DB44T 512-2008松毛蟲質(zhì)型多角體病毒生產(chǎn)及作用技術(shù)規(guī)程

松毛蟲質(zhì)型多角體病毒生產(chǎn)及使用技術(shù)規(guī)程2008-05-26發(fā)布廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I Ⅱ1范圍 12術(shù)語和定義 13松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑的生產(chǎn) 14松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑的劑型 35松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑的質(zhì)量檢測 36松毛蟲質(zhì)型多角體病毒的包裝、運(yùn)輸、貯存 37松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑的使用 38松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑防治效果評價(jià) 4附錄A(規(guī)范性附錄)松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑生產(chǎn)情況記錄表 5附錄B(規(guī)范性附錄)松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑防治效果檢查表 6附錄C(規(guī)范性附錄)松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑防治效果檢查表 7附錄D(資料性附錄)松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑基本知識 8Ⅱ本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C為規(guī)范性附錄，附錄D為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由廣東省林業(yè)局科技與對外合作處提出。本標(biāo)準(zhǔn)由廣東省林業(yè)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：茂名市林業(yè)科學(xué)研究所、廣東省森林病蟲害防治與檢疫總站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：林思誠、古錦漢、陳沐榮、柯沛強(qiáng)、章寧。DB44/T512—2008松毛蟲質(zhì)型多角體病毒生產(chǎn)及使用技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了松毛蟲質(zhì)型多角體病毒(DCPV)殺蟲劑的生產(chǎn)工藝流程、產(chǎn)品質(zhì)量檢測及產(chǎn)品包裝、運(yùn)輸、貯存、使用方法等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑的生產(chǎn)及使用。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。通過病毒在寄主體內(nèi)的復(fù)制，擴(kuò)大病毒數(shù)量。質(zhì)型多角體病毒的包含體。松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑致靶標(biāo)害蟲感病、死亡的能力，以感染率、死亡率表示。3松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑的生產(chǎn)3.1病毒的增殖3.1.1林間自然增殖方法在松毛蟲蟲口密度較高的松林中噴灑病毒種源，接種松毛蟲林間自然種群，病毒種源在林間自然增殖后，回收松毛蟲幼蟲，加工提取病毒，林間自然增殖方法適用于病毒的規(guī)模化生產(chǎn)。病毒種源多角體含量達(dá)30億/g以上，保存期限一年。用作增殖病毒的林地，應(yīng)滿足以下條件：——松樹純林，面積10hm2以上，交通方便?！獦涓卟怀^10m,針葉豐富，樹下植被少?！迥陜?nèi)未使用松毛蟲質(zhì)型多角體病毒。——平均蟲口密度40頭/株～100頭/株，蟲體發(fā)育正常，無明顯的流行病跡象。接種應(yīng)在松毛蟲幼蟲3齡~5齡進(jìn)行，蟲口密度較高時(shí)，可適當(dāng)提前。不同世代的增殖效果，以越冬代最好，第一代次之。接種濃度為10℃PB/ml～10CPB/ml。用機(jī)動噴霧器作常量噴霧，均勻噴灑，噴后第三天重噴一次。采收感染病毒的蟲體按染病蟲體中腸顏色的變化，將中腸病變程度劃分為三個(gè)等級：2I級：中腸白色或黃白色，單蟲病毒含量約2×10℃PB～5×10℃PB;接種8天后，每日抽樣調(diào)查林間松毛蟲中腸顏色的變化，當(dāng)中腸病變程度達(dá)到I級的蟲體占60%時(shí)，死蟲體內(nèi)多角體大部分已隨糞便排出，無采收價(jià)值，僅采收樹上活蟲。樹高2m以下，可直接從樹上收集活蟲。樹高超過2m時(shí)，振落樹上活蟲再從地面收集，也可用菊酯類化學(xué)農(nóng)藥與柴油配制成煙霧劑，噴煙收集的染病蟲體，按重量加入2%的食鹽，裝入塑料桶保存，待加工。用塑料薄膜圍成200cm×100cm×80cm的圍欄，四角用插桿固定，下方用土壓實(shí)，上方設(shè)遮陰防雨棚。欄內(nèi)架設(shè)長160cm的橫桿2根(離地面高60cm),橫桿上懸掛有豐富針葉的松枝。自林間采集松毛蟲5齡~6齡幼蟲，投入圍欄內(nèi)飼養(yǎng)，每欄投入約8000頭。用1×107CPB/ml的病毒懸液噴灑松針，讓松毛蟲取食，3天后重噴一次。在8天后，每天抽樣檢查松毛蟲感病情況。當(dāng)染病蟲體中腸病變程度達(dá)到I級的蟲體數(shù)量占70%時(shí)，即可采收。集蟲圍欄增殖方法適用于高純度病毒的生產(chǎn)，但不宜作病毒的大量生產(chǎn)。每個(gè)圍欄的病毒產(chǎn)量約1.5×用雙滾刀切肉機(jī)或鉸肉機(jī)將蟲尸切片或鉸碎，重復(fù)鉸切1至2次，鉸切成0.5cm以下的小塊。將蟲尸碎片放入攪拌機(jī)，加入10倍清水，以80轉(zhuǎn)/min～100轉(zhuǎn)/min的速度攪拌30分鐘，使中腸上皮放出洗液，過120目尼龍紗濾網(wǎng)，濾液進(jìn)入貯液罐，濾渣經(jīng)脫水機(jī)脫水10分鐘，重新加人攪拌機(jī)重復(fù)用潛水泵將貯液罐中的濾液抽至沉降塔，靜置。沉降塔設(shè)透明的觀察窗，當(dāng)觀察到塔內(nèi)液體明顯分層時(shí)，放出上層清液進(jìn)入離心機(jī)離心，下層濁液以240目絹紗過濾，濾渣直接去掉，濾液重回?cái)嚢铏C(jī)，與后面的初濾濾液一起再次沉降。當(dāng)天最后一次沉降產(chǎn)生的下層濁液，經(jīng)240目絹紗過濾后，濾液直接進(jìn)人離離心機(jī)安裝在低于沉降塔的水平面上，以形成一定的落差，方便濾液自然進(jìn)入離心機(jī)。離心機(jī)轉(zhuǎn)速15000轉(zhuǎn)/分鐘。多角體在離心力作用下沉淀于離心管管壁上。取離心沉淀物加工，離心上清液進(jìn)入排污池離心沉淀物，加入7%鹽水或中性甘油，用打蛋機(jī)打碎。待該批次蟲尸加工完畢后，將所有離心沉淀物混合，用磨漿機(jī)磨碎，逐次調(diào)低磨漿機(jī)的間隙，重復(fù)磨漿三次。最終的細(xì)度應(yīng)達(dá)到所有的顆粒直徑小于100μm,90%以上的顆粒直徑小于50μm。3生產(chǎn)人員應(yīng)作生產(chǎn)記錄，將有關(guān)數(shù)據(jù)記入附錄A的記錄表。4松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑的劑型松毛蟲質(zhì)型多角體病毒可加工成水劑、油乳劑、油劑、粉劑。離心沉淀物直接加水磨漿即成水劑；離心沉淀物加等量中性甘油磨漿即成50%中性甘油懸浮劑；離心沉淀物加入礦物油及乳化劑、助懸劑及保護(hù)劑磨漿，可制成超低容量噴霧油劑；離心沉淀物加填料抽濾，真空脫水，加入濕潤劑，可制成可濕性粉劑。5松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑的質(zhì)量檢測5.2檢測方法用多點(diǎn)抽樣的方法，稱取1g藥劑，逐級稀釋，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，對角線法取樣，共取40小格，最后平均每格以4個(gè)～6個(gè)為宜。按下式計(jì)算多角體含量：每克藥劑多角體含量=平均每格多角體數(shù)x稀釋倍數(shù)×(4×105)含量未達(dá)質(zhì)量要求時(shí)，應(yīng)重新加水混勻、過濾、沉降、離心。包裝上標(biāo)明產(chǎn)品名稱、廠名、廠址、批號、凈重、毛重、執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)檢人、出廠日期、保存方法及保質(zhì)期、含量、防治對象、使用方法。避免曝曬、受熱和紫外光照射。放在陰涼、干燥、通風(fēng)處，保存期一年。置4℃以下冷庫或冰柜中，保存期七年。7松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑的使用應(yīng)保證病毒在噴灑后能被害蟲取食。在廣東防治松毛蟲、松茸毒蛾，全年均可使用。一般情況下，在氣溫高于20℃低于35℃,相對濕度70%左右時(shí)，使用效果最好。在蟲口上升期，大部分幼蟲發(fā)育至3齡時(shí)施藥防治。7.4使用劑量使用劑量1500億CPB/hm2~3000億CPB/hm2。蟲口密度低、蟲齡小時(shí)使用較低的劑量，蟲口密度高、蟲齡大時(shí)適當(dāng)增加病毒用量。按預(yù)定的噴液量及藥箱容積計(jì)算好病毒用量，量取病毒，以少量清水稀釋，倒入藥箱，加入清水定容，攪拌均勻，噴霧。地面超低容量噴霧使用松毛蟲質(zhì)型多角體病毒油劑，直接噴灑不需稀釋，特別適合于山高、路陡、林密等地形及缺乏水源的地區(qū)使用。一般采用10m寬的噴幅，噴液量3000ml/hm2。航空低量噴霧使用水劑或油乳劑，仍需以清水稀釋。每架次噴灑面積控制在133hm2以內(nèi)，藥液中加入1%的食鹽作助沉劑。松毛蟲質(zhì)型多角體病毒與一些致死速度快的微生物殺蟲劑、抗生素或低毒化學(xué)農(nóng)藥的合理配伍使用，可兼具速效與持效的作用。通常選用蘇云金桿菌(B.t.)、阿維菌素及酯類化學(xué)農(nóng)藥參配?；炫鋾r(shí)，松毛蟲質(zhì)型多角體病毒的用量為750億CPB/hm2~1500億CPB/hm2,其它參配藥劑以亞致死劑量或正常用量的1/3混入。8松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑防治效果評價(jià)單對角線法于防治區(qū)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)木40株，在類似條件林地設(shè)對照區(qū)并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)木10株。鏟光標(biāo)準(zhǔn)木樹冠投影范圍內(nèi)的地被物，施藥后第8天始每日調(diào)查記錄死蟲數(shù)，數(shù)據(jù)記入附錄B的調(diào)查表，殺蟲死亡率計(jì)算在自然死亡率5%～10%之間，可進(jìn)行校正死亡率計(jì)算。噴藥后25天，振落標(biāo)準(zhǔn)樹上活蟲，用剪刀在背上輕剪一刀，露出中腸，根據(jù)中腸病變程度判斷是否感染(I級、Ⅱ級為感染，Ⅲ級為未感染),相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)填人附錄B的調(diào)查表。以下式計(jì)算感染率：感染率在防治后的松毛蟲第n代種群中，按8.1方法取樣，按8.3方法計(jì)算感染率，相關(guān)數(shù)據(jù)填入附錄C的調(diào)5DB44/T512—2008(規(guī)范性附錄)松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑生產(chǎn)情況記錄表病蟲來源增殖方法接種濃度批次病蟲重量洗脫時(shí)間表(分鐘)沉淀時(shí)間(分沉淀物重保存介質(zhì)重量產(chǎn)品質(zhì)量6))松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑防治效果調(diào)查表地點(diǎn)縣鎮(zhèn)村，防治面積hm2,林分組成平均樹高m害蟲種類蟲齡有蟲株率(%),平均蟲口密度頭/株，藥劑名稱,濃度或用量,施藥方法,施藥日期。標(biāo)準(zhǔn)數(shù)號死蟲數(shù)死蟲數(shù)死蟲總數(shù)存活蟲數(shù)感染蟲數(shù)感染率8天9天9天天天3天天天6天6天8天天天天天天天7害蟲種類,蟲齡,有蟲株率,平均蟲口密度,檢查號檢查結(jié)果檢查蟲感染蟲數(shù)感染率備注感染(+)不感染(-)1234567898DB44/T512—2008(資料性附錄)松毛蟲質(zhì)型多角體病毒殺蟲劑基本知識D.1松毛蟲質(zhì)型多角體病毒的分類地位松毛蟲質(zhì)型多角體病毒屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)質(zhì)型多角體病毒屬(Cypovirus)的成員，為RNA病毒，基因組電泳圖譜屬于第一類型。D.2松毛蟲質(zhì)型多角體病毒的形態(tài)特征松毛蟲質(zhì)型多角體病毒的包含體平面投影為六邊形、五邊形、近圓形，直徑0.5μm～8.4μm不等。松毛蟲質(zhì)型多角體病毒的病毒粒子為正二十面體，單層衣殼結(jié)構(gòu)，位于正二十面體的十二個(gè)頂端有十二個(gè)管狀結(jié)構(gòu)的突起，直徑約50μm。病毒粒子隨機(jī)地包埋在蛋白質(zhì)性質(zhì)的包含體中，病毒粒子的核酸為雙鏈RNA,基因組由10個(gè)等克分子摩爾數(shù)的RNA片段組成。D.3松毛蟲質(zhì)型多角體病毒的感染部位松毛蟲質(zhì)型多角體病毒主要通過寄主取食帶有病毒的食物而感染，其感染部位僅限于幼蟲中腸上皮細(xì)胞，嚴(yán)重感染的中腸變?yōu)榘咨螯S白色，與正常中腸易于區(qū)別。被感染細(xì)胞解體后連同形成的多角體隨糞便排出體外，隨著上皮細(xì)胞的不斷增生再感染，所以多角體是先后不斷形成的，大小也不等。因此包含的病毒粒子數(shù)量差異也十分懸殊、成熟的大型包含體呈典型的多面體，含病毒粒子多達(dá)1000個(gè)以上，而小型的多角體多呈近圓形，含病毒粒子較少。D.4松毛蟲質(zhì)型多角體病毒病松毛蟲感病初期，一般外部病癥不明顯。隨著病情的發(fā)展，幼蟲食欲減退，發(fā)育緩慢，神態(tài)表現(xiàn)萎糜，蟲體逐漸縮短，形成頭大體小不正常的病態(tài)，尾部常帶有黃白色的稀糞。經(jīng)過一段時(shí)間，幼蟲陸續(xù)死亡，病死蟲體壁不易破裂。D.4.2組織病變馬尾松毛蟲感病初期，中腸仍為透明的淡綠色。4、5天后，中腸上可見到有分散的乳白色的小斑點(diǎn)。隨病勢加重，腸道上的白點(diǎn)增多，逐漸連成一片。白色程度增加，面積也不斷增大，直到全部中腸變?yōu)榘咨螯S白色，并且變得腫脹而不透明，表面出現(xiàn)許多橫紋皺褶。腸中食物甚少，前腸堆積較多未消化的針葉，使前腸伸長。病變一般由中腸后部開始，逐漸向中腸前端擴(kuò)展。到感病后期，體內(nèi)脂肪體大大減少，但體液仍澄清。最后中腸完全被破壞，通過鏡檢，可發(fā)現(xiàn)吐液及蟲糞中有大量的多角體。當(dāng)多角體大部分排出后，幼蟲隨即死亡。D.5松毛蟲質(zhì)型多角體病毒的致病特點(diǎn)D.5.1宿主域松毛蟲質(zhì)型多角體病毒具有較高的宿主特異性，對脊椎動物不感染而安全。但相對于核型多角體病毒而言，松毛蟲質(zhì)型多角體病毒具有更寬的宿主域，除能感染松毛蟲屬中不同的種外，還對松茸毒蛾、棉蛉蟲、斜紋夜蛾、粉紋夜蛾等其它鱗翅目昆蟲有較高的感染率。D.5.2感染途徑松毛蟲質(zhì)型多角體病毒只感染寄主中腸上皮細(xì)胞，多角體主要通過寄主的取食經(jīng)口進(jìn)人寄主中腸，在腸內(nèi)堿性溶液的作用下釋放病毒粒子，病毒粒子攻擊寄主中腸上皮細(xì)胞，造成寄主中腸上皮細(xì)胞的病變、破裂、壞死。D.5.3潛伏期松毛蟲質(zhì)型多角體病毒病的潛伏期與寄主吞食的多角體數(shù)量、寄主種類、寄主發(fā)育期、氣溫等有關(guān)，一般5天~7天。寄主從發(fā)病至死亡也有一個(gè)過程，這一過程的長短主要與氣溫有關(guān)，