第一組蛋白質立體結構的測定

第一組蛋白質立體結構的測定第1頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三NMR

(nuclearmagneticresonance)核磁共振第2頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三前言簡介約15,000種蛋白質的三維結構已被解出，80%是用X-ray解出，20%用NMR解出NMR解出三維結構時不需要長單晶(singlecrystal)，只要溶在水溶液當中即可，比較符合生物巨分子的生理狀態(tài)。第3頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三NMR產生訊號的原理

1.C、N、H、S等atoms的同位素label→l不等於0→始可產生NMR訊號〈補充〉每個元素中的核子(nucleus)，其磁自旋量子數

(magneticspinquantumnumber)以I

來代表。

若I≠0

，此核子在磁場中，會產生NMR訊號

若I=0，此核子在磁場中，無法產生NMR訊號。

質量數和質子數均為偶數的原子核，l=0質量數為奇數的原子核，l=半整數

質量數為偶數，質子數為奇數的原子核，l=整數

第4頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三核磁共振儀的射頻器(transmitter)打了一個脈衝(pulse)，將此淨磁化量偏移z軸，此偏移的磁化量就沿著磁場方向(z軸)做進動(precession)。造成此磁化量形成陀螺的軌跡，如下頁圖所示。此磁化量的軌跡，會引導一個振盪電流而被記錄下來。第5頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三2.從NMR的peakarea和高度比可知特定原子的數量和原子鍵結的環(huán)境。第6頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三NMR的光譜分析一維：H太多→訊號複雜→難以分析第7頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三二維：NOE效應→可得知原子間的距離第8頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三三維：NOE效應+TOCSY技術+NOESY技術

→

旋性、凡得瓦半徑、鍵角

→輸入computerrun出可能的三度結構第9頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三〈補充〉NOE效應

(NuclearOverhouserEffect)

NMR之所以能解出蛋白質分子在水溶液的三維結構，主要的就是要靠NOE效應。NOE＝(I′

－I0)/I0I′為質子對被照射時的intensityI0

為質子對未被照射時的intensity如果NOE愈強，表示二質子間距離愈短。NOE的大小與質子對之間距(γ)的6次方成反比：NOE∝1/γ6第10頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三NMR的研究領域一、蛋白質與分子之結合(Interaction)

利用核磁共振技術我們可輕易地藉由測量化學位移擾動(chemicalshiftperturbation)的方式找出protein與ligand作用的殘基，亦可進一步解出整個complex的結構?；瘜W位移的擾動主要是因為protein與ligand結合後某些殘基會和ligand接觸或作用，而使得化學環(huán)境改變，藉由測量各個殘基化學位移的變化情形，便能找出ligand的結合位置(活性位置)。第11頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三

二、蛋白質分子之折疊(ProteinFolding)

自然界中所存在的折疊構形約只有1,000-5,000種。且有許多蛋白質屬於同一個family，具有高度的sequencehomology。定出這1,000-5,000種蛋白質的折疊構形並研究這些構形所具有的生化活性，便能提供其他屬於同family的蛋白質在結構與功能上的資訊。第12頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)缺比較

X-ray繞射技術

§快速且較不受分子量的限制

§但是並不是每一種蛋白質都能得到良好的結晶，(蛋白質結晶的取得仍是現今結晶技術的一大挑戰(zhàn))核磁共振

§找尋蛋白質結構較耗費人力及時間

§圖譜分析的工作是既複雜又費時

第13頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三X-RayCrystallography第14頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三原理:所謂X-Ray繞射結晶法即是利用X-Ray射向蛋白質晶體使X-ray產生繞射，經由繞射使照相底片曝光而產生一投影圖形，再將此繞射圖案作分析，作出電子密度圖，經過一連串的計算之後，即可判定出蛋白質的立體結構!

Why要使用X-Ray?

我們採用X光來決定蛋白質的結構，最大的理由，即是因為X光的波長10-12-10-8m恰好近似於蛋白質晶體的晶格大小，因而可以產生繞射，且由於X光無法聚焦，因此我們必須使用底片曝光法來分析繞射所得的結果。第15頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三X光依形成的方式不同，分成兩種：

(1)Whiteradiation:

以經高壓加速之電子撞擊陽極靶標，高速電子受到靶標原子的阻擋，急遽停止下來，其部分動能即以X光的形式釋出來。以急遽停止電子所產生之X光與原子之特性無關，而是以連續(xù)性不同波長同時出現，其中最短波長取決於撞擊電子的最高能量。如此產生的光譜，亦稱為白光光譜或連續(xù)光譜(ContinuousX-rayspectrum)。

(2)Monochromaticradiation:

高速電子在撞到原子時，很容易將能量傳遞給原子中的電子，而使原子離子化。當原子內層軌域之電子被激發(fā)後，其空出之位置很快會被外層電子的躍入填滿，在此電子躍遷過程中，由於不同軌域間的能階差，X光會隨著放出；此種過程所產生的X光與原子中電子軌域之能階有關，因此其波長與原子種類有關，稱之為特性輻射，所形成之光譜則稱為特性光譜(characteristicspectrum)。第16頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質結晶製備!!X光繞射結晶法當中很重要的一個條件就是sample的製備，若是不可結晶，則鐵定不能進行X光繞射。蛋白質要結晶，首先必須要先大量製備我們所要結晶的蛋白質，因此會裡用載體將記載蛋白質序列的核酸輸入到生產蛋白質的菌體中，如此便可大量製造出純度高的蛋白質，而後氣相擴散法將此蛋白質結晶出來。結晶方式:用氣相擴散法結晶(VaporDiffusionMethod)，也就是將含有高濃度的蛋白質溶液加入適當的溶劑，慢慢降低蛋白質的溶解度，使其接近自發(fā)性的沉澱狀態(tài)時，蛋白質分子將在整齊的堆疊下形成晶體。第17頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三NMR與X-Ray的比較X-ray的缺點主要是結晶難結，也並非所有蛋白質都容易結晶。一旦結晶了，又要擔心他跟平時會否有異，譬如某些水溶性的蛋白質，原本水分子能協(xié)助固定有功能的構型，將其結晶後，離開了水的環(huán)境，失去固定而變成另一種沒有功能的構型。相對的，NMR的原理不同，並不需要整齊的晶體排列，而是看原子核的磁力矩。NMR不需要結晶，也就避開了許多X-ray繞射的缺點；NMR可以看到生物分子在正常生理狀態(tài)下的構型，可以觀察到連續(xù)的動態(tài)結構，比較不會受到水分子的干擾。有一點值得注意的是，NMR用低能量的無線電波，而X-ray繞射要用高能量的X-ray，能量差距相當的大。雖然NMR看似比X-ray繞射有更多的好處，但NMR有一個嚴重的缺點：只能觀察20000原子量以內的分子。因為NMR是觀察一個一個的原子，X-ray繞射則是觀察一個一個的晶格；NMR的視野被侷限在原子大小，但是X-ray可大可小，他能觀察金屬原子的晶體，也能觀察生物巨分子的晶體。我們不能直接判斷NMR跟X-ray繞射孰優(yōu)孰劣，兩者是互補的關係。第18頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三水的影響蛋白質結晶中常含40~60%的水，其液態(tài)的成分會使晶體易碎，且容易使蛋白質分子在排列上有不規(guī)則的情形出現，造成繞射數據的混亂。但是，若是完全除水的晶體，蛋白質的狀態(tài)又與自然環(huán)境下不同，因此水是個很令人頭痛的問題。第19頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CircularDichrosim(CD)圓二色光譜第20頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三PolarizerEvectors平面偏振光振動方向保持不變振幅發(fā)生周期性變化平面偏振光第21頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三

兩束相互垂直而相位相差1/4的波長的平面偏振光可以加和成一束圓偏振光平面偏振光疊加成圓偏振光第22頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三振幅保持不變，而方向周期變化，電場向量繞傳播方向螺旋前進圓偏振光(circularpolarizedlight)第23頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三朝光源看，電場向量方向按順時針方向旋轉的，稱為右圓偏振光；電場向量方向按逆時針方向旋轉的，稱為左圓偏振光。第24頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三圓二色性(circulardichrosim)光學活性分子對左、右圓偏振光的吸收也不同，使左、右圓偏振光透過後變成橢圓偏振光，這種現象稱為圓二色性。第25頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CD的操作方法左圓、右圓的平面偏振光照射有光學異構的分子，會造成不一樣的吸光度。而不同的結構有獨特的測出來的吸收圖形，因此可以經由比對得知立體結構第26頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CD對蛋白質二級結構的研究方法:將待測蛋白質溶於適當溶劑中，用特定波長的UV測其吸收度，與已知的二級結構的吸收度圖比對，即可查出未知之結構建立資料庫:選取基本的二級結構，將各波長不同的CD吸收值代入程式可得蛋白質中各種二級結構之百分比第27頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三第28頁，共30頁，2023年，