第十二章 熒光分析法

第十二章熒光分析法1第1頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三光致發(fā)光 物質(zhì)受到光的照射時(shí)，除吸收某種波長(zhǎng)的光還會(huì)發(fā)射出比原來(lái)所吸收的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光的現(xiàn)象。熒光 物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)所發(fā)射的光。分子熒光和原子熒光2第2頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)熒光分析法的基本原理電子能級(jí)的多重性M=2s+1M=1單重態(tài)M=3三重態(tài)一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1.分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程M=1M=1M=33第3頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫2.熒光的產(chǎn)生第4頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三振動(dòng)馳豫 激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的分子通過(guò)碰撞釋放能量，返回同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程。內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換 當(dāng)兩電子激發(fā)態(tài)能量相差較小以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，受激分子由高電子能級(jí)轉(zhuǎn)移致低電子能級(jí)的過(guò)程。 （振動(dòng)失活在同樣多重態(tài)間進(jìn)行，如S2*S1*）術(shù)語(yǔ)5第5頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三外部能量轉(zhuǎn)換 激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其它溶質(zhì)碰撞，以熱能的形式釋放能量的過(guò)程。體系間跨越 處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過(guò)程，如S1*T1*術(shù)語(yǔ)6第6頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光發(fā)射 第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)（任一振動(dòng)能級(jí)）

發(fā)射熒光的過(guò)程約為10-9~10-7s磷光發(fā)射

激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)（任一振動(dòng)能級(jí)）

發(fā)射磷光的過(guò)程約為10-4~10s或更長(zhǎng)

磷光法不如熒光法普遍7第7頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三分子發(fā)光熒光、磷光和化學(xué)發(fā)光統(tǒng)稱為分子發(fā)光熒光和磷光是光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光是由于分子的外層電子在化學(xué)能的作用下使分子處于激發(fā)態(tài)，再以無(wú)輻射馳豫轉(zhuǎn)入第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后躍回基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)并產(chǎn)生光輻射。8第8頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜（形狀與吸收光譜相似）固定某一發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定該波長(zhǎng)下熒光發(fā)射強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)變化所得的光譜。

熒光強(qiáng)度——激發(fā)波長(zhǎng)

發(fā)射光譜（熒光光譜） 固定某一激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定熒光發(fā)射強(qiáng)度隨發(fā)射波長(zhǎng)變化所得的光譜。

熒光強(qiáng)度——發(fā)射波長(zhǎng)萘的激發(fā)光譜及熒光和磷光的發(fā)射光譜9第9頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光光譜特征苝的苯溶液（a）和硫酸奎寧的稀硫酸溶液（b）吸收光譜和熒光發(fā)射光譜10第10頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1.斯托克斯位移

熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)波長(zhǎng)的現(xiàn)象2.熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)熒光發(fā)射光譜只有一個(gè)發(fā)射帶

第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)3.熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系基態(tài)與激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)間隔類似激發(fā)光譜：基態(tài)激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)

熒光光譜：激發(fā)態(tài)基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)熒光光譜特征11第11頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、熒光與分子結(jié)構(gòu)熒光壽命除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間，用f表示。以lnF0/Ft作圖，直線斜率即為1/f。（一）熒光壽命和熒光效率12第12頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光效率物質(zhì)的熒光效率在0～1之間，0.1～1時(shí)有分析價(jià)值。13第13頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系物質(zhì)發(fā)射熒光的兩個(gè)條件：

強(qiáng)的紫外吸收、一定的熒光效率 一般地，大多數(shù)熒光物質(zhì)受到激發(fā)后，首先經(jīng)歷*或n*躍遷，經(jīng)過(guò)振動(dòng)馳豫或其它無(wú)輻射躍遷，再發(fā)生*或*n躍遷，產(chǎn)生熒光。 由于*比n*躍遷的強(qiáng)度更大，壽命更短，因此*常能產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。 雖然n*躍遷產(chǎn)生的熒光較*弱，但在發(fā)生n*躍遷時(shí)，緊接著產(chǎn)生體系間跨越，最后從*三重態(tài)回到基態(tài)，產(chǎn)生更強(qiáng)的磷光。14第14頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1.長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)大都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，或是長(zhǎng)共軛雙鍵的脂肪烴共軛效應(yīng)增大了熒光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子，從而有利于熒光的產(chǎn)生苯ex205nmem278nm0.11萘ex286nmem321nm0.29蒽ex356nmem404nm0.3615第15頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.分子的剛性分子的剛性越強(qiáng)，熒光效率越大聯(lián)苯＝0.2芴＝1.0無(wú)熒光有熒光16第16頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.取代基給電子取代基常使熒光強(qiáng)度增大如：-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等吸電子取代基常使熒光強(qiáng)度降低如：-COOH、-NO、-NO2、-SH、RCO-等鹵素取代基隨鹵原子序數(shù)的增加而熒光下降1-氯代萘＝0.051-溴代萘＝0.0021-碘代萘＝0.000可能是由“重原子效應(yīng)”所致。在重原子中，能級(jí)之間的交叉現(xiàn)象比較嚴(yán)重，容易發(fā)生自旋軌道的相互作用，增加了體系間跨越的速度。17第17頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（三）熒光試劑作用：產(chǎn)生強(qiáng)熒光性產(chǎn)物1.熒光胺2.鄰苯二甲醛3.1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘4.測(cè)定無(wú)機(jī)離子的熒光試劑18第18頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素溫度升高通常會(huì)使熒光效率和熒光強(qiáng)度降低乙醇-80C=1.00溫度每增加10C，熒光效率減小約3%1.溫度19第19頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.溶劑一般地，隨極性溶劑的增加，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

奎寧在苯、乙醇和水中的熒光效率的相對(duì)大小為1、30、1000。溶劑粘度減小，分子碰撞機(jī)會(huì)增加，熒光減弱。20第20頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.酸度每一種熒光物質(zhì)都有其最適宜的pH范圍21第21頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三下列中能使苯胺引起熒光熄滅的是（）A.乙醇B.鹽酸C.水D.硫酸

苯胺在（）條件下熒光強(qiáng)度最強(qiáng)A.pH=1B.pH=3C.pH=10D.pH=13CBD22第22頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4.熒光熄滅劑熒光熄滅（熒光猝滅）熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象熒光熄滅劑鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等等熒光熄滅原因分子碰撞失去能量、生成不發(fā)光的物質(zhì)、氧的熄滅作用、自熄滅和自吸收23第23頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三由于氧分子的順磁性質(zhì)，溶液中溶解氧的存在，使激發(fā)單重態(tài)分子向三重態(tài)的體系間跨越速率增加，因而會(huì)使熒光效率降低。其它順磁性物質(zhì)也有這種作用。碰撞熄滅能量轉(zhuǎn)移氧的熄滅作用24第24頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5.散射光散射光子與物質(zhì)相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同的方向散射。瑞利散射光子和物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，只有光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變的散射光，其波長(zhǎng)與入射光波長(zhǎng)相同。拉曼散射光子和物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變的同時(shí)，光子與物質(zhì)發(fā)生能量交換，發(fā)射出比入射光更長(zhǎng)或更短的散射光。25第25頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三波長(zhǎng)320nm的入射光激發(fā)硫酸奎寧的稀硫酸溶液時(shí)，將產(chǎn)生320nm的（）A.熒光B.磷光C.瑞利光D.拉曼光C如何區(qū)別熒光、磷光、瑞利光和拉曼光？26第26頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三溶劑中雜質(zhì)的熒光光譜或溶劑的拉曼光譜可能干擾測(cè)定。溶劑在不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下，其拉曼光的波長(zhǎng)隨激發(fā)光波長(zhǎng)的變化而變化，而物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)不變，所以可以通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)來(lái)消除拉曼光的干擾。27第27頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

熒光法測(cè)定硫酸奎寧時(shí)，激發(fā)光波長(zhǎng)若選擇在320nm，拉曼光波長(zhǎng)為360nm；若激發(fā)光波長(zhǎng)選擇在350nm，拉曼光波長(zhǎng)為400nm。熒光波長(zhǎng)為448nm。則測(cè)定時(shí)選擇波長(zhǎng)應(yīng)為（）A.ex320nmem400nmB.ex320nmem360nmC.ex350nmem448nmD.ex320nmem448nmD28第28頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系低濃度時(shí)呈現(xiàn)良好的線形關(guān)系29第29頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三對(duì)于熒光法F=2.3kI0ECl

FI0，I0增強(qiáng)，F(xiàn)增大；低濃度時(shí)，F(xiàn)C 只要檢測(cè)器靈敏，可檢測(cè)微弱信號(hào)。對(duì)于分光光度法A=-lgT=ECl

C極小時(shí)，A0，無(wú)吸收； 若C不變，改變?nèi)肷涔釯0強(qiáng)度，A無(wú)變化。 所以吸收光譜受一定限制，靈敏度小于熒光光譜。為什么熒光分析法比紫外可見(jiàn)法更靈敏？30第30頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、定量分析方法1.校正曲線法F—C2.比例法（空白不能調(diào)零時(shí)，要扣除空白）3.聯(lián)立方程式法31第31頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)熒光分光光度計(jì)和分析新技術(shù)濾光片熒光計(jì)濾光片－單色器熒光計(jì)熒光分光光度計(jì)32第32頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖

1.光源 2、4、7、9.狹縫3.激發(fā)單色器5.樣品池 6.表面吸光物質(zhì)8.發(fā)射單色器10.檢測(cè)器11.放大器12.指示器13.記錄器源發(fā)光源（氙燈）、激發(fā)單色器、樣品池、發(fā)射單色器、檢測(cè)系統(tǒng)一、熒光分光光度計(jì)1.主要部件第33頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三 在測(cè)量分子熒光強(qiáng)度時(shí)，要在與入射光成直角的方向上進(jìn)行測(cè)量，這是由于（）A.只有在入射光線成直角的方向上才有熒光B.熒光強(qiáng)度比透射光強(qiáng)度小C.熒光強(qiáng)度比透射光強(qiáng)度大D.熒光波長(zhǎng)比透射光波長(zhǎng)長(zhǎng)E.熒光是向各個(gè)方向發(fā)射的，為了減小透射光的影響 熒光分光光度計(jì)常使用的光源是（）A.空心陰極燈B.氙燈C.氫燈D.硅碳棒BE第34頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.儀器的校正（1）靈敏度的校正 一定濃度的穩(wěn)定熒光物質(zhì)作對(duì)照品溶液調(diào)儀器 （如1ug/ml硫酸奎寧）（2）波長(zhǎng)校正汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線（3）激發(fā)光譜和熒光光譜的校正光源強(qiáng)度、檢測(cè)器的感應(yīng)度35第35頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.熒光分析法的應(yīng)用（1）無(wú)機(jī)化合物的分析采用有機(jī)試劑進(jìn)行熒光分析的元素已近70多種能夠與金屬離子形成熒光絡(luò)合物的有機(jī)試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物。（分子剛性平面結(jié)構(gòu)增大）另一類絡(luò)合物是三元離子締合物。 例：羅丹明B為陽(yáng)離子熒光染料，Au3+、Ga3+、Tl3+等陽(yáng)離子首先與鹵素離子形成二元絡(luò)陰離子，再與羅丹明B締合形成熒光化合物。熒光猝滅法也是常采用的方法。36第36頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（2）有機(jī)化合物的分析脂肪族有機(jī)化合物本身能發(fā)熒光的很少，需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光，可直接用熒光法測(cè)定。對(duì)具有致癌活性的多環(huán)芳烴，熒光分析法已成為最主要的測(cè)定方法。在生物化學(xué)分析、生理醫(yī)學(xué)研究和臨床、藥物分析領(lǐng)域，許多重要的分析對(duì)象，