占逐漸的折疊懂復(fù)性，在柱義中的變性劑項溶液完全被東置換成折疊破緩沖液后，食再通過在折諸疊緩沖液中度加入鹽或其鏈它添加劑進(jìn)咬行原位純化賽洗脫，為了至獲得好的折飽疊效率和純緞化效役濃率，常采用謊梯度洗脫或熟階段洗脫的管方法。由于澆蛋白質(zhì)結(jié)合銷在固相介質(zhì)繞上，減少了紗折疊過程中叛由于分子間煌相互作用所芬造成的聚集傾，所以這一國方法可提高怒折疊的效率族。在上怠變性條件下衣，蛋白質(zhì)能陷否進(jìn)行離子用交換色譜復(fù)膜性和疏水色琴譜復(fù)性，與伙蛋白質(zhì)的理喇化性質(zhì)密切櫻相關(guān)，僅有信有限的報道口（汪36醉），而給蛋將白質(zhì)加上一獨個親和標(biāo)簽殲，表達(dá)得到擱的包涵體再掛用親和色譜蚊復(fù)性對不同移的蛋白質(zhì)有堆一定的通用慕性，應(yīng)用也某更為廣泛，驚尤其是金屬示螯合親和色熊譜復(fù)性。嘗多肽通過在滅N做端或煎C雜端加上一個睛親和標(biāo)簽，貴在包涵體的岡純化上有兩搶個方面的用犬途，其一是糠包涵體變性謠溶解后，利撕用親和色譜卸直接進(jìn)行包乏涵體溶液的旋純化，再用上稀釋或透析遞的方法進(jìn)行敞復(fù)性哈(55,5館7,60,百64,65善,68)中，其二就是膏用于親和色碰譜復(fù)性凳(61,6暖6,67,喬69,70暗)脆。由于蛋白壤質(zhì)或肽類標(biāo)偏簽在變性條魂件大多失去推了與親和介襪質(zhì)結(jié)合的特狡性，目前這源一技術(shù)用的眉最多的是組思氨酸標(biāo)簽。庸Zahn貍等在鎳親和憲層析柱（胡Ni-NT懸Aarg盼rose頁）上通過鹽到酸胍譽/雄谷胱甘肽梯佩度進(jìn)行帶有斤組氨酸標(biāo)簽兔的人朊病毒乞蛋白多肽片從段的氧化再竹折疊，抑制粗了蛋白質(zhì)聚嚴(yán)集和分子間晶二硫鍵的形船成，再用咪肯唑緩沖液對拒目標(biāo)蛋白進(jìn)袍行洗脫，純緒化的流程圖響如圖梅4規(guī)所示葉(20)愉。槽Stemp逆fer金等在械α并-怎葡萄糖苷酶惹的沒N載端或伴C夠端加上多聚夏精氨酸標(biāo)簽評，研究了變叨性蛋白在肝釋素親和介質(zhì)席上的折疊復(fù)民性，通過優(yōu)菌化實驗條件手，蛋白質(zhì)可敲以在施5mg/m債l升濃度條件下序高效復(fù)性圍(59)案。泄圖匹4戀：利用金屬俘螯合色譜復(fù)學(xué)性純化人朊享病毒蛋白多汽肽片段的流尋程圖才除了以上的龜應(yīng)用，更令燈人鼓舞的是把這一技術(shù)已匠成功用于膜毯蛋白的復(fù)性卷（坦24,50阻,71繡）。酮戊二田酸載體蛋白也是線粒體內(nèi)匯膜上的一種須轉(zhuǎn)運蛋白，束Smith凈先采用異E.col濃i窄C41密（規(guī)DE3水）作為宿主梢菌使左C府端帶有組氨寺酸標(biāo)簽的目漲標(biāo)蛋白形成晃包涵體獲得上大量表達(dá)，路再用鎳柱親辟和色譜進(jìn)行那復(fù)性和純化倒，獲得的融擱合蛋白具有痰和天然蛋白溪一樣的轉(zhuǎn)運接活性，每升崗的細(xì)菌培養(yǎng)濾液可獲得泡15mg般的活性蛋白懇（惱50希）。筒C.脅由固定化伴瀉侶分子和溝/凍或折疊酶介柄導(dǎo)的色譜復(fù)縮性傍分子伴侶和糟折疊酶在蛋土白質(zhì)的正確拒折疊中起著棍重要的作用課，是近年來偏的一個研究揪熱點，它們托和蛋白質(zhì)在羅體內(nèi)共表達(dá)扮已經(jīng)成為促且進(jìn)蛋白質(zhì)可領(lǐng)溶性表達(dá)的園重要方法。庫分子伴侶和岔折疊酶在體奴外有兩個方岸面的應(yīng)用，損其一是在溶澡液中加入伴覽侶分子和因/按或折疊酶促研進(jìn)包涵體蛋逆白質(zhì)的折疊耀和裝配（笑39雀），另一方憤面就是通過辦固定化的伴向侶分子和攜/飯或折疊酶來秘介導(dǎo)蛋白質(zhì)峰的折疊復(fù)性塑。兆Altam裁irano幻等通過固定剃化伴侶分子膝GroEL喂的活性小片它段、脯胺酰情異構(gòu)酶和大受腸桿菌氧化辱還原酶賓DsbA建將蝎子毒素億蛋白惑Cn5聽的折疊得率貧從詞5%使提高到止87%屈（舅18朵）。在單鏈藏抗體隙Fv陰段的透析復(fù)接性中，加入埋固定化的氧蒼化還原酶出D暈sbA冤和肥DsbC襪可以顯著提沒高折疊的效戶率，得到的巖單鏈淡抗體睛Fv旺段和天然俊抗體埋Fv茅段具有相同餓的功能（急46謝）。投擋.3匆其它的復(fù)性視方法貞近年，還有西一些其它的愁方法用于蛋烏白質(zhì)的折疊其復(fù)性，如雙查水相萃取復(fù)柿性（責(zé)76,77壞,78,7撞9糖），反向膠巧束復(fù)性（漆33,75喉,80座），高靜力孫壓復(fù)性（像31,81鳴,82,8傾3源），這些方寬法對特定的輔蛋白質(zhì)可獲踏得高的復(fù)性避效率，大多蘋還停留在研蝶究階段，相局信隨著方法裳的成熟和普雙及，將會為扇包涵體蛋白鋪質(zhì)的折疊復(fù)忍性提供更多鞋的選擇手段字。項2.2薪可溶重組分抽子的分離純蜻化婚重屠彈組蛋白在大它腸桿菌中得壁到表達(dá)以后拉，首先必須俯從細(xì)菌釋放只才能進(jìn)行下秀游的分離純蟻化過程。蛋桑白質(zhì)釋放的耐方法依賴于售蛋白質(zhì)最終常在細(xì)胞中的渾定位。大部悉分的可溶性養(yǎng)重組答養(yǎng)蛋白在細(xì)胞毀質(zhì)中表達(dá)，效而一些膜蛋伐白常常表達(dá)濟(jì)于細(xì)胞內(nèi)膜搶上，還有一滑些則分泌到肝細(xì)菌的周質(zhì)鉗間隙或細(xì)胞真外。將重組羞蛋白分泌到珍周質(zhì)間隙或剝細(xì)胞外可避斜免破碎細(xì)胞拌和處擦親理細(xì)胞碎片鑒，而且雜蛋叨白的種類和國量都要少得綢多（在周質(zhì)朽空間大約有麗100吳種不同蛋白拿質(zhì)，而在胞摟漿內(nèi)有大約粗4000畫種次蠻不同的蛋白裳）。對于分料泌到周質(zhì)間恭隙的蛋白質(zhì)商，使用滲透絨壓沖擊，凍猾融法，溶菌處酶處理方法冷可以使目標(biāo)翁蛋白釋放。裙對于表達(dá)于歪細(xì)胞內(nèi)膜和淡胞內(nèi)的蛋白榮質(zhì)要經(jīng)過細(xì)攤胞破幸鋸碎，常用的別方法有高壓襯勻漿法、超鏈聲破碎法、濫珠磨法、化剃學(xué)滲透法和柏酶溶解法，侍每種方法有汁自己的特點除，現(xiàn)在的研史究常常將幾嶄種方法結(jié)合旋，并緊密結(jié)項合下游固液自分離雙訴過程（衛(wèi)87予）。興對于表達(dá)于襖細(xì)胞膜的蛋御白質(zhì)，先要悶破碎細(xì)胞后話分離細(xì)胞膜鄙，再抽提溶滔液進(jìn)行膜蛋惜白的提取，能由于膜蛋白柱具有疏水區(qū)昌域，在抽提未溶液中需要南加入表面活別性劑，一方驕面破壞細(xì)胞蘿膜，溶解膜葉結(jié)構(gòu)，另一兔方面促進(jìn)膜槽蛋白的溶解腹和穩(wěn)定，常溪用蕩Trito林nX-1達(dá)00脊、薦婦脫氧膽酸鈉蔽、僵Brij業(yè)等弱的表面撲活性劑來保柱留蛋白質(zhì)的予天然構(gòu)象。散表面活性劑射Trito漆nX-1迫14垮的臨界溶液箭濃度（暗criti確cals病oluti編onte察mpera隸ture府）為卵23岡℃偏，肚咽在此溫度以裂下，形成均旱一的溶液，遷在此溫度以鎮(zhèn)上，則形成稍富含表面活咬性劑的相和收低濃度表面斜活性劑的相命，通過溫度滲誘導(dǎo)的相分著離可以使膜朋蛋白進(jìn)入富叛含表面活性閘劑的葡咸相，實現(xiàn)表夠達(dá)膜蛋白的沃濃縮，是一冶種應(yīng)用廣泛稼的表面活性給劑。在膜蛋衣白的整個分論離純化過程兇中，都要使蒙用表面活性身劑來模擬脂集質(zhì)的功能，林但膠束與蛋詠白質(zhì)的相互焰作用撤啊常常降低層叔析的分辨率哭，而且聚集輕的情況更容勵易發(fā)生，所帝以在特定的敘純化階段選碧擇哪一種表投面活性劑，枕以及使用多虧大的濃度，塵對分離純化撲的影響最為灣關(guān)鍵（侮88皮）。工釋孕捧放出目標(biāo)蛋犯白后，再進(jìn)蒸行液相和固堡相細(xì)胞碎片殺的分離，得而到澄清的蛋賺白質(zhì)溶液就隙可以進(jìn)行下聰游的分離純寸化了，涉及丸膜分離技術(shù)庫、沉淀分離攝技術(shù)、萃取可技術(shù)、層析妖技膠房術(shù)、電泳分窯離技術(shù)，以乳及一些整合預(yù)技術(shù)，如擴(kuò)祥張床吸附，兆雙水相萃取遇。膜分離技袋術(shù)和沉淀分佛離技術(shù)是兩殖種傳統(tǒng)的技表術(shù)，不管在尚實驗室研究巨，還是在工招業(yè)的生產(chǎn)上義都有扯券應(yīng)用，近年鉆來功能性膜閃的應(yīng)用和膜耀色譜的發(fā)展頂大大擴(kuò)展了委膜分離的應(yīng)迫用領(lǐng)域，而培親和技術(shù)和忠沉淀分離相捏結(jié)合產(chǎn)生了賺親和沉淀技塑術(shù)，提高了商分離的特異底性。擴(kuò)張床錢吸附弟隱和雙水相萃脾取整合了細(xì)滑胞碎片處理鋤過程和初步勁濃縮純化過炕程，在大規(guī)盤模純化重組棋蛋白時具有叢很強(qiáng)的優(yōu)勢闖。淺賞膽層析技術(shù)在敞分離純化中瓜的應(yīng)用貿(mào)層析技術(shù)應(yīng)錘用于蛋白質(zhì)租的分離純化酬開始于航60佛年代，現(xiàn)在哪已成為蛋白租質(zhì)分離純化找的高分辨的伐方法。在層降析技術(shù)的發(fā)必展過程中，映首先是基質(zhì)主填料的發(fā)展扛。由于蛋白幫質(zhì)大分子具硬有高的親水稈性，要求分慧離介質(zhì)具有通親水的界面掩，為活性大謹(jǐn)分子提供適效宜的微環(huán)境售，早期的離值子交換介質(zhì)現(xiàn)不具有親水奧的特性和大錘的孔結(jié)構(gòu)，街僅用于小分極子的分離純礎(chǔ)化，管Peter俊son尊和磚Sobe愧r現(xiàn)等在離子交鍬換介質(zhì)的研芬究上進(jìn)行了蔥開拓性的工劉作，選擇特放定的纖維素最作為離子交農(nóng)換基團(tuán)的基寒質(zhì)，合成的牢離子交換纖探維素介質(zhì)具檔有高的結(jié)合北容量和低的叔不可逆性吸忙附，并得到步實際應(yīng)用（米89,90寫）。在過去違的幾十年里器各種層析用您基質(zhì)得到發(fā)魄展，如雄Sepha塌cryl反、容Sepha丸rose千FF虎、余Seph閘arose份HP授、孫Super惑ose默、氧Super過dex植、腹SOURC置E咐、燒Mono淚Beads眾、榆Toyop語earl曾，盯熊這些基質(zhì)都訪有其的物理慎和化學(xué)特點鐮，在蛋白質(zhì)吊的分離純化中中發(fā)揮著重蘭要的作用。滔層析技術(shù)的慌另一個發(fā)展靜方向是功能黎基團(tuán)的發(fā)展快，適應(yīng)不同娛的選擇性要除求，如各種卸不同聾攤親和層析介挖質(zhì)的合成，倍使一步純化閉就能達(dá)到很駕高的純度。羊?qū)游黾夹g(shù)的欣第三個發(fā)展久方向是操作羽模式的多樣老化，已發(fā)展禍的操作模式牙有擴(kuò)張床吸萌附、模擬移菌動床層析、震置換息忌層析、灌流掉層析和徑向塞層析，這幾謎種方法能夠務(wù)具有處理大習(xí)體積樣品的壓能力，適合堡于大規(guī)模生潮產(chǎn)應(yīng)用。匪在騙敢重組蛋白的矮分離純化中提，各種分離眠模式都得到澆應(yīng)用。凝膠嘴過濾層析是丹基于液相的堆分離方法，毒凝膠包裹的持內(nèi)環(huán)境形成裂固定相，凝喬膠的外環(huán)境有形成流動相勿，蛋白質(zhì)分體子越柏趨大越不容易獵滲透進(jìn)入固色定相，所以厘又稱為分子留篩層析，層聾析的分辨率訂與介質(zhì)的排鏡阻極限和上姓樣的體積有蝶關(guān)，是一種搜易于操作的迫層析方法，雁另外凝膠過舉濾層析常用間于緩星撫沖液交換，比此時可使用領(lǐng)較大的載量刷。離子交換戀層析基于蛋疼白質(zhì)與離子勁交換介質(zhì)電訪荷間的相互喉作用，高于極蛋白質(zhì)等電脹點，蛋白質(zhì)遲帶負(fù)電荷，減低于蛋白質(zhì)救等電點蛋白焦質(zhì)帶埋稠正電荷，不庭同的蛋白質(zhì)別在一定的捐pH災(zāi)條葡錘件下與介質(zhì)響上的離子之忍間相互作用單不同，而產(chǎn)還生不同的選慨擇性，根據(jù)殺帶電基團(tuán)的摸類型和強(qiáng)度榴可分為四種魯類型：強(qiáng)陰蓋離子交換層施析、弱陰離搏子交換層析櫻、強(qiáng)陽離子健交換尖贊層析、弱陽馬離子交換層陸析，通常采點用一定的平盯衡條件使目餃標(biāo)蛋白選擇妄性的吸附在帖介質(zhì)上，也往可以使雜蛋被白吸附，而喊目標(biāo)蛋白選演擇性的穿過克。疏水層析懸基于蛋白質(zhì)敗表面無嚼的疏水區(qū)和示介質(zhì)疏水配避體間的相互轉(zhuǎn)作用，在高蠶鹽濃度條件造下，蛋白質(zhì)悔的疏水區(qū)表造面上有序排容列的水分子斤通過鹽離子滲的破壞作用栽釋放，裸露案的疏水區(qū)與民疏水配體相敗互作笑狡用而被吸附邊，隨著鹽濃塊度的降低，債疏水性相互柴作用也降低完，蛋白質(zhì)的裕水化層又形感成，蛋白質(zhì)糞最終解吸附暖，其它物質(zhì)亡，如乙二醇慈、甘油、非巷離子表面活糞性劑也可以煎降低諸飼疏水相互作炊用，而且疏餓水相互作用搶也受盞pH有、溫度和添每加劑的影響她。疏水層析準(zhǔn)的選擇性依濾賴于疏水配嬸體的結(jié)構(gòu)，央有烷基配體所和芳香基配么體，烷基的兩鏈越長，蛋備白質(zhì)的保留艷就越強(qiáng)。羥男基磷灰石層揭析常用于共抗體和的蛋降分離純化，腦對其分離的冶機(jī)制還了解費的不清楚，罵但涉及介質(zhì)腔上鈣離子和稀磷酸根與蛋初白上帶電殘獨基的相互作隸用。傳統(tǒng)的朽片狀羥基磷樸灰石物理和晉化學(xué)穩(wěn)定性源比較差，僅盾能在膊槐低流速條件序下使用，新旱的球形羥基顧磷灰石克服憑了以上缺點無，對于其它顆方法不易分地離的蛋白質(zhì)定，可以用羥紙基磷灰石層副析進(jìn)行分離猾純化。等點設(shè)聚焦層析是稿基于蛋白質(zhì)崗等電扎賞點不同的分蹄離模式，以際陰離子交換列劑為固定相吃的情況為例線，兩性電解憐質(zhì)緩沖液和保離子交換基最團(tuán)相互作用夕形成蠟pH域梯度，蛋白遠(yuǎn)質(zhì)在喇pH勢大于其等電瘦點時吸附，折在隨pH戒低于其等電夫點時解吸附豈，由于蛋白伙質(zhì)區(qū)帶后部毫所處微環(huán)境猜的超pH艱總是低于蛋燃白質(zhì)區(qū)帶前意部所處微環(huán)拆境的錢pH忍，處于后部駝區(qū)帶的蛋白汁質(zhì)先于前部松開始移動，舞從而產(chǎn)生聚福焦效應(yīng)，因濕此可分離等售電點僅差控0.02左的蛋白質(zhì)。陸親和層析基狗于蛋白質(zhì)和隨親和配體的訓(xùn)特異性相互慣作用，是最勒為高效的分姻離純化方法郊，用于親和弄層析的配體豐可以是針對細(xì)抗原的俘抗體享、針對蛋白國質(zhì)分子的受呢體、酶的底悠物或抑制劑罪、針對糖分灰子的凝集素勤、活性染料滑、金屬離子追、天然或改敏造過的相互腰作用多肽等險等。利用刑DNA娛重組技術(shù)，佳進(jìn)行目標(biāo)蛋琴白的融合表那達(dá)，再用親潔和層析進(jìn)行瞞分離純化，煩已經(jīng)成為蛋兵白質(zhì)表達(dá)純喚化的常用手征段。蓄表喝3食常用層析方豬法的分離特圈點和不同純憂化階段的適集用性喬層析方法雅親和層析淋凝膠過濾層課析字離子交換層復(fù)析貸疏水層析洗分離機(jī)制蓬特異性親和蠅大小環(huán)電荷事疏水性碧選擇性戚非常高妻中等摩高飽高獵→夾中等躬載量彼高糊低盆高幕高蝴純化速度連中等睛中等養(yǎng)→譽低搖高蓄高棚生物相容性片好翻非常好旬好品中等摔→言好箱目標(biāo)蛋白的寄得率閣高霧高休高辭中等捐→倘高越捕獲濃縮階宣段奶+++宰+麻+++罪+++鄰中間純化階麥段椅+++忙+悶+++銳+++亂精制純化階棉段沙++融+++賓+++下+袋蛋白質(zhì)能否套獲得高效分象離純化既與題層析介質(zhì)的踏理化性質(zhì)（嶄如配基組成田、配基密度悼、孔徑、表訪面積、顆粒少大小、顆粒舅分散性）有角關(guān)，又與流吵動相參數(shù)（慘如有機(jī)溶劑象、計pH垮、金屬離子易、解離劑、韻氧化植/翠還原劑、溫雜度、緩沖液形組成、離子善強(qiáng)度、上樣孤濃度和體積遇）有關(guān)，正招是這些理化它參數(shù)的變化蘭使得層析技謙術(shù)具有更強(qiáng)掏的通用性，斗成為最重要滿的蛋白質(zhì)分預(yù)離純化技術(shù)向，表壯3齡壺列出常用層女析方法的分枕離特點和在晃不同純化階據(jù)段的應(yīng)用情曠況（逮94鄰）。缺墊在親和標(biāo)簽的急在重組蛋白櫻分離純化中旦的應(yīng)用豎在重組蛋白湯的分離純化浴中，與其它竊層析方法相輪比，親和層隱析的純化能轟力更為強(qiáng)大爛，一步純化后就可以得到偏很高的純度廈，可以使蛋羊白質(zhì)純化遍100-1賣000乖倍，光紹活性蛋白的幻回收率通常螺很高，而且錫可以純化其俱它方法難以膏分離的蛋白喪質(zhì)。從分離僵的機(jī)理上來伙講，親和層耗析是一種典鴨型的吸附層秀析，分子與最其介質(zhì)上的咽配體結(jié)合具奮有特攔澇異性和可逆阻性，特異性吐使純化具有摘選擇性，而牌可逆性使蛋訴白質(zhì)在適宜余的條件下洗皂脫下來。基與于重組蛋白寺質(zhì)與配體的賤結(jié)合特性，拼一些重組蛋惰白質(zhì)應(yīng)用親呆和層析進(jìn)行捎純寧擠化，如將攀抗體報、受體或體命外噬菌體展尊示技術(shù)篩選槐的親和體（榮affib筆ody饑）偶聯(lián)在親削和介質(zhì)上進(jìn)寒行親和純化笑，但這類應(yīng)元用僅限于特虜定的蛋白質(zhì)濤，而利用澇DNA殺重組技術(shù)使航目標(biāo)蛋白與姐親和標(biāo)簽融性合表達(dá)，控按制重組分子筋的親和選擇死性，進(jìn)行融害合蛋白的親拾和純化，已焦成為純化重漸組蛋白的常石用遺傳策略說。除了方便垮分離純化，經(jīng)親和標(biāo)簽的下融合表達(dá)還衣有以下的優(yōu)息點：楚1.纖凍擴(kuò)有的親和標(biāo)皇簽可以提高院目標(biāo)蛋白可禮溶性表達(dá)的歇水平。但要甲注意的是可巾溶性表達(dá)并律不能保證正宅確的折疊，奸融合蛋白可漸以形成可溶水性的聚集體很（壞106嗎）。豎2.研則紗加入的標(biāo)簽候提供檢測目抄標(biāo)蛋白的高窩靈敏度方法碧，如表位標(biāo)佛簽可以使用青ELISA息和恒Weste皆rnbl磚ottin喉g冠進(jìn)行定性和陶定量檢測。尤3.積稱境親和融合策蘭略已廣泛用滑于蛋白質(zhì)惰-齊蛋白質(zhì)相互縮作用研究和勒蛋白質(zhì)復(fù)合支物研究（響99諒）。胡4.巨們影改善蛋白的班藥代和藥動要學(xué)特性，如悲一些細(xì)胞因案子和免疫球冷蛋白辣G駕（治IgG顏）的淹Fc接段融合，可誰以性顯著增旁加半衰期，糕與白蛋白結(jié)描合結(jié)構(gòu)域結(jié)吐合也可以起咱到相同的效志果。購猜.1旬選擇親和標(biāo)慶簽時需要考暑慮的因素束1.雀個艙親和標(biāo)簽是販否會影響到愛目標(biāo)蛋白的僻結(jié)構(gòu)和功能示親潤啞和標(biāo)簽與目慕標(biāo)蛋白之間程的作用是相洞互的，需要頓綜合的考慮炒，既要考慮泡到對目標(biāo)蛋來白結(jié)構(gòu)功能慣的影響，又把要考慮到對壇標(biāo)簽與其配記體親和作用考的影響，以者及實際的用齡途。阻紛大多數(shù)情況測首選短的多扶肽標(biāo)簽，這負(fù)是因為短的祝肽標(biāo)簽對目悉標(biāo)蛋白的結(jié)代構(gòu)影響最小克，在某些應(yīng)東用中，短肽細(xì)不必要去除汁，因為重組展蛋白已經(jīng)具榨有完全的生醫(yī)物學(xué)功能，衣這也齒畝是盤6橋個組氨酸標(biāo)殖簽比殃GST償標(biāo)簽應(yīng)用更誓廣的原因，耗而且短肽不庫具有免疫原炸性，融合蛋噸白可直接的訴用于挖抗體勵的姿偏制備；而大陳的親和標(biāo)簽顧可能限制重戚組蛋白的折脖疊，影響蛋炊白質(zhì)的生物棗學(xué)功能。從征另一方面來巴講目標(biāo)蛋白晨可能會干擾況短肽標(biāo)簽與別其配體的結(jié)膽合，與小的毅短肽標(biāo)簽相據(jù)比，堤魔大的多肽和帝蛋白質(zhì)標(biāo)簽悄也在實驗室轟作為常規(guī)選剖擇，它們的僅親和配體大多多是低分子滿化合物，可勺以降低目標(biāo)伯蛋白對結(jié)合秧的影響，增彎強(qiáng)純化的特舞異性（棵111掌），許多情胞況下，重組披融合蛋白去漏除親和標(biāo)簽本后，目標(biāo)蛋固白可形成正培確的結(jié)構(gòu)。逢2.桑歪祝蛋白質(zhì)的穩(wěn)鳳定性捧含有多對二洽硫鍵的蛋白綁質(zhì)或某些蛋備白在進(jìn)行非盡融合表達(dá)時爆，常容易形白成包涵體，肝或有降解發(fā)屯生。降解的踐原因有兩種俱情況，一是帳目標(biāo)蛋白的歌不正確折疊和，那么加入露親和標(biāo)簽如贊果能夠促進(jìn)礎(chǔ)目標(biāo)蛋白的摧正確折疊將糧有助于防止為蛋白質(zhì)的降壇解，第二種壤情況是末端燒氨基酸不穩(wěn)地定，這時的赤原則是，氏N陸端融合有助私于保護(hù)目標(biāo)蘇蛋白的飛N攀端，而播C切端融合有助匙于保護(hù)目標(biāo)否蛋白的爹C緞端，從而可瞧以獲得全長伏的目標(biāo)蛋白記。親和標(biāo)簽腥對蛋白質(zhì)包吧涵體的形成爭可以促進(jìn)，話也可以減少突，不同的標(biāo)游簽有不同的雪特性，多數(shù)住情況還與表絹達(dá)系統(tǒng)相關(guān)峽。如麥芽糖瞎結(jié)合蛋白（畢MBP合）具有分子晌伴侶樣的特位性，進(jìn)行酷N華端融合，常泊有助于蛋白往質(zhì)的正確折旺疊和活性蛋穴白的獲得，激目的蛋白的音MBP弄融合已成功折用于晶體結(jié)華構(gòu)的研究（丘95傾）。熔3.團(tuán)坑栽親和標(biāo)簽所絨融合的位置傻親和標(biāo)簽可當(dāng)以加在最N散端，可以加雞在文C副端，也進(jìn)行斜串聯(lián)，如圖假5手所示，在選祥擇融合位置隆的時候，要涂考慮所處位狹置對標(biāo)簽親昂和性的影響某，如融GST顏適合加在醬N揚端，還要考廁慮融合可能耗對目標(biāo)蛋白傅的影響，如森果目標(biāo)蛋白越的Ｃ端序列剖包埋在蛋白針的內(nèi)部，那旺么進(jìn)行Ｃ端墓融合就不合渾適。多數(shù)情利況下蛋白質(zhì)殘的時N譽端區(qū)域?qū)Φ按鞍踪|(zhì)的功能糟不是太重要例，所以在到N愉端進(jìn)行融合鴉標(biāo)簽的融合嬸常常能保留抱蛋白質(zhì)的生姐物學(xué)功能。匙由于筒N葵端桶DNA遣序列對蛋白律質(zhì)的轉(zhuǎn)錄翻壽譯影響較大嗓，所以標(biāo)簽痛加在福N送端對蛋白質(zhì)撇的表達(dá)水平獵影響更大，存優(yōu)化標(biāo)簽的會mRNA耳結(jié)構(gòu)可使表團(tuán)達(dá)水平提高疫。相N月端標(biāo)簽對表歲達(dá)蛋白的溶斷解性影響更咱大，如在惱N肯端使用天然肥HAT想標(biāo)簽比潤6肆×暑His踐標(biāo)簽有助于浙目標(biāo)蛋白的我可溶性表達(dá)證，而橫N橫端進(jìn)行醬MBP確融合表達(dá)也摟常用來提高稀目標(biāo)蛋白的嫁溶解性。進(jìn)控行分泌表達(dá)躁時，常選用撤可分泌的親棒和標(biāo)簽，有我些親和標(biāo)簽克不適合于放摸在區(qū)N媽端，如皺6役×沸His恭標(biāo)簽放在得N涂端會影響重替組蛋白信號陪肽的處理和賤目標(biāo)蛋白的澇分泌，這是表因為皮6班×魯His搏標(biāo)簽具有多雞個帶電咪唑似殘基。在選稻擇融合位置霞時，另一個異方面的考慮披是，落C惠端融合在去碌除融合標(biāo)簽愛后在目標(biāo)蛋睡白的店C郵端會有幾個扯氨基酸殘留溉，而小心的仁選擇剪切特齊異性的氨基揭酸序列就可襯以在去除俱N澇端親和標(biāo)簽?zāi)蟮玫教烊辉摰哪繕?biāo)蛋白告?；貓D頃5

雨進(jìn)行載體構(gòu)埋建時親和標(biāo)封簽相對目標(biāo)悶蛋白所處的巾位置。辯4.樓舅比是否需要在義變性條件下斗進(jìn)行親和純徐化濤如果融合蛋掙白以包涵體屈的形式存在番，由于大多淘數(shù)的親和標(biāo)界簽不適于在刑變性劑存在敞條件下進(jìn)行旁親和純化，興只能先進(jìn)行址包涵體的溶斤解和復(fù)性，專再在非變性您條件下進(jìn)行刷親和純化，秋其中有些親擾和標(biāo)簽可以前促進(jìn)蛋白的旺折疊復(fù)性，效如來源于蛋蛙白彈A賀的貿(mào)ZZ齡標(biāo)簽，可使育胰島素樣生春長因子蝦Ⅰ玉（淹IGF-蒜Ⅰ豈）融合蛋白高在比非融合渠蛋白高曬100簽倍的濃度下形成功折疊復(fù)市性，并且不膠會形成沉淀享（南98窩），在選擇松親和表達(dá)純能化系統(tǒng)時需弱要考慮。組穗氨酸標(biāo)簽在燥非變性和變林性條件下通她常均可進(jìn)行浸親和純化，匠除了前面的答這種方法可扮以使用，大跑多數(shù)情況下咳直接在變性聽條件下進(jìn)行苗親和純化或貍親和層析復(fù)蜘性，而且親依和層析復(fù)性睡常?？梢蕴釗p高折疊的效槳率。逐5.忽踩撲親和標(biāo)簽對伙表達(dá)水平的蓋影響汁親和標(biāo)簽對什表達(dá)水平的答影響不僅與化親和標(biāo)簽和莫目標(biāo)蛋白相刑關(guān)，還與可延用的表達(dá)純矛化系統(tǒng)密切辱相關(guān)，需根漠據(jù)具體情況得進(jìn)行分析。熄6.破售蜂研是否需要標(biāo)甜簽具有鑒定微功能討首先要看針尼對目標(biāo)蛋白禾是否有方便氏有效的分析浴鑒定方法，蝶如果沒有可固選擇能夠進(jìn)肚行重組蛋白饑檢測的親和諒標(biāo)簽。循7.載泛趴親和洗脫的以條件競表毒4阻列出了親和驚洗脫的條件玉，有些條件世比較溫和，為而有些條件管較為劇烈，駝選擇的親和艇表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)輔該不使目標(biāo)滔蛋白變性。捎8.習(xí)煮避親和介質(zhì)和患緩沖液的費遮用賽9.幟擁完是否在親和溝純化后去除過標(biāo)簽姿融合蛋白是斗否需要去除瘡標(biāo)簽，由目午標(biāo)蛋白的用曉途和標(biāo)簽的鍵特點來確定讀，如果用于沃免疫動物生尺產(chǎn)續(xù)抗體筑，則不需要扔，如果不影測響蛋白的功寄能研究，也述不需要，如燃果影響了蛋顯白的功能研乞究或用于臨丙床治療，則功需要去除標(biāo)旗簽。仆表林4亞常用的親和欣融合表達(dá)對/丸純化系統(tǒng)玉親和標(biāo)簽煉分子大小尿結(jié)合配體榴融合部位送洗脫條件節(jié)注釋籃谷胱甘肽巰涌基轉(zhuǎn)移酶六(GST)鳥26kD組a鵝(220a獅.a.)傻谷胱甘肽平N汪端達(dá)還原型谷胱戚甘肽檢載體寧:pGEX鐮,pET鞠41,p運ET42,搜挨可進(jìn)行表達(dá)辯蛋白的檢測老,遠(yuǎn)融合蛋白形潑成二聚體架金葡菌蛋白先A(Pro麥tein費A)Ig通G順結(jié)合結(jié)構(gòu)域桐30kD介a艦hIgG幣N旱端東低特pH橫載體田:pRIT錫2T,茫具有繪Prote嶼inA賀信號序列可患進(jìn)行分泌表施達(dá)廟,質(zhì)可在弱變性角條件下純化爺（聯(lián)0.5M粱鹽酸胍）晚ZZ煉結(jié)構(gòu)域業(yè)14kD宣a撞hIgG螞N箱端誦低謎pH暈載體喘:pEZZ舊18,分具有黨Prote稈inA糧信號序列可龍進(jìn)行分泌表怎達(dá)旱,苗可使目標(biāo)蛋浸白獲得正確際的折疊框鏈球菌蛋白柴G(Pro鉗tein熄G)賽28kD藏a糠白蛋白類(HSA)叢N顯端或猶C謊端遭低斗pH豐具有屆Prote皮inG容信號序列可艘進(jìn)行分泌表襲達(dá)偏白蛋白結(jié)合慰結(jié)構(gòu)域倦(ABD)辛5-25末kDa響白蛋白均(HSA)許C針端溫低鼓pH丈

僚幾丁質(zhì)結(jié)合嗎結(jié)構(gòu)域腐52a.揭a.品幾丁質(zhì)蘆N恢端或鏡C販端壘誘導(dǎo)剪切乳pTYB,誦pTWIN幫纖維素結(jié)合吊結(jié)構(gòu)域鵲(CBD)歉107,1爐14,15導(dǎo)6a.a喬.遮纖維素顏N辨端或葵C浮端簡乙二醇死載體診:pET哪34,p塔ET35因,pET亞36,撕pET3戰(zhàn)7,pE掛T38,滔可增強(qiáng)表達(dá)跌蛋白的熱穩(wěn)猶定性柳,搭具有信號肽局序列可進(jìn)行濁分泌表達(dá)玉麥芽糖結(jié)合輩蛋白稠(MBP)槍41kD錄a存(396a馳.a.)椅直鏈淀粉歌N逼端或丑C幸端溪麥芽糖頸載體踏:pMAL目,運具有示MBP撤信號序列可乏進(jìn)行分泌表帽達(dá)播,垂可改善溶解非性純PinPo羽int(周可生物素化撕蛋白兼)駕13kD山a疼單體抗生物愿素蛋白喜N量端糠生物素壁載體全:PinP幸oint,誦扁可進(jìn)行表達(dá)榜蛋白的檢測絲Bioti濃nAvi懶tag(夕可生物素化址的短肽厭)次15a.a壺.償單體抗生物奮素蛋白鑄N鼻端或極C洋端渴生物素迫載體莫:pAN,穴pAC,床碑可進(jìn)行表達(dá)脂蛋白的檢測擔(dān),冒可進(jìn)行目標(biāo)敲蛋白的固定傅化備,握可在變性條際件下純化撞Strep芽tag煎Ⅱ倦(侮非生物素化估親和巨)滲8a.a清.樸鏈霉抗生物徐素蛋白變體腸Strep泊-Tact諸in法N貪端或患C容端碗脫硫生物素松載體蔽:pPR-投IBA,四pASK-嶼IBA,婦具有恢OmpA駛信號序列可睜進(jìn)行分泌表嚇達(dá)格,筑可進(jìn)行表達(dá)胖蛋白的檢測更,狹可進(jìn)行目標(biāo)偉蛋白的固定插化秩,喬可在變性條膛件下純化白鈣調(diào)蛋白結(jié)塘合肽輔(CBP)戴2記6a.a姻.襖鈣調(diào)蛋白釀N浸端或態(tài)C雞端坊EGTA/稱EGTA辰和鄙1MNa響Cl宜pCAL出組氨酸標(biāo)簽賣(Poly鐘His)而6,8,1做0,18宴a.a.凝螯和金屬離屈子減Ni默2+稻或恩Co乓2+甘N臨端或看C逝端巴咪唑示/議低舟pH那載體曾:pET容,pHA袖T,pQ乒E,pPr仿oEx,p僚TrcHi德s,雜可在變性條宴件下純化雕表位標(biāo)簽賺FLAG曉8a.a減.帽單抗路M1/M2廣使用姓M1申單抗進(jìn)行釣N矮端融合筑,乞使用嗎M2橡單抗辣N得端或壁C通端融合鋒融合蛋白與棒M1機(jī)單抗的結(jié)合寨是鈣依賴的怎,邀使用姨EDTA,癢M2吊單抗是非鈣創(chuàng)依賴的然,易使用低乓pH須或合成的術(shù)FLAG賠肽腫載體羊;p-FL飽AG,p袍3秧×贈FLAG,足已具有腸激墊酶酶切位點讓S權(quán)標(biāo)簽偽15a.狠a.勵RNase東A遇的爪S剛片段視N圾端或太C燭端憑低循pH蜜載體浪:pET,啦可進(jìn)行表達(dá)攪水平的監(jiān)測漸T7始標(biāo)簽及11a.括a.鄉(xiāng)單抗與N芽端動低型pH犬載體式:pET,催可增強(qiáng)表達(dá)泥水平壟,筋可在弱變性它條件下純化口精氨酸標(biāo)簽玩(Poly嗚Arg)勒5-15壤a.a.滾強(qiáng)酸性陽離隨子基團(tuán)完C帳端市氯化鈉梯度涌

媽苯丙氨酸標(biāo)睡簽艦(Poly脅Phe)凡11a.嫌a.繭疏水苯基站N謊端培乙二醇樂

爛棄.2休親和標(biāo)簽的謹(jǐn)去除駝盡管親和融壤合策略可以崇一步使融合妨蛋白的純度揀達(dá)到很高，偽但是在蛋白璃質(zhì)的下游處餃理階段又引挖入了新的問竊題，即需要聰位點特異的肌剪切。在進(jìn)榜行融合表達(dá)扎時，以下三脂種情況是不關(guān)必去除親和鹽標(biāo)簽：畝1.錯目標(biāo)蛋白作延為免疫原用根來產(chǎn)生和純塘化為抗體殿；廈2.起目標(biāo)蛋白的臘生物活性不緣受融合標(biāo)簽傭的影響；只3.跑目標(biāo)蛋白用春來直接固定偉化在介質(zhì)上再。但如果親姨和標(biāo)簽影響憂了目標(biāo)蛋白謙的功能，或爹為了結(jié)構(gòu)生沖物學(xué)研究和兆治療用途，攪就必須在融模合標(biāo)簽和目臣標(biāo)蛋白之間便加入特異的奸剪切位點，性以便去除親淹和標(biāo)簽，可逢用的方法有好化學(xué)法和酶獅法，如表撲5懶所示，在選御擇這些方法柱時除要考慮刪選擇性等因繁素外，還要沙考慮標(biāo)簽去賀除后氨基酸腐的殘留重直，目前掀C線端的標(biāo)簽沒壺有很好的方長法去除，都吸會在目標(biāo)蛋桃白的宵C漲端引入額外羨的氨基酸，夢針對癥N作端標(biāo)簽已有輔幾種蛋白酶倘在酶切后可蓬使目標(biāo)蛋白屢不帶額外的臥氨基酸殘基研?；瘜W(xué)方法停廉價，但是擊常缺乏選擇偉性，而且使派用劇烈的反菜應(yīng)條件常使賓目標(biāo)蛋白變愉性失活，使株用蛋白酶的斷優(yōu)點是反應(yīng)悲的條件溫和技（中性刑pH恰，溫度為近4?！孑?shù)斤?7欺℃贈），特異性憤強(qiáng)。如果使賓用蛋白酶進(jìn)頁行特異性剪智切，在酶切確完成后要有康相應(yīng)去除蛋觀白酶的純化象方法，有的舒重組蛋白酶爐具有親和標(biāo)好簽，如未N婦端帶有法His甩標(biāo)簽的腸激陰酶、二肽氨裹基肽酶和買TEV北蛋白酶，可壽在酶切后使院用金屬螯合路親和層析去鵝除，偷N豎端帶有墊GST艷標(biāo)簽的塑PreSc圖issio號n它蛋奧鍬白酶，可以父用谷胱甘肽淡親和層析柱怠去除，還可磁以將蛋白酶躁固定化在介咐質(zhì)上進(jìn)行融乘合蛋白的酶滿切，使蛋白走酶可重復(fù)使籠用。盡管如京此，在進(jìn)行咸融合蛋白的低酶切時會遇燙到一掀幫些特殊的問膠題，如酶切瘡的效率受到鏡酶切位點空擾間可及性和雪周圍氨基酸王性質(zhì)的影響桐，常存在酶均切不完全的為現(xiàn)象；某些銷蛋白在酶切吸后會出現(xiàn)沉壟淀；使用內(nèi)主肽酶可引起熊非特津跑異性剪切的賓情況，如凝幸血酶屬于絲蒜氨酸蛋白酶仗，在精氨酸灑和賴氨酸殘羨基后剪切，巷最優(yōu)的酶切次位點為沉P4-P3嫌-Pro-損Arg要↓友P1’-P握2’言（顧P4撇和嚷P3紗為疏水性氨倡基酸，謹(jǐn)P1’罵和吧P2’粱為非酸性氨游基酸），非付特性酶切的惜情況在表按5惱的注釋里作濫了說明，而銷應(yīng)用廣泛的雁腸激酶也存沖在非特異性刷酶切的現(xiàn)象束（恒92,97吧）。轎Jenny紹等對凝血酶慢和凝血因子邪Ⅹ錫a菠蛋白酶的應(yīng)橡用進(jìn)行了綜蜘述，認(rèn)為盡詢管它們在很純多應(yīng)用中能賭夠在設(shè)計的針位點進(jìn)行特?fù)?jù)異性酶切，足但常常會發(fā)障生目標(biāo)蛋白湊其它位點的犁酶解，所以護(hù)在去除親和塑標(biāo)簽后要對賴目標(biāo)蛋白進(jìn)訊行鑒定，以授確保蛋白的膛結(jié)構(gòu)沒有發(fā)揭生變化（翅105允）。正是由激于酶切以及墓成本方面的修考慮，親和錯融合策略在構(gòu)工業(yè)上應(yīng)用挨并不廣泛。并表貧5際融合蛋白的塵剪切方法選剪切的方法曲剪切位點序熔列賄注釋額

絹化學(xué)法隸溴化氰陸Met^尿需要兩70%借甲酸，室溫敞羥胺樹Asn^G擴(kuò)ly酷在您pH安為裕9懇條件下，需別要加熱，寬45聾℃捕甲酸等Asp^P笑ro縫70%塞甲酸，需要郵加熱編

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墨柜酶法史腸激酶螺Asp-A尊sp-As敲p-Asp葉-Lys^汁重組的蛋白涌酶，為內(nèi)切毅酶，如果在蝕賴氨酸后為打脯氨酸則不艱能剪切，在賞其它的堿性爛氨基酸殘基物后有非特異捐性剪切，具佩有活性的竿pH跑范圍為史4.5奸到肯9.5麥，溫度范圍斷為梁4焰℃付到肅45炭℃疾凝血因子懂Ⅹ帶a禽蛋白酶夏Ile-G兆lu/As鵝p-Gly胳-Arg^雪如果在精氨仿酸后為脯氨儉酸和精氨酸糕則不能剪切類，為內(nèi)切酶吊，在紹Gly-A減rg咐后存在非特撇異性剪切鞠凝血酶敬Leu-V粥al-Pr絹o-Arg勿^Gly-嬸Ser揀牛來源的含裝有其它蛋白豐質(zhì)，為內(nèi)切表酶，存在非碑特異性的剪煙切，生物素憂化后可用鏈抽霉抗生物素輔蛋白親和層吵析清除蘭PreSc葡issio舍n返蛋白酶部Leu-G奪lu-Va像l-Leu適-Phe-巨Gln^G覺ly-Pr壺o火GST煤融合的鼻病激毒筑3C濱蛋白酶，為疑內(nèi)切酶，筐4寸℃坑具有最優(yōu)活邪性罷rTEV嚇蛋白酶爪Glu-A賽sn-Le蜂u拜-Tyr-貌Phe-G魚ln^Gl安y雖重組的煙草訊蝕紋病毒蛋奪白酶，具有患8雁個氨基酸識盈別位點，高猜特異性，為拾內(nèi)切酶，在鞏寬的溫度范以圍里具有活售性，與曉His-t作ag善融合后，酶鉗切后使用金圈屬螯合親和僅層析清除界二肽基氨基規(guī)肽酶謙(Xaa)陡2n則^Xaa-丹Pro,燒(Xaa)銅2n逗^Xaa-聯(lián)Xaa扣–Pro,皂

(Xa膜a)手2n俊^Lys/德Arg/G偶ln為為外切酶，新當(dāng)終止氨基國酸為貸Gln合時，可在谷津氨酰胺環(huán)轉(zhuǎn)黃移酶和焦谷窗氨酰胺肽酶扶的作用下去擾掉淋Gln備，可產(chǎn)生天澆然的目標(biāo)蛋饅白質(zhì)，特異斥性強(qiáng)短到.3員常用的一些懶親和標(biāo)簽尋罵崗表悅4寨列出了常用淡的親和融合座系統(tǒng)和各自利的洗脫條件骨，以及各種鞠親和標(biāo)簽的批特點（爛91,92宵,93家），下面就戶幾種常用的漠親和標(biāo)簽進(jìn)沒行介紹，需稱要了解更多其的標(biāo)簽可參刪閱赴Hearn良等的綜述（航91旨）。段1