第十一章核酸的生物合成

第十一章核酸的生物合成第1頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四DNA的復(fù)制（以DNA為模板合成DNA）RNA的轉(zhuǎn)錄（以DNA為模板合成RNA）RNA的逆轉(zhuǎn)錄（以RNA為模板合成DNA）RNA的復(fù)制（以RNA為模板合成RNA）第2頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四概念:復(fù)制(replication)：指以親代DNA分子為模板合成出子代DNA分子的過程。轉(zhuǎn)錄(transcription)：以DNA分子為模板合成出與其核苷酸順序相對(duì)應(yīng)的RNA的過程。第3頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)：以RNA為模板將遺傳信息傳給DNA的過程。第4頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四人體體細(xì)胞23對(duì)染色體各有一半來自于父母核酸——DNA、RNA

提問：二者區(qū)別？

堿基（A、G、C、T——A、G、C、U）

戊糖（脫氧核糖——核糖）第5頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四DNA合成——復(fù)制體細(xì)胞染色體有絲分裂第6頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的生物合成機(jī)制——半保留復(fù)制12保留了一半父代DNA成份父代DNA半保留復(fù)制子代DNA第7頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四半保留復(fù)制假說的提出：

1953年，Watson&Crick在DNA雙螺旋基礎(chǔ)上提出。1957年，MathewMeselson與FranklinStahl設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。第8頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)證明：方法：

將E.Coli培養(yǎng)在以15NH4Cl為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長；提取其DNA；進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。再移至14N培養(yǎng)基中生長、提取DNA、離心分析。第9頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果：

證實(shí)了DNA復(fù)制時(shí)，親代分子分為二個(gè)亞單位（兩條鏈），分別構(gòu)成子代分子的一半，且經(jīng)過多代仍保持完整性。第10頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四意義：1）半保留復(fù)制保證了遺傳的穩(wěn)定性；2）DNA是處于不斷變異和發(fā)展之中。ＤＮＡ復(fù)制第11頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四1.旋轉(zhuǎn)酶解開超螺旋。1.1過程完成復(fù)制后的染色體子代細(xì)胞中的一條染色體旋轉(zhuǎn)酶第12頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四2.解螺旋酶在起點(diǎn)雙向打開螺旋復(fù)制起始處的DNA片段起點(diǎn)復(fù)制叉解螺旋酶——解開雙鏈第13頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四解螺旋酶3.DNA結(jié)合蛋白與單鏈結(jié)合并向前移動(dòng)DNA結(jié)合蛋白起點(diǎn)提問：DNA結(jié)合蛋白的作用？ATGC防止單鏈復(fù)合第14頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四起點(diǎn)ATCCATT小段RNA引物U磷酸核糖RNA聚合酶4.RNA聚合酶催化起點(diǎn)處通過堿基互補(bǔ)連接引物RNA鏈。作用——確定起始部位，引導(dǎo)復(fù)制開始。3`OH5`PiPiPi3`OH5`PiPiPi3`OH5`PiPiPiA—U

G—C第15頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四6.新鏈5`→3`延長（復(fù)制DNA）5.引物3`連接dXTP第16頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四E.COLi的DNA聚合酶

功能ⅠⅡⅢ5’→3’聚合作用+++5’→3’外切酴作用+－－3’→5’外切酶作用+++聚合核苷酸數(shù)/min600309000分子數(shù)/細(xì)胞40010010*DNApolⅢ主要負(fù)貢DNA鏈延伸。第17頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四開鏈方向起點(diǎn)新鏈5｀新鏈3｀新鏈3｀新鏈5｀

？

？父代DNA—兩鏈方向相反

！必然無法連續(xù)復(fù)制開鏈方向第18頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四7.均以5｀→3｀方向形成前導(dǎo)鏈和滯后鏈由岡崎片段連接成的新DNA鏈稱滯后鏈。與復(fù)制叉移動(dòng)方向相同，可以一直復(fù)制到底的新DNA鏈稱前導(dǎo)鏈。第19頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四5`3`5`8.切除引物，補(bǔ)缺。3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`DNA聚合酶3`→5`核酸外切連接酶連接酶連接缺口切除引物、切除配錯(cuò)dXTP新鏈第20頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四3`5`5`3`5`3`第21頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制滯后鏈不連續(xù)復(fù)制DNA復(fù)制為5`→3`半不連續(xù)復(fù)制。第22頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四半保留——復(fù)制結(jié)果半不連續(xù)——復(fù)制過程第23頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四為什么進(jìn)化出如此復(fù)雜的復(fù)制機(jī)制呢？在RNA的監(jiān)控下保持DNA復(fù)制的高度忠實(shí)性用RNA引物控制起始，同時(shí)充分發(fā)揮了DNA聚合酶的糾錯(cuò)能力。第二節(jié)DNA的損傷和修復(fù)損傷——結(jié)構(gòu)破壞、功能破壞提問：哪些因素會(huì)引起DNA損傷？環(huán)境污染物———物理因素（紫外線、（電離、核）輻射）、化學(xué)誘變劑、病毒雜合等。后果——癌癥、畸形、遺傳病等等第24頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四2.1修復(fù)機(jī)制1.光復(fù)活TT紫外線(260nm)T(胸腺嘧啶）二聚體雙鍵打開第25頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四紫外光T-T二聚體可見光激活該酶只有高等哺乳動(dòng)物該功能退化掉了。例對(duì)細(xì)菌紫外誘變或殺滅時(shí)盡量保持暗環(huán)境。光復(fù)活酶結(jié)合于損傷部位第26頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四2.切除修復(fù)核酸酶DNA聚合酶DNA連接酶屬于復(fù)制前的修復(fù)。第27頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四3.重組修復(fù)復(fù)制同時(shí)的修復(fù)*復(fù)制DNA聚合酶、連接酶補(bǔ)缺提問：原損傷部位沒有修復(fù)，對(duì)后代影響大嗎？在后代中只有一個(gè)個(gè)體含有該條DNA，后代越多，影響比例越小，等于消除影響。第28頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四****4.SOS修復(fù)SOS—求救信號(hào)DNA損傷嚴(yán)重，復(fù)制受到抑制，前幾種方法難以奏效時(shí)：誘導(dǎo)校對(duì)能力差的DNA聚合酶形成，局部“亂配”********進(jìn)化、變種、癌癥、誘變育種等等都是基于這一機(jī)理。為了生存——變。第29頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

真核細(xì)胞DNA的復(fù)制：

（DNA指導(dǎo)的DNA合成）真核生物與原核類似，但更復(fù)雜，不同之處：（一）DNA模板上有多個(gè)起點(diǎn)，即真核細(xì)胞DNA復(fù)制由多個(gè)復(fù)制子共同完成。第30頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

（二）有5種DNA聚合酶，

各具功能：復(fù)制DNA：

α→后滯鏈；

δ→前導(dǎo)鏈；修復(fù)DNA：

β、ε；復(fù)制線粒體DNA：

γ；引物合成：α。第31頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)細(xì)菌的限制性核酸內(nèi)切酶和基因重組3.1細(xì)菌的限制性核酸內(nèi)切酶DNA普通內(nèi)切酶DNA細(xì)菌限制性內(nèi)切酶GAATTCCTTAAG在特定部位實(shí)施內(nèi)切。粘性末端被核酸外切酶降解細(xì)菌自身DNA甲基保護(hù)GAATTCCTTAAGCH3CH3不工作這種限制性核酸內(nèi)切酶有何用呢？打擊入侵的敵人第32頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四噬菌體入侵噬菌體DNA若專一序列點(diǎn)無甲基保護(hù)，將被降解。第33頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四應(yīng)用——生化工具DNA切割→測序基因重組3.2基因測序原理：PCR（基因擴(kuò)增）＋復(fù)制（放射性dDNA終止符）＋熒光測序第34頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四PCR—聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用色譜技術(shù)分純?cè)诤芏痰臅r(shí)間內(nèi)將DNA樣品呈2n大量復(fù)制第35頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四復(fù)制（放射性dRNA終止符）＋熒光測序第36頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四3.3天然重組與基因重組天然重組包括同源、異源重組同源重組—父母DNA重組減數(shù)分裂第37頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四溶原細(xì)菌人類病毒與之類似DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯溶解釋放異源重組

第38頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四應(yīng)用基因重組——不同來源的DNA按人的設(shè)計(jì)和干預(yù)下定向拼接、組合。特殊基因（多肽激素、抗生素、酶、藥物蛋白）重組入蛋白產(chǎn)品工程菌（如大腸桿菌）第39頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四特殊基因超級(jí)細(xì)菌如超級(jí)除油菌超級(jí)植物“侏羅紀(jì)公園”中的恐龍抗病蟲、抗旱、帶顏色等等基因治療、基因武器重組入第40頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四第41頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)菌染色體質(zhì)粒易于分離、測序，天然可轉(zhuǎn)移，不被輕易降解，常作為重組的載體過程舉例——超級(jí)細(xì)菌都是DNA第42頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四

重組質(zhì)粒DNA

限制性核酸內(nèi)切酶處理

有的片段中具有目的基因

植入

供體細(xì)胞染色體DNA

載體質(zhì)粒環(huán)狀DNA限制性核酸內(nèi)切酶處理

DNA連接酶催化兩類DNA片段拼接受體細(xì)菌

研磨、超聲波等

方法破碎細(xì)胞供體細(xì)胞

篩選出重組細(xì)菌？帶有粘性末端的DNA片段各種細(xì)菌第43頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四注射法開門法（如電擊、化學(xué)藥劑）病毒法第44頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四1um重組基因片段基因槍黃金子彈靶細(xì)胞基因槍法——?jiǎng)又参锛?xì)胞基因重組第45頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四在特殊培養(yǎng)基上（如含有青霉素）篩選目的細(xì)菌質(zhì)粒上具有抗性基因如抵抗青霉素長出必然是重組成功的細(xì)菌篩選第46頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四第四節(jié)RNA的生物合成轉(zhuǎn)錄——以DNA為模板，按堿基配對(duì)原則（dA-U、dT-A、dG-C、dC-G)合成RNA鏈。4.1過程DNA復(fù)制RNA轉(zhuǎn)錄第47頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四兩條鏈都是模板鏈嗎？第48頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄——只能以雙鏈中固定的一條鏈（模板鏈）為模板轉(zhuǎn)錄RNA開始1.RNA聚合酶延DNA鏈移動(dòng)，識(shí)別轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)（啟動(dòng)子）(啟動(dòng)子)打開螺旋，形成聚合酶-DNA-RNA復(fù)合體。第49頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四2.復(fù)合體甩掉δ亞基，隨RNA聚合酶移動(dòng)連續(xù)5`→3`轉(zhuǎn)錄RNA鏈。17bp螺旋解開長度12bpDNA-RNA復(fù)合體長度3.DNA螺旋前開、后合,RNA長長，不斷脫離DNA。(終止子)4.識(shí)別終止信號(hào)（終止子），結(jié)束轉(zhuǎn)錄，各自分離。第50頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四真核生物1基因→1RNA第51頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四基因假基因基因外區(qū)域Extron外顯子——轉(zhuǎn)錄為RNAIntron內(nèi)含子——不轉(zhuǎn)錄為RNA第52頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四基因中的外顯子轉(zhuǎn)錄提問：如何實(shí)現(xiàn)跨越內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄外顯子區(qū)呢？繞環(huán)閉合內(nèi)含子區(qū)域。第53頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四加工——使粗品RNA（沒有功能）→成品方法——剪切、拼接，修飾，添加甲基（rRNA)（剪切、拼接針對(duì)個(gè)別沒能避免內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的RNA）4.2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的“加工”粗品RNA