第七章園藝植物生物技術

第七章園藝植物生物技術演示文稿目前一頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點（優(yōu)選）第七章園藝植物生物技術目前二頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點

GeneticEngineering

alsocalledgeneticmodification,isthedirectmanipulationofanorganism'sgenomeusingbiotechnology.

NewDNA

maybeinsertedinthehostgenomebyfirstisolatingandcopyingthegeneticmaterialofinterestusingmolecularcloningmethodstogenerateaDNAsequence,orbysynthesizingtheDNA,andtheninsertingthisconstructintothehostorganism.

Genesmayberemoved,or"knockedout",usinganuclease.Genetargetingisadifferenttechniquethatuseshomologousrecombinationtochangeanendogenousgene,andcanbeusedtodeleteagene,removeexons,addagene,orintroducepointmutations.目前三頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Anorganismthatisgeneratedthroughgeneticengineeringisconsideredtobeageneticallymodifiedorganism(GMO).ThefirstGMOswerebacteriain1973.Geneticallymodifiedcrops(GMCs,GMcrops).Thefirstgeneticallymodifiedplantwasproducedin1982,usinganantibiotic-resistanttobaccoplant.ThefirstgeneticallymodifiedcropapprovedforsaleintheU.S.,in1994,wastheFlavrSavrtomato,whichhadalongershelflife.目前四頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.1InstrumentalEnzymeof

GeneEngineeringRestrictionendonucleases(限制性內切酶)Ligase（連接酶）Polymerase（聚合酶）Nuclease（核酸酶）Terminalenzyme（末端轉移酶）Methylase（甲基化酶）目前五頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.1.1RestrictionEndonuclease一類能識別雙鏈DNA分子中某一特定核苷酸序列，并能對核酸內部的磷酸二酯鍵進行切割的一種內切核酸酶。TypeⅠendonuclease：識別專一位點，切割不專一；TypeⅡendonuclease：識別專一位點，切割專一；TypeⅢendonuclease：識別專一位點，切割不專一。目前六頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點TypeⅡendonucleaseRecognize：4~6個核苷酸，回文序列Cutingresult：astickyends(粘性末端)：Pst1EcoR15’-CTGCAG-3’5’-GAATTC-3’3’-GACGTC-5’3’-CTTAAG-5’

abluntends(平末端)：NruⅠ5’TCGCGA3’5’AGCGCT3’目前七頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Isoschizomers(同裂酶)：指來源不同，但識別相同靶序列的核酸內切酶。如：HpaⅡ和MspⅠ是一對同裂酶(CCGG)Isocaudarner(同尾酶)：指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內切酶。BamHⅠBclⅠG

GATCCTGATC

ACCTAGGACTAGT目前八頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.1.2DNAligase

（DNA連接酶）T4DNA

ligase：joinbluntendsorstickyendsEscherichiacoliDNA

ligase：joinstickyends目前九頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.1.3DNApolymeraseDNA

polymeraseⅠofE.coli：

5’→3’聚合活性，5’→3’外切活性,3’→5’

外切活性2.KlenowfragmentofDNApolymeraseⅠofE.coli

5’→3’聚合活性，3’→5’

外切活性3.DNA

polymeraseofPhageT4

5’→3’聚合活性，3’→5’

外切活性，活性高200倍。4.Reversetranscriptase(反轉錄酶)5.DNA

polymeraseofT7phage：活性高1000倍目前十頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點

OtherDNA-modifyingenzymesTerminaltransferase(末端轉移酶)：能以具3’-OH的單鏈和雙鏈的DNA為引物，在有底物dNTP和Mg2+和Co2+下，把脫氧核苷酸一個接一個加到DNA的3’端上。

Alkalinephosphatase(堿性磷酸酶)：在堿性條件下（pH8~9），可除去DNA、RNA5’端磷酸基團，使5’端變?yōu)?OH。防止DNA的自身連接，方便5’端的放射性標記。

Methylase(甲基化酶)：通過對DNA分子上的特定序列位點進行甲基化修飾，使該序列免受能識別和切割該序列的限制性內切核酸酶的切割。

NucleaseS1(S1核酸酶)：能降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5’磷酸的單核甘酸或寡核甘酸。目前十一頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.2Vectors（載體）Vector：能把外源DNA帶進宿主細胞，并使之在細胞內建立穩(wěn)定的遺傳狀態(tài)，在細胞內繁殖、傳代或進行表達。Avecctorshouldhavethefollowingfeatures：Containareplicon,能自主復制Markergenes,可供選擇的遺傳標記Uniquecleavagesite,克隆位點ContainsuitablecontrolelementsforexpressionofclonedDNA,suchaspromoters,terminators,控制元件目前十二頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.2.1Plasmids(質粒)Plasmidsaredouble-stranded,colsedcircularDNAmolecules,whichexitstinthecellasextrachromosomalunits.存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小1~500bp?？勺陨韽椭坪捅磉_，常有1~3個抗藥性基因，便于篩選。經(jīng)過適當改選后便可成為良好的載體?？寺⊥庠碊NA片段＜10kb目前十三頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點（4363bp）oripBR322wasoneofthefirstcloningvectorstobeconstructedandthemostwidelyused.

Itisa4.36kbdoublestrandedcloningvecctor.ItcontainsColE1oriofreplicationandtwoantibiotic-resistancegenesand20uniquerecognitionsites.TheinsertedDNAfragmentwaslessthan10kb.目前十四頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點pUCVectors1、2.7kbandpossessColE1oriofreplication；

2、amprR（氨芐青霉素抗性）gene,不含核酸內切限制酶的識別位點。

3、operon(啟動子)oflacZ（大腸桿菌β-半乳糖基因）andcodingα-肽鏈的DNA序列；

4、MCS(多克隆位點)locatedinlacZ’

gene。MCS不破壞該基因的功能。在含氨芐青霉素、x-gal和IPTG培養(yǎng)基上，未轉化的細菌不能生長，藍色菌落為野生型pUC，白色菌落為重組pUC。目前十五頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點目前十六頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.2.2λ

phage(噬菌體)vectorphage15kb＜insertedDNAfragment＜23kb

Virusesthatcaninfectbacteria.48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)Lyticphase

(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)目前十七頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點VectorcarryLacZ'gene：在誘導物IPTG和X-gal存在時，β-半乳糖苷酶與相應的Lac-宿主鋪平板可形成深藍色噬菌斑。當插入外源基因時，所產(chǎn)生的重組噬菌體喪失α互補能力，形成無色噬菌斑。Theimmunefunction(免疫功能失活載體)：載體基因組中有一段免疫區(qū)（酶切位點），外源基因插入失活，無法進入溶原周期，形成清晰噬菌斑。目前十八頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.2.3Cosmid(柯斯質粒)vectorsThevectorshavingbothcos（cohesive）ofλphageandoriofreplicationofplasmid。Cosmidvectors可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞,但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在于細胞內。目前十九頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點COSmidpHC79is4.3kbDNAfragmentandmadeofpBR322andcossiteofλphage.InsectionDNAfragmentmorethan40kb。目前二十頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.2.4Artificialchromosomevectorsbacterialartificialchromosome,（BAC,細菌人工染色體）yeastartificialchromosome,（YAC,酵母人工染色體載體）目前二十一頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.目前二十二頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點目前二十三頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.3Gene

cloning

目前二十四頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Genelibraryscreening（文庫篩選法）Map-basedcloning(圖位克隆技術)Transposontag（轉座子標簽法）Differentialdisplayanalysis（基因差異表達分析）Homologysequences（同源序列法）Genechip（基因芯片技術）Strategy目前二十五頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.3.1GenelibraryscreeningGenelibrary：是一組DNA或cDNA序列克隆的集合體。Type：genomiclibrary（基因組文庫）cDNAlibrary(cDNA文庫)目前二十六頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點(1)GenomicCloning①Vectorpreparation：Thenumberofrecombinantsforacompletegenomiclibrarycanbeestimated：

N=ln(1-P)/ln(1–f)(P=任一基因被克隆的概率)(f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小)

Example:genomicsoftonatowas9.5×108bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為20kb，則構建一個完備性為0.99的基因文庫至少需要N=2.2×105

cloning。目前二十七頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點②PreparationoflongDNAfragment

盡可能避免機械切割部分消化：低熔點瓊脂糖包埋，再酶切。一般可得到＞600kb的DNA.③JunctionofgenomicDNAwithvectors（比例1:15）④Genetictransformation（電轉化）⑤Cloneselectionandverification（隨機，脈沖電泳）⑥Libraryamplification,packagingandpreservation目前二十八頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點(2)cDNAlibraryPreparatonofmRNA：oligo(dT)SynthesisoffirststrandofcDNA:reversetranscriptasesSynthesisofsecondstrandofcDNA:RNA-cDNA雜合分子AAAA(A)nTTTT(T)nRNA酶H,大腸桿菌DNA聚合酶IAAAA(A)nTTTT(T)nAAAA(A)nTTTT(T)nAAAA(A)nTTTT(T)nRNA片段為引物合成第二鏈T4DNA聚合酶置換合成目前二十九頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點CloningofcDNA：Mondify：cDNA甲基化處理，保護內部酶切位點，添加接頭。cloning：將cDNA克隆到載體中。關鍵是cDNA與載體的比例。目前三十頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點PCR介導法目前三十一頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Introductiontohostcells目前三十二頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點(3)

ScreentheinterestinggeneAccordingtonucleotidesequenceofgene相關基因→DNA探針→雜交Accordingtoexpressionofgene氨基酸序列→合成cDNA探針→雜交ScreenbyPCR

目前三十三頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.3.2Map-basedcloningMap-basedcloning(圖位克隆法)：identificationofDNAmarkerlinkedtotargetgeneonthegeneticmap，thenapproachtoandisolationthegenesbychromosomejumpingorchromosomelanding.Produre：目的基因的初步定位精細定位構建目的基因的精細物理圖譜并鑒定出含目的基因的小DNA片段篩選文庫以找出目的基因并通過遺傳轉化實驗證實其表型功能。

目前三十四頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點目前三十五頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點目前三十六頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.3.3Transposontagging(轉座子標簽)andT-DNAtaggingTransposonistheDNAsequencecanmoveonachromosome.能從一個基因座位轉移到另一個基因座位，當轉座子插入到某個基因內部或鄰近位點時，會使插入位置的基因失活并誘導突變型；當轉座子切離時，又使目的基因恢復活性。目前三十七頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Transposontagging：localizationandcloningageneusingtransposoninsertioncausingonegeneinactivation.Procedure：轉座子導入目標植物篩選獲得純合突變株構建突變體核基因組文庫轉座子片段作探針進行雜交獲得轉座子側翼序列野生型植物核DNA獲得完整目的基因構建野生型核基因組文庫目前三十八頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點T-DNAtaggingPrincipleLikethetransposontaggingmethod，ButusingT-DNAofTiplasmidinagrobacterium(農(nóng)桿菌)causemutant，andfindorseparatagene。目前三十九頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.3.4Analysisofgenedifferentialexpression

基因差異表達分析Variousprocessesoflifeareaccompaniedbyselectiveopeningandclosing

of

differentgenes.Accondingtothese，severalgenecloningmethodweredeveloped.mRNA差異顯示技術抑制性差減雜交代表性差異分析基因表達序列分析cDNA-AFLP技術目前四十頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點根據(jù)真核生物成熟mRNA的多聚A尾巴設計一個錨定引物和一個隨機引物對RNA進行反轉錄和PCR擴增，然后進行電泳分析，分理出有差異的條帶，制成探針篩選cDNA文庫或基因組文庫，找出差異表達的基因。(1)DDRT-PCR(mRNA差異顯示)：目前四十一頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點(2)SSH（suppressionsubtractivehybridazation抑制性差減雜交）

目前四十二頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.3.5Homology-basedcloning

同源序列法Genessequencesarehomologybetweenplantsbelongtothesamespeciesorgenus.Soagenecanbeisolatedaccordingtothesequenceofisolatedgeneofanothercloserelativeplant.PCRmethod.從待分離植物的DNA中直接擴增DNA片段，并與已知序列比較，確認；Hybridizationwithgenelibrary.以已知序列的基因作探針，從待分離材料的核DNA文庫或cDNA文庫中釣取同源性較高的克隆，測序并比較、確定。

目前四十三頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點目前四十四頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.3.6Genechip(基因芯片)Principle：Throughthecomparisonbetweendifferentspecies,orbetweendifferentindividualsofthesamespecies,orthesameindividualindifferentgrowthperiodorgeneexpressionbetweenthedifferentenvironmentalconditions。Method:采用原位合成或顯微打印手段，將數(shù)以萬計的DNAprobe固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品快速、并行、高效地檢測。目前四十五頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點

目前四十六頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點1）DNAmicroarrayconstructionandprinting.在序列分析的基礎上，根據(jù)基因序列中特異的片段設計出一系列10-50bp長、代表該生物所有基因或欲分離目的基因信息的DNA片段，固定在芯片上。2）Preparationoftargetsample.不同發(fā)育時期或不同處理條件下植物體特定器官的mRNA用熒光標記。3）Hybridizationanddetection.通過雜交位點及信號強弱，可以得知在不同條件下各基因是否表達及表達強弱，進而找出與該生理功能相關的目的基因。4）Datacollectionandanalysis(基因芯片數(shù)據(jù)的收集和分析)Produreofgenechip目前四十七頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.4

Genetransferinplant

基因的遺傳轉化目前四十八頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Plantgenetictransformation：應用分子重組技術、細胞組織培養(yǎng)技術或種質系統(tǒng)轉化技術，有目的地將外源基因或DNA片段插入到受體植物基因組中，并使其在后代植株中得以表達的過程。目前四十九頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.4.1、Receptorsystem(受體系統(tǒng))Concept：是指用于轉化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。Theestablishmentofreceptorsystemispremise.目前五十頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點(1)RequirementsforreceptorsystemingenetictransformationHighlyefficientandstableregeneration(高效穩(wěn)定的再生能力)Geneticstability(較高遺傳穩(wěn)定性)Stablesourceofexplants(穩(wěn)定的外植體來源)：無菌實生苗的子葉、胚軸、幼葉等Sensitivetoselectiveantibiotics(對選擇性抗生素敏感)EasyinfectedbyAgrobacterium(對農(nóng)桿菌侵染的敏感性)目前五十一頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點(2)Typesofreceptorsystem（1）Tissuereceptorsystem(組織受體系統(tǒng))愈傷組織再生系統(tǒng)：轉化率高，來源容易、易擴繁、適用廣，穩(wěn)定性差，嵌合體多；直接分化再生系統(tǒng)：操作簡單，無性系變異小，轉化率低，嵌合體多。（2）Protoplastreceptorsystem(原生質體受體系統(tǒng))高效攝取外源基因、轉化準確，無嵌合性，適用廣;培養(yǎng)周期長，難度大，再生頻率低。（3）Germcellreceptorsystem(生殖細胞受體系統(tǒng))接受外源DNA潛能強，純合體便于選育，操作簡便，但受季節(jié)限制。目前五十二頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.4.2Transformationmethod

轉化方法Directtransformethod(直接轉化法)Vectormediatedgenetransfor(載體介導的轉化)Germplasmsystemtransfor(種質系統(tǒng)轉化)目前五十三頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點①Chemicalinduction(化學誘導）Receptor：protoplast(原生質體)Pricinple:PEG（聚乙二醇）可使DNA與細胞膜之間形成分子橋，促使相互間的接觸與粘連，改變細胞膜表面電荷，增加細胞膜通透性。在二價陽離子共同作用下，使外源DNA沉積在細胞膜表面，促使細胞主動吸收外源DNA，實現(xiàn)外源DNA導入受體細胞。（1）DirecttransformationofexogenousDNA目前五十四頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點procedure：Advantage&disandvatage

Simpleoperation,lowcost,noneedexpensiveinstrument,awideplantrange,goodrepeatability,lowconversionrate：10-5~10-3外源目的基因的制備原生質體制備目的基因與原生質體的轉化培養(yǎng)轉化體的鑒定和再生植株的培養(yǎng)目前五十五頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Principle：高壓電脈沖使植物細胞膜或原生質體上造成非對稱穿孔，每個細胞膜上形成上百個瞬間通道，允許外源基因的進入。procedure：制備含目的基因的質粒DNA→制備植物原生質體懸浮液或一定處理的植物組織→混合在200~600V/cm的電場處理若干秒→原生質體培養(yǎng)和轉化子篩選→再生植株鑒定與培養(yǎng)。②Electroporation

電穿孔法Advantage&disandvatage：Easyoperation,highconversionrate,butneedtoprotoplastculture.目前五十六頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點③Genegun(基因槍)Principle：利用火藥爆炸、高壓氣體和高壓放電作為驅動力，將包裹有生物活性DNA的金屬小顆粒加速，高速轟擊植物組織或細胞，使外源基因實現(xiàn)穿壁并導入受體細胞中，然后通過細胞核組織培養(yǎng)技術，再生出新的植株類型。gunpowder目前五十七頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點HighpressuregasgenegunAdvantage&disandvatage：unlimitedofhost,controllable,widetargetreceptors,goodrepeatability.transformatiinrateisextremelylow,costishigh,thechimericratioislarge,geneticstabilityispoor.

目前五十八頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點④Microinjection（顯微注射法）Principle：直接將外源基因注入已固定的植物細胞或組織中，從而實現(xiàn)基因轉移。注射部位包括子房、穗基、分蘗節(jié)等。Receptorcellsfixed：瓊脂糖包埋法，多聚L-亮氨酸粘連法，吸管支持法。Advantage&disandvatage：Controllable,hightansfornationrate,noharmtoreceptorcells,butcomplicated,time-consumingandlowworkingefficiency,morecopy,pronetomutation.目前五十九頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點（2）Vectormediatedgenetransfer

載體介導的轉化Agrobacteriumtumefaciensmediatedgenetransfer（根癌農(nóng)桿菌介導的轉化）Agrobactriumrhizogenes(發(fā)根農(nóng)桿菌介導的轉化)目前六十頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Tumorinducingplasmid(Ti質粒)isalargeplasmidwhichharboredinA.tumefaciensandcausecrowngallinplant.當根癌農(nóng)桿菌感染植物時，菌體不進入植物細胞，而僅是Ti質粒中稱之為“T-DNA”的DNA片斷進入寄主細胞并插入基因組中，T-DNA中的基因利用植物的酶系統(tǒng)進行轉錄和翻譯。①Tiplasmid(根癌農(nóng)桿菌Ti質粒)目前六十一頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點organizationofTiplasmid（180～240kb）：T-DNAregion（與基因轉移相關），Virregion（激活T-DNA轉移），Conregion（調控Ti質粒在農(nóng)桿菌間發(fā)生結合轉移)andOriregion（調控農(nóng)桿菌自我復制)。T-DNAregionLeftborderRightborderauxincyt冠癭堿合成酶基因oriConvirVir目前六十二頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Remould

Tiplasmid(Ti質粒改造)Disarm:刪除T-DNA左右邊界中的onc（激素合成）基因，構建卸甲載體。Addselectivemarker:引入大腸桿菌質粒的復制起點和選擇標記。Addenzymesite:插入人工多克隆位點。IntroducePlantgenepromoterandpoly(A):引入植物基因的啟動子和信號序列Deletenon-essentialsequences:除去其他非必需序列?Tivectors:pGV3850,pGV2250,pTiB6S3-SE載體。目前六十三頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Function：中間載體與卸甲載體共同組成一個植物基因轉化載體系統(tǒng)，完成基因的轉化。Organization：

“植物特異性啟動子+目的基因+終止子”，“植物特異性啟動子+選擇標記基因+終止子”。Expressionvector(Ti中間表達載體)目前六十四頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Cointegratevectors

(Ti共整合轉化載體)ThedisarmedTivectoriscovalentlylinkedtodonorvectorwithgeneofinterest-T-DNAbordersequencespresentinaA.tumefaciensstraintoactasoneunit.E.coli中間載體+卸甲Ti質粒以同源重組方式整合成共合體，分子量較大，共合體的形成頻率較低，需用Southern雜交或PCR進行檢測，構建較困難。目前六十五頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點

CointegratedvectorbasedonPBR322homologousThevectorhaspBR322DNAintheT-DNAregion,whichprovidearegionofhomologywithmostothercloningvectors.RecombinatoninthetwoplasmidsDNAproducesthecointegrate.(在卸甲載體的T-DNA區(qū)引入PBR322，中間載體是PBR322質?；蚱溲苌|粒，兩者通過同源重組實現(xiàn)目的基因及選擇性標記基因與卸甲Ti質粒的整合，以順式方式將基因轉化到植物細胞中去。)基于左邊界內部同源區(qū)（LIH）的轉化系統(tǒng)，即SEV系統(tǒng)。受體Ti質粒pTiB6BS3（TL），中間載體是pMON200（TR）.含有抗性嵌合基因便于轉化植株的直接篩選。目前六十六頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點共整合載體co-integratedvector目前六十七頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Binaryvectors

Ti雙元轉化載體的構建Concept:指由兩個分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質粒構成的雙質粒系統(tǒng)。Principle：位于一個Ti質粒上的Vir基因可以反式激活位于另一個Ti質粒上的T-DNA轉移。使插入到T-DNA區(qū)的外源基因導入植物細胞中。含有廣泛寄主范圍的復制起點，代替了重組同源區(qū)。目前六十八頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Binaryvector(雙元載體系統(tǒng))目前六十九頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Transfermechanism(轉化機制)根癌農(nóng)桿菌在自然條件下感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，根癌農(nóng)桿菌細胞中的Ti質粒上通過特異性識別信號分子誘導其Vir區(qū)基因的表達，產(chǎn)生VirD1和VirD2蛋白，該2種蛋白可切割T-DNA的左右邊界，產(chǎn)生一條單鏈T-DNA分子，進入植物細胞，并整合到植物基因組中。

Techniques：

Leaf-discmethod(葉盤法）co-culturewithprotoplast（原生質體共培養(yǎng)）plantinfection(整株感染)Procedure：

含重組Ti質粒的工程菌培養(yǎng)及轉化；選擇合適的外植體；工程菌與外植體共培養(yǎng)；外植體脫菌及篩選；轉化植株再生及鑒定。目前七十頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Interestedgenestransferinto(dicotyledonous)plantcellsAgrobacteriummediatedtransformation目前七十一頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Advantage：Naturalvectorsystemwithhightransferrate,exogenousgenestransferedareoftensinglecopy,rarelymethylationandgeneticallymodifiedsilence,excellentstabilityofgene,lowcost,simpleandeasytooperate.DisadvantageHostrangelimated(雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物)，Needantibioticforalongtime(因外植體再生階段脫菌比較困難)。目前七十二頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點②A.rhizogenesmediavectors

發(fā)根農(nóng)桿菌介導的載體WhenAgrobacteriumrhizogenes(發(fā)根農(nóng)桿菌)infectplants，itcaninduceplanttoproducemanyadventitiousroots.Therootsgrowquicklyandconstantlybranchingintohairyroot,whichisinducedbyRiplasmidinfact。目前七十三頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Noneedtodisarm.Asinglecellclonecanderivedfromhairyroot,andchimeras(嵌合體)isavoid.Ri質?？芍苯幼鳛橹虚g載體；可與Ti質粒配合使用建立雙元載體系統(tǒng)；Hairrootisappropriateforinvitrocultureandforproductionofsecondarymetabolites(次生代謝產(chǎn)物)。AdvartageofRiplasmid目前七十四頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點Ricointegrationvectors(Ri共整合轉化載體的構建)中間載體常用pBR322,pBI121等。把目的基因插入到T-DNA中，構成中間表達載體。然后通過誘導菌株的協(xié)助質粒和野生型的發(fā)根農(nóng)桿菌直接進行三親雜交，通過同源重組把中間載體整合到Ri質粒的T-DNA中。Ribinaryvectors(Ri雙元轉化載體的構建)基本程序與Ti質粒相同。目前七十五頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點A.rhizogenesmediatedtransformationTheprincipleandprocedureofitstransferassameasA.tumefaciensBinaryvectorsystem目前七十六頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點(3）Germplasmtransfersystem

(種質系統(tǒng)轉化法)①Insituvacuuminfiltrationmethod（原位真空滲入法）Procedure：將適宜轉化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌介導下發(fā)生遺傳轉化。Advantagesanddisadvantages：Convenient,quick,reliable,lowcost,hightransferrate.Itsapplicationneedsdevelopment.目前七十七頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點②DNAtransferviapollen

(花粉管通道法)Principle：植物在雙受精完成以后，受精卵細胞的初次分裂需要充分的物質和能量積累。該時期的細胞不具備完整的細胞壁和核膜系統(tǒng)，細胞內外的物質頻繁交流。通過花粉管通道滲透進入胚囊的外源DNA片段有可能進入受精卵細胞，并進一步被整合進受體植物基因組中。目前七十八頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點③Seedsoakingmethod

(種子浸泡法)Principle：Usingplantcellsmaterialtransportationsystem,exogenousDNAisdirectlytransforedintoreceptorcells.通過細胞間隙與胞間連絲組成的網(wǎng)絡化運輸系統(tǒng)將外源DNA運至每個細胞。通過內吞作用將外源DNA攝入細胞。目前七十九頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.5IdentificationofgenetransformationplantReporterorselectablegenes(利用選擇標記基因和報告基因)RecombinantDNA(利用重組DNA分子鑒定)Transcriptionorexpressionofexogenousgene(利用外源基因的轉錄或表達鑒定)目前八十頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.5.1Selectablegenes

選擇標記基因Antibioticresistancemarker：nptⅡ(新霉素磷酸轉移酶基因)，hpt(潮霉素磷酸轉移酶基因)，Herbicideresistancemarker：Bargene(草丁膦乙酰轉移酶）Antimetabolitemarker（抗代謝物標記基因）：dhfr(二氫葉酸還原酶基因)目前八十一頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.5.2Reportergene

報告基因Opinesynthase(冠癭堿合成酶基因)：檢測冠癭堿Chloramphenicolacetyltransferase(氯霉素乙酰轉移酶基因,cat)：放射性檢測β-galactosidase(半乳糖苷酶基因,GUS):藍色Greenfluorescentprotein(,綠色熒光蛋白,GFP)：綠色熒光Anthocyanins(花青素合成相關基因)(C1,B/R):紅色斑點目前八十二頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點

RecombinantDNAcharacteristic

利用重組DNA分子特征的鑒定Enzymedigestionprofile(DNA分子酶切圖譜鑒定)PCR鑒定Southern雜交目前八十三頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點

Transcriptionorexpressionofexogenousgene

利用外源基因的轉錄或表達鑒定NorthernblottingWesternblottingProteinimmunoassay(蛋白免疫測定)目前八十四頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點目前八十五頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.6Strategytoimprovetheexogenousgeneexpression提高外源基因的表達水平目前八十六頁\總數(shù)九十八頁\編于十四點7.6.1Transgenesilencing

轉基因沉默現(xiàn)象Transgenesilencing（轉基因沉默）:導入并整合進受體基因組中的外源基因在轉化體的當代或其后代出現(xiàn)表達收到抑制，甚至完全不表達的現(xiàn)象。轉基因在受體植物中往往不能穩(wěn)定表達，有時甚至完全不表達的現(xiàn)象。Types:Tr