微生物基本操作技術(shù)

微生物基本操作技術(shù)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC姚粟內(nèi)容微生物分類微生物接種和培養(yǎng)微生物的分離微生物的鑒定微生物保藏質(zhì)控微生物一、微生物分類一、微生物分類-微生物的進(jìn)化和多樣性普遍性系統(tǒng)發(fā)育樹,親緣關(guān)系根據(jù)rRNA序列比較來決定。G.J.OlsenandC.R.Woese,‘RibosomalRNA:AkeytoPhylogeny’intheFASEBJournal,7:113-123,1993一、微生物分類原核生物大小:0.5-3mm形狀:-球型(Sthaphylococcus)-棒狀(Escherichiacoli)-螺旋(Rhodospirillum)生長(zhǎng)迅速，20min至幾小時(shí)可繁殖一代可利用多種碳源

真核生物細(xì)胞器：線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體液泡一、微生物分類原核生物一、微生物分類真核生物一、微生物分類一、微生物分類-多相分類表征（表型）特征形態(tài)特征生理和代謝特征生態(tài)特征遺傳（基因型）特征蛋白質(zhì)比較核酸堿基組成核酸序列多相分類PolyphasicTexonomyTechnology一、微生物分類-微生物的分類等級(jí)“種”是微生物分類中最基本的分類單元?！胺N”的定義：一個(gè)種（基因型種）是有相似G+C組成并通過DNA雜交試驗(yàn)判斷由70%或更大相似性的菌株的集合。分類等級(jí)界（Domain）門（Phylum）綱（Class）目（Order）科（Family）屬（Genus）種（Species）二、微生物接種和培養(yǎng)二、微生物接種和培養(yǎng)微生物接種定義將微生物的純種或含菌材料（如水、食品、空氣、土壤、排泄物等）轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，這個(gè)操作過程叫微生物的接種。接種工具

微生物接種技術(shù)分類斜面接種液體接種穿刺接種平板接種

二、微生物接種和培養(yǎng)斜面接種左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平；右手先將棉塞（硅膠塞）擰轉(zhuǎn)松動(dòng)，再拿接種環(huán)；用右手的小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，同時(shí)將管口在火焰上灼燒；接種環(huán)灼燒滅菌后插入試管內(nèi)，冷卻、挑菌，轉(zhuǎn)入另一斜面底部，沿斜面劃曲線或直線。二、微生物接種和培養(yǎng)二、微生物接種和培養(yǎng)液體接種操作方法與斜面接種基本一致，只是將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時(shí)使接種環(huán)與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散；塞上棉塞，輕輕搖動(dòng)均勻；如果菌種培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，使用移液管或滴管接種。二、微生物接種和培養(yǎng)三、微生物接種和培養(yǎng)穿刺接種用接種針調(diào)取菌種后，插入深層固體培養(yǎng)基內(nèi)（不要刺到底部），再沿原路拔出；此法用于厭氣性細(xì)菌接種，檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力。二、微生物接種和培養(yǎng)二、微生物接種和培養(yǎng)平板接種平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，以及活菌計(jì)數(shù)等；平板接斜面：平板分散的單菌落接于斜面；斜面接平板：點(diǎn)種法、劃線法。二、微生物接種和培養(yǎng)三、微生衡物分離微生物檢純培養(yǎng)恩分離技振術(shù)純培養(yǎng)丸物是指來源冶于同一單逗細(xì)胞的細(xì)豬胞群體。獲得純也培養(yǎng)物對(duì)微生物慮學(xué)研究至遣關(guān)重要。微生物純魔培養(yǎng)分離情技術(shù)涂布平板揭法平板劃攝線法平板傾注汗法稀釋搖管蠢法液體培婆養(yǎng)基分谷離法單細(xì)胞（齒孢子）分擔(dān)離法選擇培養(yǎng)圈基分離法涂布平板鉤法1、少量訪樣品加站到平板現(xiàn)中央（0.1m鳳L）；2、玻璃三資角涂棒浸矩入酒精；3、沾有酒腔精的涂棒撞在火焰上姨灼燒后使千其冷卻；4、無菌斑涂棒將熱樣品均壟勻涂布俗瓊脂培膜養(yǎng)基表敲面，適構(gòu)當(dāng)條件腐下培養(yǎng)帆。涂布平協(xié)板法樣品需席適當(dāng)稀喉釋30-瘦300貨CFU睡/mL平板劃線窩法斜線法曲線法方格法放射法四格法平板劃線賴法斜線法文：用接種環(huán)搭以無菌操餓作挑取菌蒜懸液一環(huán)轉(zhuǎn)，先在平哀板培養(yǎng)基拘的一邊作獻(xiàn)第一次平雁行劃線3-4條，再躲轉(zhuǎn)動(dòng)培恰養(yǎng)皿70°角，并將塌接種環(huán)上卷剩余物燒彈掉，待冷霸卻后通過血第一次劃抽線部分作楚第二次平村行劃線，龍?jiān)儆猛◤U通過第二南次平行劃競(jìng)線部分作廊第三次平夜行劃線和感第四次平股行劃線。曲線法：將挑取樸有樣品郵的接種疊環(huán)在平糞板培養(yǎng)號(hào)基上作據(jù)連續(xù)劃雄線。平板劃驚線法血瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌（大的金黃色菌落）平板傾乒注法對(duì)起始樣招品進(jìn)行連驗(yàn)續(xù)10倍稀釋，雖將高稀釋刃倍數(shù)的樣曾品與冷卻筍至適當(dāng)溫賽度的溶化墊瓊脂培養(yǎng)占基倒入無遍菌平皿后供混合均勻瓣，培養(yǎng)后提獲得單菌揚(yáng)落。培養(yǎng)基表腸面菌落為睜圓形，而培養(yǎng)基鬧內(nèi)部菌落呈豆?fàn)罨蛑魍哥R狀。稀釋搖船管法適合厭息氧菌的猶純培養(yǎng)杜分離無菌瓊溉脂培養(yǎng)數(shù)基試管猾加熱使瓊脂老熔化后底冷卻并球保持在50℃左右梯度稀河釋后的喜待分離孕菌株加腸入試管削中搖勻、痛冷凝在瓊脂柱延表面傾倒溉一層滅菌液體石秒蠟和固帆體石蠟引的混合技物培養(yǎng)后防，菌落爺形成在轟瓊脂柱鍬的中間液體培養(yǎng)鉛基分離不能在固程體培養(yǎng)基屬上生長(zhǎng)的土微生物仍需要桐用液體接培養(yǎng)基眾分離來津獲得純第培養(yǎng)。稀釋法是液體培退養(yǎng)基分離晝純化常用辯的方法。在同一個(gè)汪稀釋度的唉許多平行喜試管中，大多數(shù)摔（一般慮應(yīng)超過95%）表現(xiàn)矩為不生山長(zhǎng)。單細(xì)胞佳（孢子巾）分離單細(xì)胞別（或單腰孢子）訊分離法是采取拉顯微分咬離法從燥混雜群纖體中直賺接分離蒜單個(gè)細(xì)炮胞或單闖個(gè)個(gè)體非進(jìn)行培皺養(yǎng)以獲柏得純培綢養(yǎng)。較大的麻微生物，可采用業(yè)毛細(xì)管提賄取單個(gè)個(gè)崖體。個(gè)體相對(duì)睡較小的微滅生物，需采鄙用顯微廁操作儀絕，在顯圖微鏡下省用毛細(xì)凝管或顯閣微針、差鉤、環(huán)骨等挑取競(jìng)單個(gè)微超生物細(xì)膨胞或孢漿子以獲間得純培厘養(yǎng)。單細(xì)胞分閱離法對(duì)操作技倒術(shù)有比較高疤的要求。選擇培養(yǎng)犧基分離選擇培養(yǎng)圾基特性促生長(zhǎng)能爛力抑制能力指示（鑒吳別）能力選擇培死養(yǎng)基分日離傳統(tǒng)選擇性冠培養(yǎng)基血平板悉：適于各類草細(xì)菌的生零長(zhǎng)，一般求細(xì)菌檢驗(yàn)同標(biāo)本的分乓離，都應(yīng)罵接種此平蔥板。營養(yǎng)肉湯編：用于標(biāo)箭本及各慕類細(xì)菌悶的增菌巧克力血失平板：其中含輛有V和X因子，適居于接種疑踐有嗜血桿妥菌、奈含瑟菌等的標(biāo)本馬。中國藍(lán)爛平板或誘伊紅美舌藍(lán)平板糖：可抑制G+細(xì)菌，浙有選擇饞地促進(jìn)G-菌生長(zhǎng)決，是較綠好的弱面選擇性共培養(yǎng)基榴。麥康凱平栗板：具中等權(quán)強(qiáng)度選荒擇性，青抑菌力完略強(qiáng)，因有較少信革蘭陰位性菌不托生長(zhǎng)。SS瓊脂：有較強(qiáng)撥的抑菌袖力，用垃于志賀禮菌和沙到門菌的嶺分離。堿性瓊脂茅：用于從蘿糞便中談分離霍獲亂弧菌躺及其它鏈弧菌。選擇培養(yǎng)烘基分離新型顯色培養(yǎng)睜基利用微生拌物自身代砍謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)算顯色底物情反應(yīng)顯色的原理來咽檢測(cè)微生鏟物的培養(yǎng)咱基。OrganismEnzymeSubstrateColorColiformsβ-galactosidaseX-GALBlueEscherichiacoliβ-galactosidase

β-Glucuronidase

MUGfluorescenceEscherichiacoliO157β-galactosidaseX-GALBlue選擇培養(yǎng)駝基分離基于酶邀與底物肺反應(yīng)的勸顯色培僻養(yǎng)基技獨(dú)術(shù)CHR僻OMa址garPetr宴ifil數(shù)m3唱MAero敲bic煎Coun紡tPl脅ateCol辜ifo煩rm刑Cou福nt仆Pla佳teRapi保dCo醫(yī)lifo省rmC池ount枕Pla佳teE.濤col巡壽i/Co嘩lif抬orm縮慧Co壯unt意Pl頸ateEnte鮮rbac逗teri做acea協(xié)eCo葛unt轉(zhuǎn)Plat以eYea研st瓣and遲Mo譯ld滅Cou騙nt鑰Pla叔teStap餡h.a瀉ureu努sExpr興ess府Coun庫tPl勻ateEnvi爽ronm驗(yàn)enta井lList匙eriaPla層te基于酶與考底物反應(yīng)襲的顯色培集養(yǎng)基技術(shù)四、微生營物鑒定四、微濁生物鑒濾定多相鑒定余（分類)（poly節(jié)phas秧ict貿(mào)axon蠟omy）是利用皂微生物從分子特性到生態(tài)特芬征的多種筆不同信聞息，綜玩合表型和基因型特征進(jìn)行犯微生物分補(bǔ)類鑒定的凝方法。形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞特征培養(yǎng)特征生理生化試驗(yàn)生長(zhǎng)溫度耐鹽性碳源利用發(fā)酵產(chǎn)酸其他化學(xué)成分分析呼吸醌極性脂脂肪酸分枝菌酸氨基酸和糖其他基因型分析核酸序列分析功能基因分析DNA雜交指紋圖譜、菌株分型其他系統(tǒng)發(fā)育分析16S

rDNA5.8SITS區(qū)26S

D1/D2區(qū)其他四、微竹生物鑒挖定-形態(tài)學(xué)觀扣察細(xì)菌酵母絲狀真菌宏觀形態(tài)（培養(yǎng)特征）將培養(yǎng)物劃線或稀釋涂布，30℃培養(yǎng)16~24小時(shí)，選取劃線或稀釋涂布分離得到單菌落，觀察和記錄菌落的形狀、大小、質(zhì)地、邊緣、顏色、光澤、透明度、隆起等。將培養(yǎng)物劃線接種于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2～3d后，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，菌落質(zhì)地、菌落顏色、菌落表面是否為反光或暗淡、菌落是平伏還是隆起、菌落邊緣等。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（CA、CYA、WA）平板倒轉(zhuǎn)，向上接種三點(diǎn)，每個(gè)菌株接種兩個(gè)平板，倒置于

25℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)7天。觀察菌落直徑、顏色、質(zhì)地、滲出液、菌落反面顏色等特征。微觀形態(tài)（細(xì)胞特征）將培養(yǎng)物在30℃條件下培養(yǎng)16~24小時(shí)，挑取對(duì)數(shù)期的單菌落，涂布于事先滴加少量無菌水的載玻片上，自然干燥，加熱固定，進(jìn)行革蘭氏染色，將制好的染色涂片在100X40倍的顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、菌體形狀、排列行狀、菌體大小等細(xì)胞特征。培養(yǎng)物劃線接種于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2～3d后，取酵母菌制作成水浸片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和無性繁殖方式等。用無菌接種針挑取少量培養(yǎng)物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液的載玻片上，用接種針將菌絲團(tuán)分散開，蓋上蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡），制成水浸片，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征，包括分生孢子梗、分生孢梗莖、頂囊、?；⑵抗?、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子頭、分生孢子等。四、微生幅物鑒定-形態(tài)學(xué)先觀察四、微生叔物鑒定-生理生姜化碳源和氮源運(yùn)動(dòng)性細(xì)胞壁組成滲透耐性能源氧關(guān)系發(fā)酵產(chǎn)物最適pH和生長(zhǎng)范圍一般營養(yǎng)類型光合作用色素最適生長(zhǎng)溫度和范圍鹽需求及耐性發(fā)光次級(jí)代謝產(chǎn)物形成能量轉(zhuǎn)換機(jī)制對(duì)代謝抑制劑和抗生素的敏感性貯藏內(nèi)含物四、微灰生物鑒鉛定-生理生化Divi櫻sion鉆bas掩edo灘nme隸mbra億nec辜o(jì)mpo糖siti慣on:a)浩gra你m-n英ega率tiv吧e–h它ave擦ou概ter掛an曲di蘋nne丸rm鈴emb鹿ran飽es橫andath役inc搖ell旬wall亡(Esch橫eric任hia轟coli)b)常gra霞m-p賊osi陜tiv墳e–h柴ave忠no總ou董ter盼me熟mbr挺ane拉,b犧ut采hav睜eathic經(jīng)ker寶cell森wal鼠l(Bac忽ill繁us芹sub徑til云is)c)n掌eith絡(luò)erg攔ram-nor節(jié)gram+-n區(qū)oc刃ell眾wa晚lls染(m撥yco糧pla洲sm)htt秀p:/泰/ww沃w.m矮ed.專sc.魔edu演:85良/fo屋x/b最act項(xiàng)-me款m.j起pg四、微喬生物鑒德定-生理生蛙化API且(bio隙Meri擋eux)努(bio晃chem武ical茂)四、微中生物鑒清定-生理生冒化BBL觸Cr煩yst賢al研(Be菊cto脅nD餐ick最ins場(chǎng)on)將傳統(tǒng)兩的生化臟反應(yīng)、怠酶—底物呈色脈反應(yīng)與熒屠光增強(qiáng)顯辯色技術(shù)結(jié)擁合，設(shè)計(jì)兆鑒定反應(yīng)濱最佳組合蟲。六類鑒朱定試驗(yàn)碼板，可殲鑒定500種細(xì)菌四、微生腳物鑒定-化學(xué)成昨分分析除放線菌外的細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜：呼吸醌（甲基萘醌和泛醌）細(xì)胞質(zhì)膜：極性脂細(xì)胞質(zhì)膜：脂肪酸放線菌外膜：分枝菌酸細(xì)胞壁：肽聚糖（氨基酸和糖）全細(xì)胞：糖和蛋白質(zhì)四、微潤(rùn)生物鑒胸定-基因型總分析G+Cm箏ol%16S節(jié)rDNA都,26莖SrD查NAD沖1/D2懶,5.待8Sr潑DNA外ITS躍regi慶on,β-tu條buli旱nge猴ne,具calm速odul柜ing掛ene,gyrAg部ene悶,pheSg仆ene拍,rec撿Ngene斑,rpoBg李ene撲an袖do通the戒rh屯ous跟eke存epi畝ng吐gen客es.DNA使Ba佩rco龍din茂gg綠ene百se騎que揉nce踐an脈aly松sis變,才Mul思tiL豬ocu疫sS鉤equ墓enc究eA展nal低ysi違s(當(dāng)MLS浪A)DNA-嚇DNAhyb簽rid牧iza善tio唱nRAPD久,RF晉LP,連AFLP結(jié),SS蔑CP,歇Eric華-PCR縫,BO雅X-PC漫R,R還ep-P薦CR,府LAM浙P.四、微掃生物鑒疑定-基因型瓦分析DNA指紋圖譜分析1234Eric-PCRBOX-PCRRep-PCRSSCPERIC－PCR以細(xì)菌DNA中串聯(lián)重復(fù)序列為引物，通過擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，在不同種屬個(gè)體間表現(xiàn)為在染色體上存在的位置和拷貝數(shù)不同，以電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異，應(yīng)用于菌株分型。BOX-PCR根據(jù)BOX插入因子(大小為154bp,由保守性不同的boxA(57bp)、boxB(43bp)和boxC(50bp)等亞單位組成)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增微生物基因組DNA的重復(fù)性片段,最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性。REP-PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因的重復(fù)DNA片段來獲得菌株特異性遺傳圖譜,其中重復(fù)DNA片段包含了一個(gè)高度保守的回文序列(REP)為38bp的片段,由1個(gè)保守回文段以及兩端分別有6個(gè)降解位點(diǎn)和1個(gè)5bp的可變框構(gòu)成。PCR-SSCP是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與單鏈DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合，利用不同構(gòu)象單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動(dòng)速率的差異,檢測(cè)出DNA短片段中存在的單核苷酸突變,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種基因多態(tài)性的研究。。假絲酵母PCR-SSCP副溶血弧菌ERIC－PCR沙門氏菌REP-PCR四、微基生物鑒蔑定-鑒定實(shí)首例116SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹infB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹200宇7年Asp參erg虜ill纖us糠bra俗sil鳳ien區(qū)sissp.n從ov.新種發(fā)樂表2008年ATC塵C1宅640貫4鑒定為Aspe罰rgil壇lus腿bras腎ilie鄙nsissp.垃nov蹄.201雕0年USP將ATC松C1鋼640皇4更名2010年WDC腿M將ATCC唯164悲04更名圖：ATC耕C1果688煎8和ATCC檢164蚊04的培養(yǎng)嗽特征和派顯微形籍態(tài)a′n窩os念Var擺ga,作Sa箭′nd扒or區(qū)Koc促sub粥e′勉,B匆ea′陣ta廈To演′t哲h,et搏al.Asp慨erg叼ill霸u(píng)s透bra概sil澆ien僵sissp.半nov.吸,a施bise梢riat型ebl晌ackAspe儲(chǔ)rgil菌lusspe鐵cie伍sw雞ith嶺wo卡rld舍-wi盈de較dis促tri票but萄ion絞.I陳nte劉rna佛tio彎nal停Jo炸urn伸al液of窗Sys范tem咱ati疲ca元nd鐮Evo鞏lut亞ion凈ary愚Mi氣cro扔bio遲log奪y,曬200泡7,兄57:烘19貌25–飽193條2圖:Re番p-PC巡壽R條碼系續(xù)統(tǒng)發(fā)育念樹(Div異ersi澇Lab平臺(tái))Fig液ure幣2:制De匯ndr味ogr梨am特of踢Rep殲-PC甚RB徑arc挺odi挪ng錢(Di宣ver般siL泊ab編Pla遷tfo粗rm).注：圖片促來源于Rec配las侵sif舉ica態(tài)tio狼no疑fA音TCC姿?1暫640架4TM端an法dA英TCC輩?9跡642闖TM著asAspe劇rgil拍lus鄭bras鴨ilie葡nsis拘.Pha舒rma屢ceu神tic洗al弊Mic逝rob議iol盛ogy系Fo每rum俗Ne南wsl佩e(cuò)tt勝er,汁20欲08,洞Vo嘴l.江14級(jí)(10床):乎2-1叉4表ITS序列特禾殊位點(diǎn)校堿基差扁異Tabl銅e貸Diff六eren造ceo嘩fba肅sep品osit瘋ion遷inI遷TSs致eque豆nce四、微友生物鑒罩定-鑒定實(shí)例2200原7年Asp看erg屢ill躲us芒bra幻玉sil爽ien迷sissp.嶼nov賺.新種發(fā)表2008年ATC之C1弄640郵4鑒定為Aspe虎rgil臣lus鏈bras逼ilie府nsissp.n荒ov.201寸0年USP將ATC尊C1蓮640目4更名201賢0年WDCM將ATCC賀164厘04更名圖:基于曲覽霉黑色歪組β-微管蛋望白基因殿序列的N-J樹Figu掏re:狐Nei啟ghbo減ur–亞join字ing陽tree下bas禮edo御nβ-飯tubu仁lin話sequ溜ence寇dat博aof襖Asp令ergi予llus租sec昆tion緣瑞Nig請(qǐng)ri..注：圖慮片來源儲(chǔ)于Asp平erg隙ill矩us超bra堵sil吹ien援sis烈sp徒.n練ov.題,a旬bi綁ser肢iat愈eb腸lac更kA列spe盯rgi肝llu姿ss農(nóng)pec疫ies便wi捧th拐wor冤ld-萬wid患ed稻ist炭rib渣uti福on是In況ter凡nat提ion牛al.瘋Jo餡urn歐al貪of鄭Sys孝tem車ati惜ca陜nd傭Evo閉lut是ion允ary附Mi種cro篇bio色log姥y,浪200慰7,條57:于19膜25–頭193速2圖1:基于ITS憶DN詳A序列的到黑色曲蠢霉N-J樹Figu傲re1卻:A限Neig睜hbor訊Joi板ning斗Tre獨(dú)eof予Bla跟ckA趁sper育gill辛iba息sed歡onT漲heir侵ITS漿DNA柿Seq縮慧uenc調(diào)es.注：圖片準(zhǔn)來源于Recl做assi備fica平tion作of忘ATCC秀?16做404T倍Man難dAT鏡CC?到9642喂TMa加sAspe何rgil底lus冠bras冬ilie孫nsis焦.Pha陷rma齊ceu停tic油al基Mic麻rob竭iol望ogy俗Fo惕rum宅Ne掃wsl財(cái)ett映er,氣20唇08,申Vo事l.客14籠(10話):有2-1輪4四、微生秀物鑒定-鑒定實(shí)虛例2各種標(biāo)準(zhǔn)先中仍將繼盒續(xù)采用ATC摘C1呼640刺4作為質(zhì)沈控菌株。各類標(biāo)準(zhǔn)中，鴨其它被指勺定為參考近菌株的黑椅曲霉菌株(CMC概C(F賢)9溝800閘3),需要重新談復(fù)核鑒定。巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis）黑曲霉(Aspergillusniger)黑曲霉？四、微森生物鑒撐定-鑒定實(shí)例2形態(tài)學(xué)粘鑒定CYA培養(yǎng)基,2姓5°C培養(yǎng)7dBiol磚og鑒定生長(zhǎng)濁棕度試驗(yàn)ITS坦rD冶NA區(qū)序列分析ITS4囑:5-TC窩CTC甩CGC默TTA熔TTG螺ATA獻(xiàn)TGC郵-3ITS5惰:5-GG沾AAG撞TAA申AAG巷TCG賭TAA欄CAA覆GG-矩3β-微管蛋白灑基因序列分析Bt2a煉:5-GGT筍AACC糕AAAT生CGG做TGCT欲GCTT陜TC-3Bt2b舊:5-AC鍬CCT現(xiàn)CAG抖TGT射AGT除GA元CCC鵝TTG準(zhǔn)GC-薪3反應(yīng)體系怎：100討μL雖,1療0×擴(kuò)增緩沖去液10清μL;震DN醒A模板1μL災(zāi);d灘NTP瓣(每種2.5撥mm床ol/箏L)廢8μ左L;引物(10蛇μL由/L)各2.5爹μL窗;TaqDNA聚合酶(2.批5U染/μL莫)1.頂3μ型L;無菌超霸純水補(bǔ)脅足總體熄積100覽μL。反應(yīng)程序子：94°茄C5只mi議n;捧94°繭C1取mi恭n,腥55°虹C1芹mi講n,貍72°翼C1始mi兼n,喇30個(gè)循環(huán);72掌°C1銀0mi雁n,4座°C保存。四、微生習(xí)物鑒定-鑒定實(shí)例2形態(tài)學(xué)魯鑒定圖25°C培養(yǎng)7d菌種的則宏觀形警態(tài)和顯趕微形態(tài)Fig來Ma淺cro區(qū)mor遮pho臂log漸ya棋nd貧mic撥rom瓣orp迅hol票ogy霜on耽25絲式°C,距7形d注:A菌落形態(tài);B:分生孢子曠梗形態(tài)(×1父00);饞C:分生孢子盼形態(tài)(×綱400叔).Not覆e:饑A:哄Col鞏ony冶mo網(wǎng)rph繳olo伙gy,丙B:慕Co綱nid奇iop屬hor朝em衣orp腰hol至ogy偵(×瓦10堅(jiān)0);滿C:極Co代nid斥ial亦mo忌rph忍olo史gy燦(×庫400盒).該菌株的杰形態(tài)學(xué)特恐征符合黑騎曲霉A.燈nig嚴(yán)er的形態(tài)特辣征四、微盾生物鑒甜定-鑒定實(shí)例2Biol養(yǎng)og鑒定注:?:沒有生長(zhǎng);+:生長(zhǎng)旺危盛;w:微弱(邊界)生長(zhǎng);v:可變.Not蒜e:胞?:腳No雖gro剖wth芒;+孔:S國tro則ng難gro漆wth塞;w甜:W旅eak漆gr敬owt稈h;軌v:堤Var浪ied婆gr貸owt今h.表

碳源利用情況TableCarbonSourceUtilization碳源CarbonsourceATCC16888AspergillusnigerATCC16404AspergillusbrasiliensisCMCC(F)98003麥芽糖Maltose+?+β-甲基-D-葡萄糖苷β-Methyl-D-Glucoside+?+D-海藻糖D-Trehalose+?+L-蘋果酸L-MalicAcidv+?α-酮戊二酸α-Ketoglutaricacid?w?苦杏仁苷Amygdalin+?+D-果糖D-Fructose+v+四、微尼生物鑒夕定-鑒定實(shí)繞例2ITS橋rDNA區(qū)序列分析圖CMCC轟(F)9腳8003的ITS惠rDNA區(qū)序列和β-微管蛋白萍基因序列PCR擴(kuò)增結(jié)惹果Fig吳ITS雜rDN儀Aan輩dβ-沃tubu相l(xiāng)in蝕gene階PCR頑amp資lifi音cati澤onr笛esul笛tso踏fCM母CC(F傍)980欠03注:M某:D增L20啟00斬mar雪ker釣;1可:I唐TS尖rDN屯A區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果;2:云β-微管蛋白安基因PCR擴(kuò)增結(jié)果.Not殖e:井M:晨DL2屢000育ma溪rke料r;1星:I偽TS與rDN社AP脹CR蝦amp籌lif誼ica飲tio格nr歇esu踩lt壁;2秘:β-科tub臉uli巖ng綁ene芬PC吐Ra脈mpl軌ifi財(cái)cat智ion蜘re綠sul種t.表

ITS序列特殊位點(diǎn)堿基差異TableDifferenceofbasepositioninITSsequence堿基位點(diǎn)Baseposition140166172173AspergillusbrasiliensisIMI381727CCTCAspergillusnigerATCC16888ATAACMCC(F)98003ATAA注:以18S和ITS廉1區(qū)之間媽的TTAC屠CG序列中的州第一個(gè)“C”為1位點(diǎn).Note捏:Th打efi鈔rst披Cin局the典bor丘der背sequ女ence彎(TT究ACCG燃)of聰18S允and鹿ITS乓1is駐her授ede奔fine永das歌pos肺itio責(zé)n1.四、微生浩物鑒定-鑒定實(shí)例2ITS蠟rDNA區(qū)序列分析以18S和ITS1區(qū)之間的TTAC叛CG序列中妙的第一賽個(gè)“C”為1位點(diǎn)。140166172、173四、微擊生物鑒敵定-鑒定實(shí)棗例2ITS役rD恥NA區(qū)序列分析圖基于ITS區(qū)rDN變A序列的黑炎色組曲霉緣瑞的NJ系統(tǒng)發(fā)育蒙樹Fig蒸AN坐eigh糖bor追Join巾ing矛Tree銹of訪Aspe磚rgil鐘lus恩sect貓ion冊(cè)Nigr社i.b陳ased見on鑼Thei希rIT善SDN拳ASe導(dǎo)quen錫ces注:圖中發(fā)育鈴樹節(jié)點(diǎn)只老顯示Boo秧tst堪rap值大于50%數(shù)值,圖例為鞋遺傳距級(jí)離.Not俘e:遙Num共ber負(fù)sa獸bov霉eb銜r(shí)an碌che襲sa霸re案boo申tst墊rap度va蔥lue略s.按Onl鍵yv手alu辭es等abo袖ve疾50%畢ar眨ei擱ndi挨cat舌ed.畫Ba優(yōu)r,盲gen陸eti痕cd背ist哥anc笑e.CMCC截(F)9持8003與與A.n屑igerATC與C1小688高8聚類在分買類距離最淘近的一個(gè)鞋分支上,序列相似渣性達(dá)100木%。CMCC音(F)9睛8003與黑色組烘的其他種所序列同源機(jī)性也具有很遍高的相似踐性,序列同五源性均鋤在98.6獎(jiǎng)%?10帖0%之間。四、微種生物鑒尋定-鑒定實(shí)例2β-微管蛋白購基因序列分析圖基于β-微管蛋欣白基因盼序列的峽黑色組捉曲霉的NJ系統(tǒng)發(fā)夏育樹Fig糟Ne海igh拉bou惕r-j射oin薯ing未tr塘ee較bas徐ed棒on范β-t陣ubu飾lin卸se得que瞎nce灑da裹ta劍ofAspe喊rgil粘lussect求ion辦Nigr感i注:圖中發(fā)啟育樹節(jié)掌點(diǎn)只顯貸示Boot侮stra栗p值大于50%數(shù)值,圖例為有遺傳距詞離.Not顆e:彎Num戲ber顫sa膛bov攜eb怖ran銀che萬sa瀉re線boo壁tst公rap鄭va嫩lue劑s.其Onl功yv織alu架es亭abo粉ve誘50%遼ar啊ei稈ndi江cat割ed.墻Ba搭r,哨gen雞eti咬cd瘡ist粗anc曲e.CMC薯C(F很)98豬003與黑曲霉A.nig腰erCBS5伶54.6靠5T序列同源唱性為100%。CMC村C(F漸)98盆003與黑色組撤的其他種賓序列同源忌性均在94.7難%以下。結(jié)合形乳態(tài)學(xué)、較碳源利柱用情況劇和ITS澆rD哥NA序列系統(tǒng)宵發(fā)育分析棉等多相鑒岔定的結(jié)果,將CMC珠C(F賭)98火003鑒定為灶黑曲霉（Asp吉erg什ill魂us度nig噴er）。四、微生茶物鑒定-鑒定實(shí)例2五、微生炮物保藏菌種是進(jìn)行微敏生物學(xué)研鉛究和應(yīng)用半的基本材杠料，是發(fā)鄙展生物工顛程的重要察基礎(chǔ)條件帆之一，是錘國家的重必要生物資余源。菌種保藏董管理要求各保杜藏中心必屠須具有保尺藏菌種的屬詳細(xì)歷史至及有關(guān)實(shí)濟(jì)驗(yàn)資料。并對(duì)其疏所負(fù)責(zé)保閣藏的菌種富均應(yīng)采取修妥善、可助靠的方法保藏，避免菌種的污染或死撫亡?！吨袊ど锞N保藏荷管理?xiàng)l膚例》五、微生出物保藏制訂專霧門菌種工保藏管呆理制度識(shí)；同一株占菌種采獻(xiàn)用兩種夫以上保效藏方法錦保存；對(duì)只能采周用一種保爪藏方法的博菌株備份灶存放于兩裙個(gè)以上的附保藏設(shè)備沾中；對(duì)菌種坑的入庫孕和出庫思記錄入巷檔，實(shí)頂行雙人度負(fù)責(zé)制胃管理；設(shè)專人廊負(fù)責(zé)管啟理菌種揪保藏設(shè)枯施正常網(wǎng)運(yùn)行，幼定期檢飾修維護(hù)牢。五、微披生物保就藏微生物菌鋒種保藏方籮法基本原就理是在挑稱選優(yōu)良慢純培養(yǎng)掌物并使教其處于饑休眠狀揪態(tài)基礎(chǔ)摩上，人嫩為地創(chuàng)緞造一個(gè)映有利于潛休眠的寧環(huán)境，斑使其長(zhǎng)鍛期保存命后仍能君保持菌額種原有鎮(zhèn)的優(yōu)良您特性?；敬霛L施是低溫純、真空到、干燥。五、微生軟物保藏常用菌叛種保藏充方法定期移植條法液體石蠟盡法真空冷稠凍干燥慣法-80茄℃低溫凍燈結(jié)法液氮超礎(chǔ)低溫凍異結(jié)法定期移指植法亦稱傳代嶼培養(yǎng)保藏墻法，指將刺菌種接種宵于適宜的靈斜面培養(yǎng)借基上，最德適條件下慘培養(yǎng)，完浸成培養(yǎng)于4～6℃進(jìn)行保叔存并間裝隔一定瀉時(shí)間（3-6個(gè)月）進(jìn)鄉(xiāng)豐行移植培籠養(yǎng)的一種柳短期菌種首保藏方法稱。操作步蛛驟：斜面制活備挨接種齊培養(yǎng)文保藏斜面制舅備培養(yǎng)基略配制分辣裝滅筐菌擺放斜怒面接略種培養(yǎng)細(xì)菌37縫℃，1-2睬d酵母28~紡30℃，2~3洞d絲狀真菌26℃，5~7d保藏4~6℃保藏3~6個(gè)月培養(yǎng)和保拴藏定期移植盞法操作簡(jiǎn)忠單，使垮用方便磁；對(duì)設(shè)備和專人員要求徒不高；可隨時(shí)使組用，便于怕觀察菌種片；工作勞說動(dòng)強(qiáng)度座大，屬累短期保遮藏，保拿藏成本慈高；菌種傳代沫頻繁，易頑退化、污片染。液體石蠟烘法指將菌種畏接種在適蹈宜的斜面榮培養(yǎng)基上站，最適條直件下培養(yǎng)寸好后注入憲滅菌的液宇體石蠟，隔使其覆蓋付整個(gè)斜面良，再直立嗓放置于低滔溫（4～6℃）干燥處瓣進(jìn)行保存桿的一種菌她種保藏方篇法。操作步驟困：液體石蠟別預(yù)處理斜面培歪養(yǎng)物制波備灌注譽(yù)石蠟保尤藏優(yōu)質(zhì)化學(xué)謊純液體石朽蠟滅菌：—12憤1℃濕熱滅菌30mi案n，蒸發(fā)水部分；—16敞0℃干熱滅菌2h；冷卻至崇室溫。液面高出議斜面頂部1cm4～6℃，干燥處倦；直立放質(zhì)置；保藏時(shí)間1～2年。液體石蠟化法操作簡(jiǎn)單投，使用比脂較方便；對(duì)設(shè)備兇要求不境高，對(duì)陽人員操咐作水平墊有一定嚴(yán)要求；·菌種易退鄰化、污染州。真空冷瓣凍干燥錦法指將保藏?cái)赖木N細(xì)惹胞或孢子院懸浮于保貨護(hù)劑中，凳經(jīng)預(yù)凍后嘗在真空條嘩件下使水歲分升華，響再經(jīng)真空尸封存后?？痛娴囊环N甘長(zhǎng)期菌種抄保存方法骨。安瓿管的謎準(zhǔn)備清洗選用中性桶玻璃材質(zhì)算的安瓿管調(diào)；2%鹽酸浸泡8～10h，自來水候沖洗至中棉性，蒸餾等水沖洗2～3次；置于烘箱杠中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；標(biāo)簽激光打印番標(biāo)簽，標(biāo)廟明菌株編健號(hào)和保藏丸日期，大監(jiān)小約10×膨20m污m。噴碼于氣安瓿管跡外，160℃固定20m色in。滅菌121?！?，30mi灘n.保護(hù)劑的炒準(zhǔn)備保護(hù)劑：12%脫脂牛奶個(gè)蒸餾水溶只液，2～5ml夏/管；滅菌鍋加劉熱至沸騰藝，將牛奶支管放入鍋芝中，113℃滅菌20m恒in；打開放最氣閥緩輝慢排出虹蒸汽，取出滅得菌后脫男脂牛奶拴試管，魂迅速放批入涼水及中冷卻奸；30℃培養(yǎng)2天，無糧菌檢查男合格后鈔備用。凍干樣品飯制備制備斜痰面培養(yǎng)瓜物；將保護(hù)闊劑用無取菌吸管瀉注入到課斜面培草養(yǎng)物上朋，用吸丘管刮取龜斜面上古的菌體籠，使菌請(qǐng)?bào)w均勻般地懸浮員在保護(hù)盡劑內(nèi)。用長(zhǎng)毛細(xì)敗滴管將菌燃懸液分裝誘到安瓿管輕內(nèi)，0.1～0.2m旅l/管，操帶作時(shí)要喉把帶有計(jì)菌懸液士的長(zhǎng)毛旨細(xì)滴管普直接插憶入安瓿景管的底哈部，勿引使菌液劫沾在管悶壁上。真空干燥在開動(dòng)真坐空泵后應(yīng)懇使真空度傻在15m災(zāi)in內(nèi)達(dá)到66.擊5Pa，隨后義逐漸達(dá)楊到26.準(zhǔn)6～13.韻3Pa，在此條蒼件下，樣丑品將保持篇凍結(jié)狀態(tài)色，其中水維分則不斷科升華，干芝燥才能順總利地進(jìn)行孔。終止干燥堤時(shí)間應(yīng)根倍據(jù)下列情掠況判斷：安瓿管漂內(nèi)凍干揭物呈酥度塊狀或浩松散片喇狀真空度泄接近空塵載時(shí)的鍋?zhàn)罡咧禈悠窚囟群扰c管外溫蔑度接近選用1～2支對(duì)照搶管，其埋水份與斃菌懸液漲同量，震當(dāng)其水陰分完全游蒸發(fā)時(shí)統(tǒng)視為干剖燥完結(jié)預(yù)凍制備菌廣懸液、質(zhì)經(jīng)分裝陳到進(jìn)行積預(yù)凍之庫間的時(shí)捉間不宜探超過1h；分裝完道成后將吵安瓿管臉立刻放芬入－35～－40℃冰箱預(yù)凍1h，使菌液拔完全凍結(jié)葵；可采用形分段式肅預(yù)凍，談先將分邁裝好的廣安瓿管菠置－20℃凍30分鐘，再樹放入－80℃冰箱凍30m賽in；采用離心古式凍干裝機(jī)置時(shí)勿需叨預(yù)凍。熔封將安瓿管韻的中上部襯用火焰燒屬軟，拉成將細(xì)頸；將安瓿鹿管裝到另多歧管糾上，用降火焰在萌細(xì)頸處斥熔封；拉管時(shí)注牧意火焰不每要離菌體記太近。真空度檢絡(luò)測(cè)用高頻電叛火花檢查細(xì)各安瓿管嫩的真空情愉況，如管兼內(nèi)呈現(xiàn)灰默藍(lán)光，說明擦真空度符威合要求。保藏4～6℃下避光保鳥藏，一般可?；I藏8～10年。真空冷夜凍干燥觸法保藏、運(yùn)寧輸方便；保藏時(shí)扒間長(zhǎng)(5～10年)；對(duì)設(shè)備盲要求高(真空冷凍伯干燥機(jī)、鐘多歧管)，對(duì)人員芽操作水平躁要求高；冷凍干椅燥過程授對(duì)菌體攜有損傷轎，需恢謙復(fù)培養(yǎng)泰。-80憤℃冰箱凍雅結(jié)法將菌種懸鼻浮于保護(hù)撕劑中，在閑－80℃冰箱中笨?jī)鼋Y(jié)保核存的一印種長(zhǎng)期革菌種保稠藏方法趴。準(zhǔn)備冷凍幸管準(zhǔn)備保護(hù)是劑（10%宗-15運(yùn)%甘油）準(zhǔn)備菌懸店液（細(xì)胞律、孢子或疊芽孢懸液襯）制備冷凍緩管（取菌怕懸液和保焦護(hù)劑至冷銳凍管）保藏（-80℃，2～5年）Micr聾oban貓k-80℃冰箱凍結(jié)用法使用方疲便；保藏時(shí)擱間較長(zhǎng)頃；對(duì)設(shè)備要憂求高(-80泡℃冰箱)；運(yùn)輸不方燭便。液氮超風(fēng)低溫凍溜結(jié)法指懸浮配于保護(hù)段劑中的呢菌種經(jīng)紛程控降日溫后，江移置于圈－196℃的液氮戀或－150記℃左右的階液氮?dú)夤P相中保息存的一剪種長(zhǎng)期誘菌種保徹藏方法棉。操作步驟冷凍管隨準(zhǔn)備保護(hù)劑漁制備保藏培養(yǎng)墊物準(zhǔn)備預(yù)凍—將程序降繩溫系統(tǒng)預(yù)惜冷到4℃，將制雕備好的耍冷凍管媽放入其沿中，以1℃/m道in降溫速率妻降至-35℃；—使用程蛋序降溫深盒。保藏將預(yù)凍贊后的冷撐凍管轉(zhuǎn)爐移至液吼氮?dú)庀?-1搏50℃拼)或液相(-19殿6℃)。同“－80℃冰箱凍結(jié)夫法”液氮超低龍溫凍結(jié)法保藏時(shí)間慣長(zhǎng)；保藏效譽(yù)果好，問菌種不裕易退化磨；對(duì)設(shè)備襯要求高(程控降槍溫儀、歲液氮罐)，對(duì)人營員操作籍水平要哈求高；保藏成衣本高。不同保渣藏方法管的比較六、質(zhì)醫(yī)控微生譽(yù)物保藏菌蓄株要求藥品微必生物檢延驗(yàn)用的惰試驗(yàn)菌蓮應(yīng)來自槳認(rèn)可的國內(nèi)或國礦外菌種收販藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌揀株，或使困用與標(biāo)準(zhǔn)帳菌株所有祖相關(guān)特性燈等效的商業(yè)派暈生菌株。92201夫0版中國藥飯典《藥品微生畜物實(shí)驗(yàn)室拾規(guī)范指導(dǎo)慣原則》國內(nèi)認(rèn)可秩的菌種收盡藏機(jī)構(gòu)197與9年7月，全國展第一屆菌支種保藏管酒理會(huì)議正劫式成立中籃國菌種保影藏管理委姜員會(huì)（CCCC漢M），委訴員會(huì)下撕設(shè)7個(gè)全國性富菌種保藏談管理中心越及機(jī)構(gòu)所博在地：普通微生綿物菌種?？植毓芾碇薪硇模–CGM谷C）,中國科學(xué)雙院微生物殺研究所農(nóng)業(yè)微接生物菌賢種保藏摩管理中甚心（ACCC）,中國農(nóng)加科院區(qū)獅劃所工業(yè)微郵生物菌善種保藏井管理中兄心（CICC），中國俊食品發(fā)酵綠工業(yè)研究答院醫(yī)學(xué)微生煌物菌種保宏藏管理中花心（CMC愉C），中尋國藥品禁生物制最品鑒定茅所抗菌素菌跌種保藏管獎(jiǎng)理中心（CACC），中幼國醫(yī)科默院醫(yī)用訴生物技咽術(shù)研究計(jì)所獸醫(yī)微姥生物菌討種保藏打管理中餡心（CVC購C），農(nóng)個(gè)業(yè)部獸標(biāo)醫(yī)藥品良監(jiān)察所林業(yè)微生撤物菌種保炒藏管理中董心（CFC碎C），中國毫林業(yè)科學(xué)排院國認(rèn)外可孟的菌種收掠藏機(jī)構(gòu)世界菌種御保藏聯(lián)合弊會(huì)WFC庫C(纏Wor舊ld竭Fed矮era艦tio將nO右fC土ult嫌ure況Co文lle聲cti慌on)全球注表冊(cè)的菌厲種保藏草機(jī)構(gòu)583家ATCCNRR議LDSMZNCTCCMICBSNBR邁C(IFO蘆)JCM菌株代泉數(shù)美國藥雙典（USP）中規(guī)訪定：“將微生崖物接種產(chǎn)至一新虹鮮培養(yǎng)差基上/