化學(xué)合成分離技術(shù)

層析別離技術(shù)李旭琴2019-4-181層析法分類(1)按兩相的狀態(tài)來(lái)分：(2)按固定相的使用形式〔即實(shí)驗(yàn)技術(shù)〕分：柱層析(CC)、薄層層析(TLC)、紙上層析(3)按別離機(jī)制〔即物理化學(xué)性質(zhì)〕分：吸附層析、分配層析、離子交換層析、親和層析、凝膠過(guò)濾等(4)按展開方式分：洗脫法、迎頭法、置換法

流動(dòng)相固定相21.1柱層析原理1.2柱層析技術(shù)1.3柱層析本卷須知目錄1.柱層析(CC)2.薄層層析(TLC)31.1柱層析原理：吸附柱層析是利用吸附劑對(duì)混合試樣各組分的吸附力不同而使各組分別離。固定相：固體吸附劑流動(dòng)相：即洗脫劑

目前，我們最常用的就是以硅膠、氧化鋁兩種物質(zhì)為填充劑的色譜柱，常稱為：硅膠柱和氧化鋁柱。1.柱層析(CC)4

當(dāng)采用溶劑洗脫時(shí)，發(fā)生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的過(guò)程，由于不同的化合物吸附能力也不同，吸附力較強(qiáng)的組分，移動(dòng)的距離小，后出柱；吸附力較弱的組分，移動(dòng)的距離大，先出柱。吸附柱色譜通常在玻璃管中填入外表積大，經(jīng)過(guò)活化的多孔性或粉狀固體吸附劑。當(dāng)待別離的混合物流過(guò)吸附柱時(shí)，各種成分同時(shí)被吸附在柱的上端。柱層析原理：5上樣洗脫裝柱1.2柱層析技術(shù)柱層析的裝柱比較重要，裝柱的效果直接影響層析別離效果。因此，是制備性別離的一種根本操作技能。6稱量：200-300目硅膠，稱10-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。攪成勻漿：參加干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢琛Ｈ绻疵搫┦鞘兔?乙酸乙酯體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/甲醇體系，就用氯仿拌。裝柱步驟7(3)裝柱：將柱底用少許脫脂棉輕輕塞緊，再蓋一層厚的石英砂，關(guān)閉活塞，向柱中參加約1/3體積石油醚〔氯仿〕，翻開柱下活塞，將勻漿(硅膠或氧化鋁與溶劑的混合物)經(jīng)漏斗一次倒入柱中，使硅膠(或氧化鋁)自然沉降。再在上面加厚的石英砂。保持一定流速，不能使液面低于石英砂上層。(4)壓實(shí)：沉降完成后，參加更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無(wú)論走常壓柱或加壓柱，都應(yīng)進(jìn)行這一步，可使別離度提高很多，且可以防止過(guò)柱時(shí)由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂。8裝柱子〔添硅膠〕時(shí)，有兩種方法：即濕法裝柱和干法裝柱。濕法裝柱：是先把硅膠用適當(dāng)?shù)娜軇┌鑴蚝?，再填入柱子中，然后再加壓用洗脫劑“走柱子〞，本法最大的?yōu)點(diǎn)是柱子裝的比較結(jié)實(shí)，沒(méi)有氣泡。裝柱方法9干法裝柱干法裝柱：將干吸附劑〔未與洗脫劑混合〕裝柱，是直接往柱子里填入硅膠，至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至適宜高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會(huì)使得柱子裝的很結(jié)實(shí)。接著是設(shè)法將樣品加到上面，從柱項(xiàng)參加洗脫劑，“走柱子〞。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。10優(yōu)點(diǎn)是：較方便，別離效率高，別離效果與制備性薄層層析相似，可以將薄層層析的別離條件直接用于干柱層析，從而別離出更多量的化學(xué)成分。缺點(diǎn)在于：由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱，容易產(chǎn)生氣泡，這一點(diǎn)在使用低沸點(diǎn)的洗脫劑如乙醚，二氯甲烷時(shí)最為明顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易覺(jué)察，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時(shí)候，氣泡就會(huì)釋放出來(lái)，嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)柱子變花，樣品不可能平整地通過(guò)，當(dāng)然也就談不上別離了。解決的方法是：硅膠一定要填結(jié)實(shí)；一定要用較多的溶劑“走柱子〞，等到柱子的下端不再發(fā)熱，恢復(fù)到室溫后再撤去壓力。干法裝柱優(yōu)缺點(diǎn)11層析柱硅膠的用量一般是每別離1g產(chǎn)品使用30-100g硅膠柱子的形狀比例一般是內(nèi)徑:高度=1:8~10不管干法還是濕法，硅膠〔固定相〕的上外表一定要平整，并且硅膠〔固定相〕的高度一般為15cm左右，太短了可能別離效果不好，太長(zhǎng)了也會(huì)由于擴(kuò)散或拖尾導(dǎo)致別離效果不好。溶劑盡量使用能夠分開的極性最低的溶劑濕法裝柱時(shí)最好是先在底部裝有石英砂的柱子中預(yù)加溶劑再按濕法加料這樣能保證一開始參加的填料處于全濕狀態(tài)，杜絕氣泡剛裝的柱子在一段時(shí)間內(nèi)可能會(huì)有長(zhǎng)度變短的現(xiàn)象所以穩(wěn)定一段時(shí)間后再使用裝柱要領(lǐng)：要做到密實(shí)均勻無(wú)氣泡。經(jīng)驗(yàn)：萬(wàn)一裝柱時(shí)帶入氣泡，可從上端壓入大量溶劑將氣泡從下端擠出。裝柱注意12上樣:又稱加樣或樣品上柱。也有干法和濕法之分。干法上樣就是把待別離的樣品與易揮發(fā)溶劑混合后，再與吸附劑吸收、揮干揮發(fā)性溶劑后，撒布于柱的上端。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑〔最好就是柱層析所用的洗脫劑，如果溶解度不好，那么可以用一極性較大的溶劑，但必須少量〕將樣品溶解，再小心的參加層析柱項(xiàng)端的平面內(nèi)。濕法較方便。加樣的根本要求是均勻薄餅樣層。上樣13洗脫洗脫：柱層析所用的溶劑，習(xí)慣上稱為洗脫劑。洗脫操作的目的當(dāng)然是要將參加的樣品中各個(gè)組分先后從上往下帶出來(lái)，并能分開收集各成分。洗脫的過(guò)程中，上端溶劑不能干，分段收集是關(guān)鍵；下端燒杯定時(shí)換，薄層紙層化學(xué)檢；洗脫劑可隨意變，混合過(guò)渡為重點(diǎn)。1415收集的試管大小要以樣品量而定。一般采用幾個(gè)試管〔或錐形瓶〕進(jìn)行收集，通過(guò)對(duì)收集的幾瓶洗脫液進(jìn)行薄層分析判斷是否為需要的產(chǎn)物，合并需要的溶液，濃縮，經(jīng)過(guò)這樣的掐頭去尾就可以得到符合要求的樣品了。溶液接收及檢測(cè)161.3柱層析本卷須知：(1)先根據(jù)TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質(zhì)Rf值之差最大化。(2)棉花不要塞的太緊，否那么影響洗脫速度。(3)色譜柱要填裝緊密，將柱子必須裝平整、均勻(4)樣品層要上的薄，考慮有限柱填料的吸附量(5)可考慮用梯度法分開并洗脫(6)固定相要始終浸于溶液中，防止柱身干裂。(7)色譜柱的活塞不涂凡士林。17薄層層析是在玻璃板上涂布一層支持劑，待別離樣品點(diǎn)在薄層板一端，然后讓推動(dòng)劑從上流動(dòng)，從而使各組分得到別離的物理方法。常用的支持劑有：硅膠G、硅膠GF254、氧化鋁、纖維素、硅藻土等。使用的支持劑種類不同，其別離原理也不盡相同，有分配層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠層析等多種。2.薄層層析(TLC)2.1TLC原理18先做TLC檢視成分的多少主點(diǎn)和次點(diǎn)：點(diǎn)樣展開顯色2.2TLC分析技術(shù)以毛細(xì)管吸取樣品點(diǎn)在起跑線上，少量屢次，直徑不超過(guò)2mm，點(diǎn)完后，以紫外燈照射以確定濃度適當(dāng)。點(diǎn)樣：19顯色如果組分有色，可得到有色斑點(diǎn)，那么不需顯色；當(dāng)組分無(wú)色時(shí)，需要顯色。一般有兩種顯色方法：(1)紫外光顯色法：應(yīng)用鉛筆描出斑點(diǎn)位置。(2)顯色劑顯色法：用化學(xué)試劑作顯色劑，以顯示組分斑點(diǎn)的位置。20TLC分析技術(shù)影響Rf的主要因素：

(1)吸附劑

(2)溶劑體系

(3)樣品本身性質(zhì)

(4)溫度

(5)pH比移值：表示某組分移動(dòng)速率的快慢，用Rf

表示。ab21別離效果和所用硅膠有關(guān)系。不同廠家生產(chǎn)的硅膠可能含水量以及顆粒的粗細(xì)程度，酸性強(qiáng)弱不同，從而導(dǎo)致產(chǎn)品在各廠家的硅膠中別離效果有差異。鑒于此，硅膠一定要密封保存，防止吸潮。TLC所用的硅膠板一定要保存在枯燥器里面，或使用前在紅外烘箱里枯燥一段時(shí)間。溶劑的含水量和雜質(zhì)含量對(duì)別離效果都有明顯的影響。溫度對(duì)別離效果影響也很明顯。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，在夏天別離相同的產(chǎn)品，所需的洗脫劑極性要比在冬天小很多。22展開劑體系極性小的用石油醚：乙酸乙酯體系

極性較大的用氯仿：甲醇體系

極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸體系

拖尾可以參加少量氨水或冰醋酸TLC分析技術(shù)23選擇適當(dāng)?shù)恼归_劑是首要任務(wù)一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用單一溶劑，往往不能到達(dá)很好的別離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個(gè)高極性和低級(jí)性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區(qū)分度的作用，常用的溶劑組合有：石油醚:乙酸乙酯，石油醚:丙酮，石油醚:乙醚，石油醚:二氯甲烷，氯仿:丙酮，二氯甲烷:甲醇，氯仿:甲醇24展開劑的比例展開劑的比例要靠嘗試，一般根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個(gè)別離效果好的展開劑。很多時(shí)候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來(lái)到達(dá)最正確效果。一般把兩種溶劑混合時(shí)，采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑，如果有分開的跡象，再調(diào)整比例，到達(dá)最正確效果，如果沒(méi)有分開的跡象，最好是換溶劑。25

對(duì)于在硅膠中這種酸性物質(zhì)上易分解的物質(zhì)，在展開劑里往往加一點(diǎn)點(diǎn)三乙胺，氨水，吡啶等堿性物質(zhì)來(lái)中和硅膠的酸性。當(dāng)然，選擇所添加的堿性物質(zhì)，還必須考慮容易從產(chǎn)品中除去，氨水無(wú)疑是較好的選擇。展開劑262.3TLC本卷須知(1)某種樣品在這種展開劑中只顯示一個(gè)點(diǎn)，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個(gè)點(diǎn)。因此在尋找展開劑時(shí)，多嘗試幾種比例不同，成分不同的展開劑。展開劑的極性太小，點(diǎn)分不開，極性太大，也分不開。一般以目標(biāo)產(chǎn)物的Rf值在左右為最正確。(2)樣品點(diǎn)不能點(diǎn)得太濃，否那么容易重疊，不易判斷，因?yàn)槿绻麅蓚€(gè)點(diǎn)相近的話，一濃就變成一個(gè)點(diǎn)。(3)板上點(diǎn)的展開的清晰程度和溶劑的極性和物質(zhì)在該溶劑中的溶解性有關(guān)，只有兩者比較適宜了，才能有一個(gè)較好的別離效果。27TLC跟蹤反響在點(diǎn)板的時(shí)候往往是反響體系的混和溶液點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)A，每種難揮發(fā)的原料各點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)B,C,D等等，然后所有的原料和反響體系的混合溶液再共同點(diǎn)一個(gè)混合點(diǎn)X，這些點(diǎn)在板上的位置如下圖：28這樣的好處是展開后可以清楚地看見每個(gè)點(diǎn)的位置，把A這個(gè)點(diǎn)展開后的各個(gè)層份的點(diǎn)與B,C等原料比較，從而判斷原料消失沒(méi)有，點(diǎn)混合點(diǎn)X的目的在于，方便觀察，因?yàn)橛袝r(shí)候，板展開后，各點(diǎn)的位置有些變形，或者由于邊緣效應(yīng)等等，使得判斷不易。AXBCD29TLC判斷純度

利用TLC判斷物質(zhì)的純度時(shí)，往往要和NMR相結(jié)合，因?yàn)槟撤N樣品在這種展開劑中只顯示一個(gè)點(diǎn)，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個(gè)點(diǎn)。但由于1HNMR可鑒別的純度也就在95%左右，有時(shí)候1HNMR現(xiàn)示較純的東西，一點(diǎn)板就會(huì)發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)點(diǎn)。所以，兩者要結(jié)合使用。30W.ClarkStill,MichaelKahn,andAbhijitMitra,RapidchromatographictechniqueforpreparativeseparationswithmoderateresolutionJ.Org.Che