生科第十三章DNA的生物合成

DNARNA蛋白質復制復制轉錄反轉錄翻譯遺傳信息傳遞的中心法則生物的遺傳信息從DNA傳遞給mRNA的過程稱為轉錄。根據(jù)mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋白質的過程，被稱為翻譯。1958年Crick將生物遺傳信息的這種傳遞方式稱為中心法則(Centraldogma)

。目前一頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點Reversetranscription目前二頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點一、DNA復制的概況（一）DNA半保留復制(semi-conservativereplication)子代分子DNA的一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的，這種復制方式叫半保留復制。[實驗證據(jù)]：

1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的密度梯度離心實驗。將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作Cscl密度梯度離心。目前三頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點密度梯度實驗

——實驗結果支持半保留復制的設想。含重氮-DNA的細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液第二代梯度離心結果[14N-15N][14N]DNA[15N]DNA[14N-15N]目前四頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點目前五頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點復制子(replicon)：基因組中能獨立進行復制的單位。復制起點：

DNA復制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復制起點(origin)。在復制起點形成“復制叉”。原核：僅含一個。真核：多個起點，形成多個“泡”或“眼”。復制方向：一個起點一個叉，同方向合成兩條鏈。一個起點2個叉，不同方向合成兩條鏈。（二）DNA復制的起點與方向目前六頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復制過程中形成的復制叉子代DNA

目前七頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點DNA的雙向和單向復制環(huán)狀DNA復制時所形成的θ結構起點復制叉的推進復制叉

起點

起點

起點復制叉復制叉未復制DNA單向復制雙向復制多起點復制目前八頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點二、原核生物DNA的復制DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymorase，PolⅠ）

——1956年,Kornberg首先從大腸桿菌提取功能特點聚合作用：5`→3`，在引物的3′延伸。合成20個核苷酸即離開模板，填充空隙。3`→5`外切酶活性：校對功能5`→3`外切酶活性：引物切除、損傷修復（一）參與原核生物DNA復制的酶和蛋白目前九頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點主要功能：填補岡崎片段產生的空隙校對功能切除引物，DNA損傷的修復目前十頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點DNA聚合酶催化的鏈延長反應3′5′5′3′3′5′5′3′

模板引物dNTPDNA聚合酶Mg2＋在5’-3’方向延伸目前十一頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結構和功能延長因子核心酶校對引物的結合和識別促使核心酶二聚化2.PolⅡ和PolⅢpol：

5’3’DNA合成3’5’外切酶活性，體內功能不清楚。polⅢ:主要負責DNA鏈的延伸。亞基作用：識別引物并使DNA母鏈與引物鏈結合。目前十二頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細胞的分子統(tǒng)計數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶活性5′-3′核酸外切酶活性活性DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++600120，000100++-30140，00010-20+++9000比較項目DNA聚合酶Ⅲ切除引物修復復制功能目前十三頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點（二）大腸桿菌DNA復制的起始DNA復制的不連續(xù)片段需要在引發(fā)體(primosome)作用下合成RNA引物。

新DNA的一條鏈是按5′-3′方向（與復制叉移動的方向一致）連續(xù)合成的，這股鏈稱為先導鏈（leadingstrand）。目前十四頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點（三）DNA鏈的延伸（1）岡崎片段和半不連續(xù)復制DNA復制中的不連續(xù)片段（約1000-2000個核苷酸）稱為岡崎片段(okazakifragment)。

新DNA的一條鏈是按5′-3′方向（與復制叉移動的方向一致）連續(xù)合成的，這股鏈稱為先導鏈（leadingstrand）。岡崎片段與半不連續(xù)復制目前十五頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點另一股鏈的合成是不連續(xù)的，即先按5′-3′方向（與復制叉移動的方向一致）合成若干短片段（岡崎片段），再通過酶的作用將這些短片段連在一起構成第二條子鏈，稱為后隨鏈（laggingstrand）。先導鏈連續(xù)復制而后隨鏈不連續(xù)復制，稱為半不連續(xù)復制（semidiscontinuousreplication

）

。岡崎片段與半不連續(xù)復制目前十六頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點DNA聚合酶在合成岡崎片段時，需要一個RNA短片斷作為引物(primer)。具有3’端自由羥基（3’-OH）。引發(fā)體(primosome)：由引物合成酶和多種蛋白因子組成復合物。作用：合成RNA引物，沿后隨鏈復制叉的行進方向移動，在不同部位，合成RNA引物。引物合成酶（primase）：以DNA為模板，自5’3’合成10-60核苷酸的RNA小片段。引物RNA上的核苷酸單位通過PolⅠ的5′→3′外切酶活力水解除去。通過PolⅠ的聚合酶活性配上與模板互補的脫氧核苷酸。（2）岡崎片段的RNA引物目前十七頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點（3）DNA連接酶（ligase）催化一條DNA鏈的3′-羥基與相鄰的另一條DNA鏈的5′-磷酸根之間的磷酸二酯鍵的合成。使岡崎片段相互連接形成后隨鏈。后隨鏈的生成步驟：起始：RNA引物的合成延長：向引物RNA3′-端添加DNA順序，合成短的DNA片段終止：RNA引物脫落并帶以相應的DNA順序，用共價鍵連接各DNA短片段目前十八頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈目前十九頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點（4）母本DNA雙鏈的分離DNA解鏈酶/DNA解螺旋酶（DNAhelicase）打斷氫鍵，使復制叉前方的DNA雙鏈解開。單鏈結合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB）結合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。旋轉酶（gyrase）/拓撲異構酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ）兼具內切酶和連接酶活力，松弛DNA超螺旋，便于解鏈。目前二十頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點（5）DNA聚合酶的“校對”作用DNA復制過程是一個高度精確的過程：起始時以RNA作為引物。DNA聚合酶的高度專一性（遵守嚴格的堿基配對規(guī)律）。DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’外切酶切除）。目前二十一頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配堿基復制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸目前二十二頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程

復制叉的移動方向旋轉酶PolⅢ解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導鏈后隨鏈3′5′復制的起始DNA鏈的延長DNA鏈終止5′RNA引物3′3′目前二十三頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點原核生物DNA聚合反應有關的酶類

旋轉酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物（1）DNA解鏈酶（DNAhelicase）（2）DNA旋轉酶（gyrase）（3）單鏈結合蛋白（SSB）（4）引物合成酶（primase）

（5）DNA聚合酶III（6）DNA聚合酶I（7）DNA連接酶（DNAligase）目前二十四頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點三、真核生物DNA的復制（1）真核細胞DNA復制有多個起始點。（2）至少有5種DNA聚合酶，即α、β、γ、δ、ε。（3）端粒由端粒酶（Telomerase）催化復制。目前二十五頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點生物細胞DNA復制的特點：1、復制是半保留的。2、復制起始于細菌或病毒的特定位置，真核生物有多個起始點。3、復制可以朝一個方向，也可以向兩個方向進行，后者更為常見。4、復制時，DNA的兩條鏈都從5′端向3′端延伸。5、復制時半不連續(xù)的。目前二十六頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點四、逆轉錄作用(reversetranscription)

——RNA指導下的DNA合成1970年Temin和Baltimore同時從致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶。逆轉錄作用：以RNA為模板在反轉錄酶催化下，由dNTP聚合成互補DNA

（cDNA）的作用，新生cDNA分子存有RNA基因組的信息。[體系]：RNA模板、反轉錄酶、引物、dNTP、Zn2+5’-3’方向聚合。進入細胞后放出病毒RNAcDNA整合進宿主染色體。利用反轉錄酶可制造任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的cDNA。目前二十七頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點反轉錄作用的意義：1、補充了中心法則。2、加深了對病毒致癌的認識。病毒致癌理論3、利用反轉錄酶，進行基因操作，制備cDNA。目前二十八頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點1、DNA復制需要：DNA聚合酶Ⅲ；(2)解鏈蛋白；(3)DNA聚合酶Ⅰ；(4)DNA指導的RNA聚合酶；(5)DNA連接酶參加。其作用的順序是：（）A、(4)(3)(1)(2)(5)B、(4)(2)(1)(3)(5)C、(2)(3)(4)(1)(5)D、(2)(4)(1)(3)(5)2、DNA上某段堿基順序為5’-ACTAGTCAG-3’，轉錄后的上相應的堿基順序為：（）A、5’-TGATCAGTC-3’B、5’-UGAUCAGUC-3’C、5’-CUGACUAGU-3’D、5’-CTGACTAGT-3’目前二十九頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點五、DNA的損傷與修復

DNADamage(Mutation)andRepair損傷原因：物理因素（紫外線、各種輻射），形成嘧啶二聚體化學因素（烷基化試劑、亞硝酸鹽、堿基類似物）

UV目前三十頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點遺傳物質的改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。在復制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。突變實質：DNA分子上堿基的改變。

生物自身具有精確、嚴密的DNA損傷修復系統(tǒng)，對于保護遺傳物質DNA不受破壞有重要意義。光修復、切除修復、重組修復、SOS修復。

目前三十一頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點1、直接修復光復活酶(photolyase)

UV目前三十二頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點2.切除修復（excisionrepair）內切酶在二聚體處切斷單鏈DNA；5′-核酸外切酶切除含嘧啶二聚體的寡核苷酸片段；DNA聚合酶在斷口處進行局部修復合成；連接酶將新合成的DNA鏈與原DNA鏈連接在一起。3.應急反應修復和重組修復目前三十三頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點六、DNA重組與克隆基因重組——在體外將目標基因的DNA片段與載體連接形成重組體。DNA克隆——由單一DNA片段復制成許多相同DNA片段的過程。目前三十四頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質粒④DNA重組⑤用重組質粒轉化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因⑦重組體的篩選DNA“克隆”過程目前三十五頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點本章重點半保留復制、半不連續(xù)復制、反轉錄、岡崎片段、多順反子、單順反子、前導鏈、后隨鏈參與DNA復制的有關酶類和蛋白質及DNA的復制過程目前三十六頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點PCR（polymerasechainreaction）是一種體外核酸擴增技術，類似于天然DNA復制。靶DNA分子變性解鏈；在4種dNTP存在和合適和條件下，由DNA聚合酶酶促反應，由5’－3’擴增延伸，形成兩條新的雙鏈DNA分子，并作為下一循環(huán)的模板；經(jīng)過30～50個循環(huán)，可使原DNA量擴增數(shù)百萬倍。9.聚合酶鏈式反應（PCR）技術與DNA擴增目前三十七頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點（七）細菌的限制—修飾系統(tǒng)限制性核酸內切酶——能識別DNA特定核苷酸序列的核酸內切酶。如果識別序列中的堿基被修飾，限制酶將無法起作用。限制性核酸內切酶識別的序列具有二次旋轉對稱性。限制性核酸內切酶酶切產生平頭末端或粘性末端。目前三十八頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點5′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—A—G—5′5′—GT—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—TG—5′粘性末端EcoRⅠ5′—G—T—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—T—G—5′5′—G—T—TA—A—C—3′3′—C—A—AT—T—G—5′平頭末端HpaⅠ.目前三十九頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)目前四十頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點RNA聚合酶全酶在轉錄起始區(qū)的結合目前四十一頁\總數(shù)四十六頁\編于二十點真核生物DNA聚合酶α、β、γ及δ四種，都有5`→3`聚合功能。α