專利申報(bào)fgffgf18說明書一種重組人成纖維細(xì)胞生長因子FGF 18的生產(chǎn)方法

FGF18是FGF的一個新成員，是一種可分泌蛋白。1998年，科學(xué)家Ohbayashi首次從老鼠胚胎中分離得到了FGF18。人FGF18編碼一個207氨基酸組成的蛋白序列，分子質(zhì)量約為23kDa人FGF18定位于5q34，共有5個外顯子與已發(fā)現(xiàn)的FGFs其他成員有30%~70%的同源性序列分析結(jié)果表明，F(xiàn)GF18是由207個氨基酸組成的高度保守的序列，小鼠FGF18與99.5%99%的同源性。在結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)GF18FGF8、FGF17相似，為同一亞成員，具有70%~80%的氨基酸序列同源性。FGF18的表達(dá)與FGF8、FGF17的空間表達(dá)形式類似，但在時(shí)空表達(dá)形式上，F(xiàn)GF18FGF8、FGF17不完全相同。其在骨骼生長發(fā)育過程中扮演體外和體內(nèi)的多項(xiàng)研究表明，F(xiàn)GF18在形態(tài)發(fā)生、血管形成、腫瘤生長和其他細(xì)胞發(fā)育過程中也發(fā)揮1818。據(jù)，18在長骨發(fā)育過中的軟膜內(nèi)和顱發(fā)育過中成骨充質(zhì)細(xì)中顯著表達(dá)。18在骨骼發(fā)育的具有可替代作用此外，18敲除的鼠肋骨形導(dǎo)致腔體積的減，可能呼衰竭，被懷疑是18敲除鼠早期的原之一，時(shí)還FGFR3小鼠中未觀察到的。因此，在抑制作用。Kapadia等的研究進(jìn)一步證實(shí)了，F(xiàn)GF18在胚胎發(fā)育期可抑制骨軟骨細(xì)胞增殖和分化。恰恰相反在成年18在其他軟骨組（除了長面的骨細(xì)胞有正向用據(jù)，18Elswrh等研究顯示介轉(zhuǎn)移18到小鼠外耳激細(xì)的增殖致軟細(xì)胞數(shù)的增蛋白糖表達(dá)以及型膠原蛋白的上升。最近的顯示，在軟骨細(xì)胞增殖過程中，18合成作用增強(qiáng)可18（M）外，Shimokawa等的研究進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)，F(xiàn)GF18與消化系統(tǒng)保持平衡的相關(guān)性，并提出了提高FGF18表不對稱胚胎的發(fā)育。（HuMCetal.MolCellBiol,1998,18(10):6063-6074;OhbayashiNetal.JBiolChem1998,273(29):18161-18164;IwataTetalHumMolGenet2000,9(11):1603-1613;OhuchiHetalDev,2000,95(1-2):55-66;EllsworthJLetal.OsteoarthritisCartilage,2002,10(4):308-320;OhbayashiNetal.GenesDev,2002,16(7):870-879;ShimoakaTetal.JBiolChem,2002,277(9):7493-7500;DiannDSetal.DevDyn,2003,226(4):663-674;UsuiHetal.BiochemBiophysResCommun,2004,322(3):887-892;KatohMetal.IntJMolMed,2005,16(3):493-496;KawanoMetal.JInvestDermatol,2005,124(5):877-885;MooreEEetal.OsteoarthritisCartilage,2005,13(7):623-631;SmithSMetal.ArchBiochemBiophys,2007,468(2):251;GrecoVetal.CellStemCell,2009,4(2):155-169;BehrBetal.TissueEngPartA,2011,17(15-16):2061-2069;PlikusMVetal.JInvestDermatol,2012,132(5):1321-1324;LongFetal.ColdSpringHarbPerspect2013,因此，F(xiàn)GF18的發(fā)現(xiàn)對于骨骼性疾病以及癥的治療有著重要意義。對于FGF18的研究以及白表達(dá)水平低，同時(shí)很難具有高活性的蛋白。這些已經(jīng)構(gòu)成了FGF18基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的瓶頸問題。Huetal.利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)FLAG的FGF18，然而，哺乳動物表達(dá)細(xì)胞更加復(fù)雜和昂貴的，很難利用大規(guī)模發(fā)酵過程。而且，F(xiàn)LAGFGF18的生物活性。2012年，Jeonetal.利用大腸桿菌TOP10細(xì)胞表達(dá)His6-FGF18，雖然添加了His有利于蛋白的純化，但增加了免疫原目前國際上的FGF18大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)工藝，為方便純化都融合（His,GST,Trx等）來CM-SepharoseFF陽離子交換和肝素親和柱分離純化目的蛋白，最終獲得蛋白純度超過95%的具有較高生物學(xué)活性的FGF18重組蛋白，為今后開展生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。FGF18DNA的載在本發(fā)明的第一方面，提供了一種優(yōu)化后的表達(dá)人成纖維細(xì)胞生長因子-18的序列，提高了成纖維細(xì)胞生長因子-18的表達(dá)量。在本發(fā)明的第二方面FGF18正確編碼序列應(yīng)用BamHI和NdeI酶切后插入到表達(dá)載長因子-18的DNAOrigima(DE3)。該菌體的能促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長因子-18蛋白的二硫鍵正確折疊。FGF18；通過低溫高速離心獲得含外源蛋白FGF18pET3c-rhFGF-18，或者所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。司)；2：pET3c-FGF-18質(zhì)粒；3：pET3c-FGF21NdeI+BamHI酶切。2、3hr；6、7：22、3hr5hFGF18Western檢測圖1：FGF18核苷酸序列表在另一優(yōu)選例中，用本發(fā)明優(yōu)化的rhFGF-18Origima(DE3)，經(jīng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)，rhFGF-18以可溶、活性形式存在，同時(shí)簡便純化工藝，通過超聲破碎方法，即可得到純度達(dá)95％的純品，獲得高表達(dá)、高得率、極具價(jià)值的一種生產(chǎn)rhFGF-18的方法Origima(DE3)。位點(diǎn)，然后克隆入含IPTG誘導(dǎo)的啟動子的表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化與表達(dá)載體相容的大腸桿菌宿主菌，經(jīng)篩選鑒定后獲得工程菌。本發(fā)明的工程菌屬于IPTG誘導(dǎo)型。（DONH4Cl0.4-1％。0.1-1mM。50.1-0.52-5％。溶氧（DO）3050％以上；pH6.8-7.0，誘導(dǎo)階段控制在7.2-7.435-37℃23-25℃；在發(fā)酵表達(dá)rhFGF-18CM-SepharoseFF在本發(fā)明的一個實(shí)例中，選擇了有助于真核在原核細(xì)胞中正確翻譯的IPTG誘導(dǎo)型啟動子的18工程菌（大腸桿菌。經(jīng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)，rhFGF-18以可溶形式存在；表達(dá)占菌體總18rhFGF-18100mg95％以上。純化后原液加入適當(dāng)輔料，制成rhFGF-18的凍干粉劑。初步穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該粉劑穩(wěn)定。品約100mg或，因此適合生產(chǎn)。化工序，提高了成品率和蛋白的活性，使大規(guī)模生產(chǎn)rhFGF-18成為可能。根據(jù)已知的rhFGF-18的天然氨基酸序列，按照大腸桿菌子偏愛性并考慮消除發(fā)夾結(jié)構(gòu)等不利于表達(dá)的二級結(jié)構(gòu)，在不改變氨基酸序列的條件下，設(shè)計(jì)rhFGF-18PCR擴(kuò)rhFGF-18的全長目的序列。宿主菌為大腸桿菌Origima(DE3)。參見圖3，用NdeI和BamHI雙酶切分別處理rhFGF-18和表達(dá)載體pET3c，37°C酶切3小T4DNA16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，在含有氨芐青酶及NdeI+BamHI在37°C反應(yīng)3小時(shí)，得到在pET3c中插入了rhFGF-18的重組質(zhì)粒pET3c-PCR4NdeI+BamHI雙酶切時(shí)，621bppET3c中。4行正、逆向序列分析，委托Invitrogen公司進(jìn)行序列的測定，證實(shí)克隆序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。搖瓶試驗(yàn)，該工程菌培養(yǎng)后，經(jīng)IPTG325％左右。218株將含有目的的工程菌分別進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)經(jīng)IPTG(或糖)誘導(dǎo)3小時(shí)后含質(zhì)粒pET3c-5％左右。這表明，pET3c-rhFGF-18表達(dá)載體優(yōu)于其他表達(dá)載體。3挑取實(shí)施例1中的轉(zhuǎn)入pET3c-rhFGF-18的大腸桿菌Origima(DE3)單克隆，接種到含50mlLB1000mL8-10hOD6006-81:10上罐發(fā)濃度稱量LB11LB1５1５21將含有目的的表達(dá)菌株的甘油菌接種到含50mLLB培養(yǎng)液的250mL三角燒瓶中，培養(yǎng)3-4h，待OD600達(dá)到0.8-1.0，按1:10的比例接種于含250mL改良液的1000mL三角燒瓶中，培8-10hOD6006-81:10上罐發(fā)酵，流加碳源（葡萄糖或甘油6.8-7.037°C、DO>30OD60015-18lmMIPTGSDS檢測(并掃描)、測定蛋白含量。50ghFGF-18的生產(chǎn)效率。rhFGF-184°C5000rpm10min10mL/g加入裂解緩沖液20mMTris-HC1mMEDTA,1mMPMSF0.05%80,5mMβ-巰基乙醇）重懸菌體，在冰浴下超聲10min，1200rm清溶液存于EP管內(nèi)，保存于冰上，用于下一步的分離純化。11(陽離子交換)：層析介質(zhì)：CM-SepharoseFF緩沖液：溶液APB(20mM，pH6.5+25mMBPB(20mM，pH6.5+1.2MCM陽離子交換柱。：上樣后用10CV的溶液A層析柱梯度：后用20CV將溶液B從0％升至100％，時(shí)間梯度90min。FGF-18樣品峰。A：PB20mM，pH6.5)+25mMB：PB(20mM，pH6.5)+1.5M：上樣后用10CV的溶液A層析柱梯度：后用20CV將溶液B從0％升至100％，時(shí)間梯度90min。FGF-21樣品峰。MTThFGF18NIH3T3hFGF18NIH3T3hFGF1實(shí)施例1FGF18的PCR合成及序列測根據(jù)FGF18去除信號肽的氨基酸序列，添加本實(shí)驗(yàn)中所用到的酶切位點(diǎn)，同時(shí)利用大腸菌偏進(jìn)行優(yōu)化，交于合成公司合成。再次，利用軟件PrimerFinder及DNASTAR設(shè)計(jì)FGF18引物，共2條，目的（hFGF18）通過PCR擴(kuò)增獲得。最后通過菌落PCR、NdeⅠ-BamHFGF21基因合成PCR擴(kuò)增體系10*EXTaqEXTaq反應(yīng)參數(shù)：94°C 0.5min55°C 0.5min72°C 1min經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測無非特異性條帶后，用DNA膠回收試劑盒純化回收，得到含有目的基因FGF18的片段。菌液PCR驗(yàn)證體系：10*EXTaqEXTaq總體 反應(yīng)參數(shù)：94°C 0.5min55°C 0.5min72°C 1min樣 體經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察在621樣 體NEBbuffer4

總體 37°C，酶切3h1%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察在621bp處是否出現(xiàn)目的條帶。以F，R為引物，通過PCR擴(kuò)增獲得含有FGF18的。用NdeI和BamHⅠ雙酶切，與同樣用pET-3cE.coliDH5αPCR和酶切鑒定初步正確的重組質(zhì)粒鑒定。經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的pET3c-FGF18核苷酸序列正確。3FGF18蛋白的獲得將正確的pET-3c-FGF18轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Origima(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，氨芐青霉素抗性平OrigimaDE3pET-3cFGF18單菌落，接種到LB培間等表達(dá)條件的優(yōu)化。經(jīng)研究證實(shí)，OD600值為0.5時(shí)，1mMIPTG在25°C誘導(dǎo)12h，超聲波（100w，上清，先進(jìn)行CM-SepharoseFF純化，用20MPB（pH6.5，25mmol/LNaCl）和20Mm1.2MNaCl）進(jìn)行梯度洗脫。收集吸脫峰組分，把目的組分再進(jìn)行肝素親和樹脂親和層析，用結(jié)合緩沖液（20mMPB，pH6.5，25mMNaCl）平衡Ni-NTA樹脂，將裂解液到平衡好的樹脂柱中，上樣完畢后用洗滌緩沖液（20