原代腫瘤細胞的分離培養(yǎng)

原代腫瘤細胞的分離培養(yǎng)實驗目的：從新鮮人體標本中分離腫瘤細胞實驗器材：新鮮人體乳腺癌組織膠原酶（Ⅰ、Ⅳ型膠原酶干粉溶解于DF12培養(yǎng)基，濃度1mg/ml），DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，PBS，雙抗（青鏈霉素，100×）手術器械，培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶，離心管，恒溫搖床，離心機，倒置顯微鏡，細胞培養(yǎng)箱實驗原理：酶消化法是把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶。胰蛋白酶是一種胰臟制品，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質中的蛋白質水解而使細胞分散開，適于消化細胞間質較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，如

乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等，它對細胞間質有較好的消化作用，對細胞本身影響不大，可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害。本實驗就使用Ⅰ、Ⅳ型膠原酶對乳腺癌組織進行消化，以獲取原代乳腺癌細胞。實驗步驟：將新鮮乳腺癌組織置于培養(yǎng)皿中，加入適量ＰＢＳ，使用眼科鑷和眼科剪去除組織上的血液（血塊）、脂肪、壞死組織及結締組織，保留腫瘤細胞豐富的區(qū)域，并用ＰＢＳ清洗兩遍。將癌組織放入新的培養(yǎng)皿中，加入少量DMEM培養(yǎng)基，使用眼科剪將組織剪成約1mm3大小的碎塊。轉入15ml離心管中，用PBS沖洗數遍，組織塊自動下沉后，除去PBS。將組織塊轉入培養(yǎng)瓶中，加入5ml膠原酶和雙抗（稀釋至2×），吹散組織碎塊，置于３７℃恒溫搖床上消化組織，調節(jié)速度150r/min，每隔30min待組織塊鏡下透光性良好，呈絮狀時，轉入15ml離心管中，1300r/min離心5min，棄上清。加入PBS洗滌數次，反復吹打后，1300r/min離心5min，棄上清。加入DMEM完全培養(yǎng)基（含1×雙抗），反復吹打，轉入培養(yǎng)皿中，鏡下可見單個細胞及細胞團，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。注意事項：全程嚴格無菌操作。取材要注意新鮮和保鮮。取材和原代細胞制作時，要用鋒利的器械，盡可能減少對細胞的機械損傷，切碎組織時應避免組織干燥。若組織在消化時間較長時仍未散開，可采用多次提取消化法以減少酶對已消化下來的細胞的損傷?；罴毎ぷ髡痉治黾夹g一、本顯微鏡主要觀察方法簡介明場：適合常規(guī)鏡檢、病理、染色樣品的觀察方法。此觀察方法優(yōu)點是視野亮度高、均勻，應用范圍廣，操作簡單。缺點是：透明標本對比度低，標本沒有立體感。相差：利用被檢物體的光程（折射率x厚度）差進行鏡檢，即利用干涉現象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹睢ｈb定活體細胞最實用、最經濟的方法。熒光：物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質吸收短波光，發(fā)射出的長波光。熒光顯微鏡利用熒光光源激發(fā)樣品中的熒光物質，檢測激發(fā)光的情況以上各種觀察方法配合活細胞孵育裝置，即可完成對活細胞的各種觀察要求。活細胞孵育裝置通過軟件或TFT觸摸屏中Incubation模塊進行精細的調節(jié)。二、系統開關機開機順序打開顯微鏡電源總開關打開顯微鏡開關拍熒光時打開熒光光源打開電腦及軟件關機順序先關軟件，然后是熒光光源、顯微鏡開關、電源開關?。∪?、明場觀察成像操作流程1.開總電源,顯微鏡開關(“ON/OFF”)孵育裝置及電腦2.打開鹵素燈的光閘“TL”使光線透過聚光鏡穿透樣品3.調節(jié)光強，光路100%轉到眼睛4.聚光鏡打到H位5.反射鏡轉輪打到BF明場位置6.低倍（如10X倍）下觀察樣品，通過X/Y拉桿移動載物臺至目標位置，并通過粗細調焦旋鈕聚焦，然后再調至高倍7.準備拍照了，首先光路切換至相機8.打開軟件，點開Live按鈕9.先曝光Exposure——對照Live結果進一步精細聚焦——調節(jié)曝光時間——如果彩色模式拍照需要做自動或互動式白平衡（Whitebalance，Interactive）——再次曝光后——Snap成像——保存Save10.拍照完畢，先關軟件，再關顯微鏡，孵育裝置及電腦四、相差觀察成像操作流程1.開總電源,顯微鏡開關(“ON/OFF”)孵育裝置及電腦無菌操作。Western操作步驟收集細胞，加入100μl裂解液和1μl蛋白酶抑制劑（比例100:1），置于冰上30min；4℃離心，15000rpm，15min吸上清液于新EP管中（約60~80μl）；按BCA蛋白質定量試劑盒操作說明測蛋白質濃度；加入電泳加樣緩沖液（與吸取的上清比例為1:4），煮沸10min，緩慢恢復室溫后，稍離心，可置于-20℃制備凝膠：將洗凈且干燥的兩塊玻璃板底端對齊后安放在灌膠支架上，參照分離膠配制體系依次加入各個組分，混勻。將配置好的凝膠，沿玻璃板的一角小心緩慢注入，防止產生氣泡。根據梳子深度確定灌制高度，通常距離矮板至少2cm，灌好后，注入酒精或水封膠。此時可按照配方配制5%濃縮膠，注意TEMED在灌膠前再加入。靜置一段時間待凝膠聚合（約30min）。凝膠聚合后，棄去封膠溶液，并用吸水紙吸干。往濃縮膠里加入適量TEMED，混勻后緩慢灌入到膠槽至矮板頂部，插上梳子，操作時避免產生氣泡。靜置一段時間（約30min）至凝膠聚合。8、上樣及電泳：安裝電泳槽，注意確保內槽不漏緩沖液，往電泳槽加入足量電泳緩沖液，緩沖液要淹沒過玻璃板和凝膠。吸取適量樣品和分子量標準Marker，緩慢加入至膠孔。注意：加樣太快會使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出；加入下一個樣品時，要注意更換槍頭，以免交叉污染。上樣完畢后，蓋上電泳槽蓋子，接通電源，設置電泳條件，恒壓100-120V（可以先80V，待跑過濃縮膠后加至100V或以上）。電泳至溴酚蘭剛跑出即可關閉電泳儀停止電泳。9、轉膜：將玻璃板從電泳槽中取出，用塑料切膠器在玻璃板的兩邊輕輕撬動，至到小玻璃板開始松動。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，注意不要把分離膠刮破。PVDF膜預先用甲醇浸泡5min，然后將轉印膜、印跡濾紙和海綿墊浸泡于轉移緩沖液中10min。膜和印跡濾紙的大小應裁剪至與膠的大小相當。在黑色面板上放置一層海綿墊，并依次放置至少3層印跡濾紙、凝膠、轉印膜和至少3層印跡濾紙。放置膜時盡量一次性準確放置，凝膠與轉印膜一旦接觸就不要再移動，并記住膜與膠的接觸面。玻璃試管輕輕滾壓濾紙擠出氣泡，并用海綿覆蓋。關上轉印夾，合上鎖扣。安裝好的轉印夾應該使膠緊密地與PVDF膜接觸而不被擠壓。將組裝好的夾子裝入轉移電泳槽中，要使夾子的黑面對槽的黑面。添加電轉緩沖液，蓋好蓋子，開啟并設置電轉條件，一般用150mA1-2h。注意：電泳轉移時會產熱，需要在電泳槽的一邊放一些冰來降溫。免疫反應：印跡后的PVDF膜用5%脫脂奶粉溶液室溫孵育封閉2h，將抗體用一抗稀釋液稀釋至適當濃度，室溫下孵育PVDF膜過夜。用PBST在室溫下搖床上洗3次，每次15min。將過氧化物酶標記的二抗按照適當比例用PBST稀釋(二抗的種屬應和一抗一致)，室溫下孵育PVDF膜2h。用PBST于室溫下搖床上洗3次，每次15min。12、ECL化學發(fā)光與X光片定影：加入顯色底物后按常規(guī)X光片顯影方法將轉印膜上的信號轉移至X光片上。RealTimePCR操作步驟RNA抽提1.所需材料試劑：(1).TaKaRaRNAisoReagent試劑(2).氯仿(3).異丙醇

(4).75%乙醇（DEPC處理水配制）

(5).RNase-free水（制備方法：使用RNase-free的玻璃瓶，向超純水中加入DEPC至終濃度0.01%（v/v），過夜攪拌后，高溫高壓滅菌。

(6).盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應在使用前按下列方法進行處理。

a）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下處理12小時。

b）然后在120℃下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。(7).用于RNA實驗的試劑，須使用干熱滅菌（180℃，60分鐘）或使用上述方法進行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可以使用RNA實驗用的一次性塑料容器），使用的無菌水須用0.1%的DEPC處理后再進行高溫高壓滅菌。

RNARNAisoReagent的使用量情況如下

2.實驗樣品的研磨和勻漿。

A.貼壁培養(yǎng)細胞

①倒出培養(yǎng)液，用1×PBS清洗一次。

②每10cm2生長的培養(yǎng)細胞中加入2ml的RNAisoReagent，水平放置片刻，使裂解液均勻分布于

細胞表面并裂解細胞，然后使用移液槍吹打細胞使其脫落（對于貼壁牢固的培養(yǎng)細胞可用細胞刮勺剝

離細胞）。

③將內含細胞的裂解液轉移至離心管中，用移液槍反復吹吸直至裂解液中無明顯沉淀。

④室溫靜置5分鐘。

B.懸浮培養(yǎng)細胞

①將懸浮培養(yǎng)細胞連同培養(yǎng)液一起倒入離心管中，8,000g4℃離心2分鐘，棄上清。

②向每5×106個細胞中加入lml的RNAisoReagent。

③用移液槍反復吹吸直至裂解液中無明顯沉淀。

④室溫靜置5分鐘。

C.動物組織、植物材料樣品

①將超低溫凍結的RNA提取樣品稱量后迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷

加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的可見顆粒，如果沒有研磨徹底會影響RNA的收率和質量）。

②對于普通的RNA提取樣品，可以向研缽中加入適量的RNAisoReagent，將研磨成粉末狀的樣品完

全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。

3.總RNA的提取。

①向上述步驟2的勻漿裂解液中加入氯仿（RNAisoReagent的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，用力震蕩（氯仿沸點低、易揮發(fā)，振蕩時應小心離心管蓋突然彈開）。待充分乳化溶液呈乳白狀（無分相現象）后，再室溫靜置15分鐘。

②12,000g4℃離心15分鐘。

③從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。吸取上清液轉移至另一新的離心管中（切忌吸出白色中間層）。

④向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫靜置10分鐘。

⑤12,000g4℃離心10分鐘。一般在離心后，試管底部會出現沉淀。

4.RNA沉淀的清洗

小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75％的乙醇lml（切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000g4℃離心5分鐘后小心棄去乙醇（為了更好地控制RNA中的鹽離子含量，應盡量除凈乙醇）。

5.RNA的溶解

室溫干燥沉淀2～5分鐘（不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會很難溶解，有關RNA溶解可以參考Troubleshooting中的相關說明），加入適量的RNase-free水溶解沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。6.RNA濃度測定吸取lul抽提的RNA用DEPC水稀釋10倍后．在紫外分光光度計上測定RNA濃度，以DEPC水做空白對照，同時記錄RNA濃度及其逆轉錄所需準備試劑：TAKARA逆轉錄試劑盒036A操作步驟：按下列組份配制RT反應液(反應液配制請在冰上進行)試劑使用量5×PrimeScriptRTMasterMix2TotalRNA500ngRNaseFreedH2OUpto10ul反應體系可按需求相應放大輕柔混勻后進行反轉錄反應，條件如下：3715min855sec4注意：得到的RT反應液加入到下一步的RealTimePCR反應體系中，其加入量不要超過RealTimePCR反應體積的1/10（V/V）量。定量PCR