基因與基因組的結(jié)構(gòu)與功能

基因與基因組的結(jié)構(gòu)與功能第1頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一順反子一個基因一條多肽鏈4.2基因的命名基因的命名：基因名稱Leu,－Z（基因座）質(zhì)粒重組質(zhì)粒前面要加P,等等P76第2頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一表型和基因型某一機(jī)體可以觀察到的特征稱為表型（phenotype），與表型相應(yīng)的基因組成稱為基因型（genotype）。如細(xì)菌能否合成亮氨酸記為Leu+和Leu-，相應(yīng)的基因型為Leu+和Leu-。

等位基因

（1）二倍體細(xì)胞有2套基因，一套來自父本，另一套來自母本，每個細(xì)胞的全部基因均由2套基因組成，每一對基因稱做等位基因。

（2）由于突變作用引起DNA結(jié)構(gòu)變異，所以某一基因可具有若干種不同的形式，這種同一基因不同的形式互稱等信基因（allele）。第3頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一基因的基本結(jié)構(gòu)5’、、、AGCCGACTATGTCGAAGCTT、、、、、、GCTTGACTATAAGACA、、、3’3‘、、、TCGGCTGATACAGCTTCTAA、、、、、、CGAACTGATATTCTGT、、、5‘轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)貯存RNA或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息區(qū)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)第4頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.3基因組（gencme）細(xì)胞或生物中，一套完整單倍體遺傳特質(zhì)的總和（包括一種生物所需的全套基因及間隔序列）稱為基因組（P27）?；蚪M的結(jié)構(gòu)主要指不同的基因功能區(qū)域在核酸分列中的分布和排布情況，基因組的功能是貯存和表達(dá)遺傳信息。人類基因組包含多染色體和XY兩條性染色體上的全部遺傳物質(zhì)（核基因組）以及胞線粒體上的遺傳物質(zhì)（線粒體基因組）。（X免疫基因，男XY，女XX）。*1個配對（精子或卵子），1個單倍體細(xì)胞或1個病毒所包含的全套基因，稱為基因組。第5頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.3.2基因及基因組的大小與C值矛盾C值：真核生物單倍體基因組所包含的全部DNA總量稱為該物種的C值。C值愈大愈高等？關(guān)系密切的生物C值差異巨大？大量的DNA為非編碼序列。第6頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.4病毒及其基因組4.4.1病毒基因組特點(diǎn)簡單，信息總量少，只含一種核酸，有基因重疊，間隔序列很短，功能相關(guān)基因成簇，為一個轉(zhuǎn)錄單元；噬菌體基因是連續(xù)的，但也有許多病毒基因是不連續(xù)的。完整的病毒顆粒具有蛋白質(zhì)外殼，以保護(hù)病毒核酸不受核酸酶的破壞，并能識別和侵襲特定的宿主。類病毒例外，它是一類植物病毒，為很小的單鏈閉環(huán)RNA（250-400堿基）。第7頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一病毒核酸與所有的原、真核生物的核酸組比較，最為突出的特點(diǎn)是每種病毒顆粒只含1種核酸，或DNA或RNA，兩者不共存于1種病毒顆粒中，據(jù)此，病毒可以分成兩組，即DNA病毒和RNA病毒。病毒核酸分子量大?。篟NA病毒小106-107D，DNA病毒大；107-108D基因數(shù)：3-幾百個第8頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一一切烈性病毒（virulentvirus）都具備參下幾個時相的生活周期：（1）吸附；（2）核酸進(jìn)入細(xì)胞；（3）轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制；（4）病毒顆粒成熟；（5）釋放病毒顆粒。典型的生活周期為6-48小時，噬菌體為20-60分鐘。病毒對細(xì)胞功能的干予，最典型的是噬菌體（phage），當(dāng)其入菌后，立即接管了細(xì)菌的各種主要功能，細(xì)菌自身的DNA復(fù)制RNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，能量代謝等都停頓下來轉(zhuǎn)變成合成病毒的機(jī)器。有些動物病毒也有類似的情況，但非普通規(guī)律。相對而言，動物病毒和宿主細(xì)胞可以共存一段時間至病毒生活周期的后期才造成宿主細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p害，這些損害有如下3個類型：（1）抑制宿主RNA和DNA的合成。（2）核糖體合成受損。（3）蛋白質(zhì)合成受抑制是普遍現(xiàn)象。

與人類疾病有關(guān)的病毒屬于動物病毒，它包括8個DNA病毒科和12個RNA病毒科，這些病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能已基本清楚第9頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（二）病毒有（十）鏈RNA和（一）鏈RNA之分。

（十）RNA病毒（一）RNA概念極性和mRNA極性相同，與mRNA極性相反或與（十）RNA堿基順序也相同?；パa(bǔ)的RNA。作用1.作為模板（與mRNA一樣）必須依賴翻譯出病毒多肽或蛋白質(zhì)。RNA的RNA2.作為模板，合成（一）RNA，pol合成（十）可以以（一）RNA為模板RNA（mRNA）合成子代病毒RNA。才能翻譯出3.作為模板合成cDNA.病毒（即以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成DNA）。蛋白質(zhì)。RNA的序列基本相同，只是編碼鏈上的T在相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本上為U，由于轉(zhuǎn)錄本RNA編碼基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，DNA的這條鏈也由此命名為編碼鏈。編碼鏈又稱為有義鏈；模板鏈又稱為反義鏈。與RNA互補(bǔ)的鏈?zhǔn)秦?fù)鏈第10頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一二.病毒基因組結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)（P28）（一）病毒核酸可以是ssDNA、dsDNA或RNA分子，分子結(jié)構(gòu)有發(fā)夾、環(huán)狀、線型、節(jié)段型。以SSDNA,dsRNA最為突出。（二）基因重疊即同一段基因可以編碼2種或以上的基因產(chǎn)物這種現(xiàn)象在其它生物細(xì)胞僅見于線粒體和質(zhì)體DNA.所以是病毒核酸較為獨(dú)特結(jié)構(gòu)能使小小病毒攜帶較多的遺傳信息，原因是病毒基因閱讀框可以錯位（SV40）。第11頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（三）連續(xù)的和不連續(xù)的基因

病毒基因結(jié)構(gòu)特征往往與其宿主細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)相似。原核病毒（如噬菌體）基因是連續(xù)的，沒有內(nèi)含子；真核病毒（如多瘤病毒）基因是不連續(xù)的，有內(nèi)含子。有意思的是，有些真核病毒的內(nèi)含子或其中的一部分對某一基因來說是內(nèi)含子，對另一基因卻是外顯子。如SV40和多瘤病毒的早期區(qū)域就是這樣的。除了（+）RNA病毒外，真核病毒基因都是先轉(zhuǎn)成mRNA前體，再經(jīng)過剪接等步驟能成為成熟的mRNA.第12頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一(四)節(jié)段性基因大部分病毒核酸都是由一條雙鏈或單鏈構(gòu)成，少數(shù)病毒核酸由數(shù)個片段構(gòu)成。這類病毒一般度RNA病毒。如flu-v由6-7個片段構(gòu)成，各段在天然狀態(tài)下不連接，而且可以轉(zhuǎn)錄成6-7個片段相應(yīng)的mRNA。單獨(dú)的片段沒有感染性，感染要一起感染才發(fā)揮作用。(五)除了retro-v外，所有的病毒基因都是單倍體基因。即每個基因在某個病毒顆粒中只出現(xiàn)一次，即只有1套基因。(六)編碼區(qū)>非編碼區(qū)（95%/5%）。病毒核酸大多數(shù)順序都用來編碼蛋白質(zhì)。第13頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一(七)基因常常成簇排列，沒有間隔序列或間隔序列很小。功能相關(guān)蛋白質(zhì)基因在基因組的1個或幾個特定部位，叢集成簇被轉(zhuǎn)錄成多順反子，然后加工成各種蛋白質(zhì)的mRNA模板。如腺病毒晚期基因。(八)不規(guī)則的結(jié)構(gòu)基因1.幾個結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)不規(guī)則，因此有些結(jié)構(gòu)基因無翻譯起始序列。2.有的mRNA（=gene）沒有5’帽子，但有翻譯增強(qiáng)子。(九)DNA或RNA1種病毒基因組只是1種核酸。第14頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.4.2病毒的核酸正鏈（直接作為mRNA模板，反之為負(fù)鏈。第15頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.4.3典型病毒基因組4.4.3噬菌體基因組也可進(jìn)入裂解循環(huán)。噬菌體基因組為長度約為50kb的雙鏈DNA分子，噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在感染宿主后可進(jìn)入溶源狀態(tài)，實(shí)際大小為48502bp第16頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一病毒組裝組分基因病毒感染相關(guān)基因病毒復(fù)制相關(guān)基因第17頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一第18頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一ΦΧ174噬菌體基因組單鏈環(huán)狀，5386個核苷酸對，11個基因，3個轉(zhuǎn)錄單元，有重疊基因，基因間間隔區(qū)很小第19頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一5866bp63JFGHAA＊CD811036BKE第20頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一第21頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一SV40病毒基因組SV40（simiansarcomavirus40猴肉瘤病毒)屬乳多空病毒類，是最小的DNA病毒之一。它可長期潛伏于猴腎細(xì)胞，對新生倉鼠有致癌性，體外試驗(yàn)還可使多種屬細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。第22頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一1、基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

（1）雙鏈環(huán)狀DNA分子、MW3×103KD，長52436p,與4種組蛋白（H2A、H2B、H3及H4）綜合，與真核染色質(zhì)區(qū)別在于不含H1。

（2）基因組由早期基因、調(diào)控區(qū)和晚期基因構(gòu)成。①早期基因含有2個重疊基因，編碼T和t（T=tumor)抗原②晚期基因含3個重疊基因，編碼VP1（主），VP2和VP3（次）3種衣殼蛋白③調(diào)控區(qū)位早、晚期基因之間，長約4006p包括復(fù)制起點(diǎn)，啟動子和增強(qiáng)子，可調(diào)節(jié)基因組的復(fù)制及早、晚期基因的轉(zhuǎn)錄。第23頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一2、SV40病毒基因的表達(dá)

（1）啟動子位于調(diào)控區(qū)復(fù)制起點(diǎn)上游，其中含有RNAPOLII識別位點(diǎn)位于-21-26bp之間的TATA盒可啟動RNA轉(zhuǎn)錄起始準(zhǔn)確位置，一般不相差10個核苷酸。

（2）增強(qiáng)子在106-250位是2個串聯(lián)的含有72bp的完全重復(fù)順序，即為增強(qiáng)子，能增強(qiáng)SV40及異源基因的表達(dá)。（3）早期基因轉(zhuǎn)錄的mRNA前體選擇剪接形成不同的mRNA（TmRNA、t-mRNA)第24頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一3、病毒基因組的復(fù)制及基因表達(dá)調(diào)控

T抗原控制病毒的復(fù)制，啟動晚期基因轉(zhuǎn)錄。（1）早期基因T及t的表達(dá)受T抗原的反饋?zhàn)栌?，表現(xiàn)一種自我調(diào)節(jié)作用。（2）晚期基因表達(dá)需要T抗原及SV40DNA本身的復(fù)制。一般過程是，感染早期合成T、t抗原→T-方面抑制早期mRNA進(jìn)一步合成；另一方激活多種與DNA復(fù)制有關(guān)的酶，引發(fā)病毒的復(fù)制→進(jìn)而推動晚期RNA的合成，產(chǎn)生Vp蛋白（12h)→V-DNA+VP123→病毒顆粒。第25頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一腺病毒腺病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長約36kb，衣殼（capsid）呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑約80-110nm。以病毒DNA開始復(fù)制為分界線，按轉(zhuǎn)錄時間的先后，將腺病毒基因大致區(qū)分為早期（E1~4）和晚期轉(zhuǎn)錄單位（L1~5）。各種腺病毒基因又可以進(jìn)一步地分為更小的轉(zhuǎn)錄單位，如E1區(qū)可以進(jìn)一步分為E1A和E1B，每個轉(zhuǎn)錄單位都至少有一個獨(dú)特的啟動子。病毒的兩條鏈均有編碼功能。第26頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一腺病毒基因組的兩端各有一段100bp的反向末端重復(fù)序列（ITR），是復(fù)制的起始位點(diǎn)。在左端ITR的3′側(cè)有一段長約300bp的包裝信號（ψ）介導(dǎo)腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。對腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號（ψ）的約0.5kb的序列是順式作用元件，也就是說必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過輔助病毒（或細(xì)胞）反式補(bǔ)足。

第27頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核，就將進(jìn)行一系列的復(fù)雜而有序的逐級放大的剪切和轉(zhuǎn)錄過程。腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核后，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子首先與E1A區(qū)上游的增強(qiáng)子結(jié)合，表達(dá)E1A蛋白，該蛋白的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，使病毒DNA更易于在細(xì)胞中復(fù)制。E1A蛋白還可以激活其他早期基因（E1B、E2A、E2B、E3和E4）的啟動子，其中E2B驅(qū)動另外三個與病毒復(fù)制有關(guān)的早期基因轉(zhuǎn)錄單位末端蛋白前體（pTP,precursorterminalprotein）、單鏈DNA結(jié)合蛋白（ssDBP,single-strandedDNAbindingproteins）以及DNA聚合酶（DNApol,DNApolymerase）的表達(dá)，這三個基因的表達(dá)產(chǎn)物緊密地結(jié)合成一個復(fù)合物，與至少三種細(xì)胞蛋白相互作用，啟動病毒基因組的復(fù)制。第28頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一3逆轉(zhuǎn)錄病毒1.逆轉(zhuǎn)錄病毒一般分類

逆轉(zhuǎn)錄病毒可以說就是RNA腫瘤病毒。第一個被發(fā)現(xiàn)的RNA腫瘤病毒是勞氏肉瘤病毒（RousSarcomavivus,RSV,1911)。至今為止所發(fā)現(xiàn)的retro-v都能使動物致癌，如下。（1）肉瘤病毒（2）白血病病毒(leuremiavirus)（3）乳腺瘤病毒(mammazytumorvirus)和淋巴瘤病毒，如鳥類髓細(xì)胞瘤病毒（avianmyelocytoma,AMV)（4）人類嗜T細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒（humanT-lymphotropicretro-v,HTLV)HTLV-III現(xiàn)稱人類免疫缺陷綜合癥病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV)或AIDS病毒。第29頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一2.逆轉(zhuǎn)錄病毒基結(jié)構(gòu)特征(1)是RNA的復(fù)合體①2條(+)RNA單體正向平行,攜帶所有的遺傳信息,而且完全相同,為什么要求2條相同正鏈,意義不太清楚(怕基因丟失或損傷?)。②2條tRNA較小，是宿主tRNA(RSV是tRNAtrp），+RNA對于復(fù)制位置是至關(guān)重要。(2)5’端有m7Gppp帽,3’端有Poly（A）尾。第30頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一(3)編碼區(qū)（反式功能區(qū)）從5’→3’

非編碼區(qū)（順序功能區(qū)，調(diào)控區(qū))5’，3’都有①gag(groupantigen)編碼衣殼蛋①R區(qū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA必須區(qū)域②Pov(Polyrmerase)逆轉(zhuǎn)錄酶②PB區(qū)引物結(jié)合區(qū)③env(envelop)包膜蛋白③U區(qū)U3含啟動子，U5與轉(zhuǎn)錄終止加尾有關(guān)*④ONC(oncogene)癌基因④ψ(包裝信號),DLS(氫鏈結(jié)合位點(diǎn))如RSV是SRCC為調(diào)控區(qū)*有的retro-V有ONC。第31頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一3.逆轉(zhuǎn)錄病毒生活周期

（1）吸附可能所有的動物病毒受體都是表面糖蛋白（MLV的受體是左旋氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，受體與基因治療）。

（2）入胞逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄，翻譯。

①逆轉(zhuǎn)錄——前病毒基因組（cDNA)的形成RNA+逆轉(zhuǎn)錄酶→宿主胞漿→逆轉(zhuǎn)錄→（RNA為模板，+RNA為引物）→cDNA（見第四章）→進(jìn)入核→隨機(jī)整合宿主染色體→形成前病毒。cDNA形成新的重復(fù)(U3-R-U5)稱LTR(longterminalrepeat長末端重復(fù)順序）。cDNA含有RNA全部信息且較RNA長。

第32頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一逆轉(zhuǎn)錄酶除了逆轉(zhuǎn)活性外，還至少還有3種活性：即RNaseH活性，內(nèi)切核酸酶活性（特異地切斷基因組3’端RNA,作為“+”鏈DNA的引物）和以“-”鏈DNA為模板合成“+”鏈DNA的活性。第33頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一②轉(zhuǎn)錄——病毒基因組的形成U3區(qū)啟動子啟動前病毒基因組轉(zhuǎn)錄出從5’區(qū)至3’R區(qū)的RNA。③翻譯gag、env、polGag（編碼衣殼蛋白）——全長RNA能直接作為gag基因mRNA，進(jìn)行翻譯。但有90%的mRNA只譯出gag多蛋白質(zhì)，經(jīng)肽鏈加工裂解為衣殼蛋白。pol——RNA序列有干擾gag終止碼的序列，使約10%mRNA在翻譯過程中，直至pol的終止碼，經(jīng)翻譯后加工裂解，形成衣殼蛋白，逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶(integrase)。env——一部分全長mRNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后的剪接，使env編碼區(qū)與病毒RNA5’端帽子連接在一起→envmRNA→包膜糖蛋白。第34頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（3）病毒顆粒成熟←包裝←ψ（基因治療）RNA5’端PB-區(qū)與宿主tRNA以氫鏈相連形成復(fù)合體→包裝→病毒顆粒。（4）釋放子病毒→感染其它細(xì)胞。第35頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.逆轉(zhuǎn)錄病毒引起白血病的3種機(jī)理.(以此說明RNA腫瘤病毒的致癌作用與基因組類型.)

(1)急性逆轉(zhuǎn)錄病毒(2)慢性逆轉(zhuǎn)錄病毒(3)HTlV(人類嗜T細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒)①含onc*①不含onc①含tat的HTLV②可在數(shù)周內(nèi)使培養(yǎng)②不能轉(zhuǎn)化,但V感染②含使培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,機(jī)理和1、2細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化.整體動物潛伏數(shù)月致癌.不同。③onc插到宿主DNA中③前V整合到proto-onc③反式調(diào)控作用，tot插入→去產(chǎn)生致癌mRNA癌基前,病毒LTR啟動子增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄mRNA→tat蛋白作用于因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)胞致癌.子啟動增強(qiáng)c-onc表達(dá),TGF-β1等→使細(xì)胞增殖永生改變細(xì)胞生長特性.化。第36頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一人類免疫缺陷病毒基因組（HIV）獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）1981年在美國首先發(fā)現(xiàn)，其病原是一種破壞人免疫系統(tǒng)的retro-V.1986年命名為HIV。HIV特異性侵犯并損耗T細(xì)胞造成機(jī)體免疫缺陷，最后并發(fā)各種嚴(yán)重感染和惡性腫瘤，成為艾滋?。ㄕ劇鞍鄙儯?。因該病無特效治療，病死率幾乎為100%。1.HIV感染的流行病學(xué)（節(jié)選）（1）我國流行特征：①發(fā)現(xiàn)較早,流行仍屬低下，但呈明顯上升趨勢。②分布地區(qū)廣，表現(xiàn)形式多。③年齡范圍廣，以青壯年為主，男女比為11.5/1。④感染途徑多，但通過性傳播日顯重要。⑤感染者的發(fā)現(xiàn)比重明顯從外籍人員轉(zhuǎn)向國內(nèi)居民。第37頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（2）HIV感染的危險(xiǎn)因素增加①性傳播疾病發(fā)生率有增無減.②流行人口增加,估計(jì)全國流動人口達(dá)12000萬,年齡20-29,正處于性活躍期。③性觀念,性行為改變.④吸毒、販毒劇增，吸毒者往往有性亂，女性則賣淫。⑤醫(yī)源性傳播控制工作及宣傳防治工作薄弱。專家認(rèn)為中國大陸HIV疫情持續(xù)上升，如超過一定數(shù)量，將出現(xiàn)暴發(fā)流行。HIV為分為HIV-1和HIV-2兩個型。HIV-1是感染的主要毒株，一旦感染，終身帶毒，進(jìn)展快，預(yù)后差。HIV-2感染的潛伏期長，致病性低。中國存在HIV-1A、B、B‘、C、E五個亞型。第38頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一2.HIV的生物學(xué)特性（見分子病毒學(xué)）3.HIV基因組結(jié)構(gòu)和功能（1）HIV基因組為SS（+）RNA，HIV-19.3kb，HIV-29.7kb，5’端有帽，3’端poly(A）尾含3個結(jié)構(gòu)基因，至少6個調(diào)節(jié)基因。（2）LTR（長末端重復(fù)順序）與結(jié)構(gòu)基因。①LTR含啟動子、增強(qiáng)子、負(fù)調(diào)節(jié)元件及哺乳動物組胺轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等。②gag編碼病毒核心結(jié)構(gòu)蛋白③pol編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶。④env編碼包膜蛋白第39頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（3）HIV調(diào)節(jié)基因①tat反式激活轉(zhuǎn)錄基因②rev病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子③vif病毒侵染性因子④nef負(fù)調(diào)節(jié)子⑤vpr病毒蛋白R⑥vpu病毒蛋白U⑦vpx病毒蛋白X僅存于HIV-2中.第40頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.5細(xì)菌基因組Prokaryoticgenome以細(xì)菌為代表講述，有稱bacteriagenome。細(xì)菌對醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)有重要貢獻(xiàn)，是基因工程研究的主要材料之一。因?yàn)椋?.構(gòu)造相對簡單，基因結(jié)構(gòu)也不復(fù)雜，取材便利，易于培養(yǎng)，可選擇突變株進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易重復(fù)。（如選擇DDDPI缺乏的Ecoli突變株，Ecoli仍可合成DNA，說明酸I對EcoliDNA合成不起作用。）2.與人類有共同的要子生物學(xué)規(guī)律可，如：（1）遺傳物質(zhì)都是DNA；（2）主要的功能分子都是蛋白質(zhì)；（3）基因密碼是通用的，等等。3.尤其是E.coli,是分子克隆是“明星“,基因工程主要原因的工程菌，因?yàn)榛蚬こ痰闹饕ぷ魇强寺】撕嘶蛟谠讼到y(tǒng)中表達(dá)。第41頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一一、原核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)1.基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成。其DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合，但并不形成染色體結(jié)構(gòu)，只是習(xí)慣上將之稱為染色體。細(xì)菌染色體DNA在胞內(nèi)形成一個致密區(qū)域，即類核（nucleoid），類核無核膜將之與胞漿分開。2.基因組中只有1個復(fù)制起點(diǎn)。3.具有操縱子結(jié)構(gòu)。操縱子（operon）是指數(shù)個功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動和操縱區(qū)）及其下游的轉(zhuǎn)錄終止信號構(gòu)成的基因表達(dá)單位。（見第六章）4.結(jié)構(gòu)基因無重疊現(xiàn)象，基因組中任何一段DNA不會用于編碼2種蛋白質(zhì)。5.基因序列是連續(xù)的，無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。第42頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一6.編碼區(qū)和非編碼區(qū)（主要是調(diào)控序列）在基因組中約各占50%。（5%，95%）7.基因組中的重復(fù)序列很少。編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝，但編碼rRNA的基因往往是多拷貝的，這有利于核糖體的快速組裝。（15AA/秒，2AA/秒）8.具有編碼同功酶的基因（isogene）這是一類結(jié)構(gòu)不完全相同，而功能相同的基因。如E.coli含有2個編碼乙酸乳酸合成酶的基因和2個編碼分支酸變位酶同工酶的基因。9.細(xì)菌基因組中存在可移動的DNA序列，包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。10.原核基因的基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：啟動子（promoter）、操縱基因（operator）、調(diào)控序列、結(jié)構(gòu)基因（structuregene）、終止子（terminator）。（見第六章）第43頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一二、染色體外的遺傳物質(zhì)———質(zhì)粒（一）概念

1.質(zhì)粒（plasmid）是獨(dú)立于許多細(xì)菌及某些真核細(xì)胞染色體外共價閉合環(huán)狀的DNA分子（covalantclosedcircnlar,cccDNA），能獨(dú)立復(fù)制的最小遺傳單位。（P35-6）

2.質(zhì)粒是雙鏈的DNA分子，大小在1—200kb之間，和病毒不同，它們沒有衣殼蛋白（裸DNA）。第44頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一

從生化學(xué)來說，除酵母的殺傷質(zhì)粒（killerplasmid）是RNA外，其余質(zhì)粒是染色體外的cDNA分子。

從遺傳學(xué)來說，質(zhì)粒是與宿主染色體有別的復(fù)制子（真核細(xì)胞分裂過程中，DNA纖維分成許多復(fù)制單位，該單位稱為復(fù)制子）。在細(xì)胞分裂時能恒定傳遞給交代細(xì)胞的獨(dú)立遺傳因子或能在胞內(nèi)寄生和復(fù)制的復(fù)制子。第45頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一3.質(zhì)粒與宿主細(xì)胞的關(guān)系（1）質(zhì)粒對宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主細(xì)胞中，既不殺傷細(xì)胞，對宿主的代謝活動也無影響，宿主離開質(zhì)粒照樣的生存下去。（2）質(zhì)粒離開宿主就無法生存，只有依賴宿主細(xì)胞的（酶和蛋白質(zhì)）幫助，才能完成自身的復(fù)制（擴(kuò)增）、轉(zhuǎn)錄。（3）質(zhì)粒經(jīng)常為宿主執(zhí)行一些適當(dāng)?shù)倪z傳功能，作為對宿主細(xì)胞的補(bǔ)償（“交房租”）。（4）質(zhì)粒賦于宿主各種有利的表型（質(zhì)粒編碼蛋白質(zhì)或酶），使宿主獲得生存優(yōu)勢，與我們基因工程實(shí)驗(yàn)緊密相關(guān)的，如抗生素抗性基因：Ampr酶，水解β-內(nèi)酰胺環(huán),解除氨關(guān)毒性,使細(xì)菌抗氨關(guān)。Tetr膜蛋白,可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞,使細(xì)菌抗四環(huán)素。第46頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)和研究意義

1）理論意義質(zhì)粒能夠復(fù)制、傳遞和表達(dá)遺傳信息，從分子遺傳學(xué)觀點(diǎn)來看是一種有機(jī)體，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一塊體重要基石。

2）實(shí)踐意義是基因工程的重要載體（vector），能把外源基因（目的基因）送到宿主細(xì)胞中去克隆擴(kuò)增或克隆表達(dá)（見第八章）。

①質(zhì)粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任務(wù)之一就是嚴(yán)格改造質(zhì)粒的同時，控制質(zhì)粒不傳遞，若一個致癌質(zhì)粒可以傳遞就會傳到外都是。

第47頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一②作為基因工程載體的3個特點(diǎn)：A.都能獨(dú)立自主的復(fù)制；B.都能便利的加以檢測（抗生素抗性）；C.都能容易引進(jìn)宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化（提質(zhì)粒）。質(zhì)粒符合上述3個條件?；蚬こ讨兄饕褂萌斯?gòu)建的質(zhì)粒。第48頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（二）質(zhì)粒的分類

1.按質(zhì)粒的復(fù)制機(jī)理，分為2類：1）嚴(yán)謹(jǐn)控制型（stringentcontrdtype）

2）松弛控制型（relaxedcontroltype）(1)拷貝數(shù)少，一般<10個，分子量大；(1)拷貝數(shù)多，10-200個，分子量??；(2)復(fù)制受限，受細(xì)菌宿主DNA復(fù)制系(2)復(fù)制不受細(xì)菌DNA復(fù)制系統(tǒng)限制，統(tǒng)的控制；僅需DDDPI，當(dāng)宿主蛋白質(zhì)合成受抑制(3)特點(diǎn)是這類質(zhì)?？梢宰詡鬟f；時（如培養(yǎng)中加入氯要素時），其拷貝(4)嚴(yán)謹(jǐn)控制機(jī)理（低拷貝原因），認(rèn)數(shù)可猛增至1000-3000之多，該性質(zhì)對為是該質(zhì)粒可以產(chǎn)生阻逼蛋白，反饋基因工程技術(shù)十分有利。抑制自身DNA合成。3）分子量小，不具備自傳遞能力；4）基因工程使用松弛型（高拷貝數(shù)）質(zhì)粒，以獲得列多的基因產(chǎn)物。*拷貝數(shù)（copynumber)—細(xì)胞所含的按每—基因組計(jì)算的某種質(zhì)粒或基因的數(shù)目。第49頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一2.按分子量大小，分為2類1）小型質(zhì)粒，<15kb

2)大型質(zhì)粒>15kb小型質(zhì)粒，無接合和自傳遞能力，在按多屬接合型或自傳遞型，大型質(zhì)粒只合質(zhì)粒協(xié)助也能轉(zhuǎn)移，也可心通過轉(zhuǎn)化能通過細(xì)菌的接合作用人一個細(xì)菌作用進(jìn)入受體細(xì)胞，這類質(zhì)粒種類較多，傳到另一個細(xì)菌。（如F質(zhì)粒）。幾乎每種細(xì)菌都可以含有2種以上，基因工程一般用小型質(zhì)粒。第50頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一3.按質(zhì)粒轉(zhuǎn)移方式，分為3類1）接合型質(zhì)粒（conjugaativeplasmid）帶有效接觸基因質(zhì)粒，只能使細(xì)菌接合，本身不被傳遞.2）可移動質(zhì)粒（mobiliableplasmid）可以被傳遞，但不能使細(xì)菌接合型與可移動性共存時，能傳遞可移動質(zhì)粒。3)自傳遞質(zhì)粒（selftranmissibleplasmid）兼具1）2）兩種功能因而可以自傳遞，如F質(zhì)粒。

*轉(zhuǎn)化作用（transformation）—這是涉及細(xì)菌攝入外源DNA而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移一種機(jī)制。（見第八章）第51頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（三）質(zhì)粒的功能質(zhì)粒的功能主要通過質(zhì)粒本身攜帶的基因偏碼蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來。攜帶質(zhì)粒的宿主細(xì)胞可表現(xiàn)出相應(yīng)表型。1.性質(zhì)粒即雄性細(xì)菌F質(zhì)粒，它本身轉(zhuǎn)到F-宿主細(xì)胞時，使后者變成F+，改變宿主細(xì)菌性別。2.抗生素抗性抗藥性（R）質(zhì)粒使細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性，這種抗藥性抗性基因也可以轉(zhuǎn)移到缺乏這種抗藥基因的細(xì)菌體內(nèi)，使之產(chǎn)生抗藥性。3.產(chǎn)生毒素的質(zhì)粒如col質(zhì)粒能產(chǎn)生大腸桿菌素因子（colicin），殺死不合該毒素的親緣細(xì)菌。4.降解復(fù)雜的有機(jī)化合物作為能源質(zhì)粒。5.產(chǎn)生限制和修飾酶。（見第八章）第52頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（四）質(zhì)粒的基本特性

1.自主復(fù)制

質(zhì)粒的復(fù)制是自主調(diào)節(jié)的，不受染色體復(fù)制調(diào)節(jié)因素的影響。復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)由質(zhì)粒上的復(fù)制起點(diǎn)（ori），質(zhì)粒的rep基因和cop基因組成。Rep蛋白啟動質(zhì)粒的復(fù)制，cop基因本身或其表達(dá)產(chǎn)物可抑制復(fù)制作用，從而控制質(zhì)的拷貝數(shù)。

2.質(zhì)粒的不相容性

利用相同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒不能共存于同一個細(xì)胞內(nèi)。

PMB和COLEI是兩個密切相關(guān)的復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)，帶有PMB和COLEI復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)的質(zhì)粒是不相容的。但它們與帶有PSC101或P15A復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)是完全相容的，可以共存于一個細(xì)胞內(nèi)。不相容性使質(zhì)粒能夠很容易被克隆。

3.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性在自然條件下，在些質(zhì)?？梢酝ㄟ^細(xì)菌接合作用在細(xì)菌細(xì)胞向傳遞?；蚬こ讨谐Ｓ玫馁|(zhì)粒載體缺乏轉(zhuǎn)移所需的基因（mob基因），不能通過接合作用在細(xì)胞間傳遞，但可采用人工方法轉(zhuǎn)化到細(xì)菌細(xì)胞中。第53頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（四）細(xì)菌有限制—修飾系統(tǒng)細(xì)菌的限制—修飾系統(tǒng)是分別由特定的基因編碼的限制酶和修飾酶組成的二元系統(tǒng)。1.防御外源性DNA入侵。2.構(gòu)成細(xì)菌種屬和菌株之間交叉繁殖屏障，但又允許外源DNA有某些遺漏，利于物種進(jìn)化。3.基因工程重要的工具酶。（350/400）甲基化酶1.保護(hù)自身DNA不受限制酶切割（限制）。2.影響DNA分子構(gòu)象，利于基因表達(dá)調(diào)控。限制酶和甲基化酶辯證關(guān)系。第54頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.6真核生物基因組

4.6.1真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.分子量大，比原核細(xì)胞大10倍以上。P892多條，線狀。多復(fù)制起點(diǎn)3、DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合，可以形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)4、分為胞質(zhì)區(qū)和核區(qū)，轉(zhuǎn)錄和翻譯在實(shí)踐和空間分隔。5、重復(fù)序列6、多為單拷貝基因7、有跳躍基因8、有內(nèi)含子第55頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.6真核生物基因組

4.6.1真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(一)真核基因的基本結(jié)構(gòu)1.結(jié)構(gòu)基因、內(nèi)含和外顯子、斷裂基因。（1）結(jié)構(gòu)基因（structuralgene）指能轉(zhuǎn)錄成為mRNA、rRNA或tRNA的DNA順序。（2）內(nèi)含子和外顯子真核生物的結(jié)構(gòu)基因是不連續(xù)的，編碼序列被非編碼序列打斷，在編碼序列之間的序列稱為內(nèi)含子（intron），編碼序列稱為外顯子（extron）。（3）斷裂基因（splitgene）在真核類結(jié)構(gòu)基因組中，編碼順序被許多稱為內(nèi)含子的非編碼區(qū)分割成幾段稱之。第56頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一斷裂基因mRNA的前體是核內(nèi)不均一RNA，實(shí)驗(yàn)證據(jù)P90，不連續(xù)基因是普遍現(xiàn)象（原核極為少見，古細(xì)菌和噬菌體中發(fā)現(xiàn)了斷裂基因）斷裂基因共性：外顯子排列順序與產(chǎn)物相同，在不同組織中其內(nèi)含子成分相同，內(nèi)含子突變不影響蛋白產(chǎn)物，第57頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一內(nèi)含子外顯子的相互關(guān)系概念P92n,n+1,內(nèi)含子，外顯子內(nèi)含子兩端有高度保守的序列，P92內(nèi)含子分類第58頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一3.內(nèi)含子的分類根據(jù)基因的類型和剪接的方式，通常把內(nèi)含子分為4類I：主要存在于線粒體、葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因；II

：是常見的形成套索結(jié)構(gòu)后剪接，大多數(shù)mRNA基因有此類內(nèi)含子；IV：是tRNA基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的內(nèi)含子，剪接過程需酶及ATP。第59頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一G外顯子－內(nèi)含子邊界外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征，如:內(nèi)含子的5‘端或稱供體位（donorsite）常見的順序?yàn)?’－AG↓GTTAAGT-3’；3’端又稱受體位（acceptorsite),多為5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；第60頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一II型基因（由RNA聚合酶II催化的）內(nèi)含子5′端與外顯子3′端均具有GT序列，內(nèi)含子3′端與外顯子5′端均具有AC序列，這種內(nèi)含子稱為主型內(nèi)含子。同一基因在不同組織中其內(nèi)含子外顯子數(shù)目長度位置會有變化。第61頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一內(nèi)含子功能？促進(jìn)重組促進(jìn)重組，利于兩條DNA分子間的連接，增加基因組復(fù)雜性內(nèi)含子里也有可能含有可讀框；內(nèi)含子外顯子是相對的；含剪接信號產(chǎn)生核仁小RNA對基因表達(dá)產(chǎn)生影響第62頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與外顯子內(nèi)含子關(guān)系一個外顯子一般對應(yīng)于一條多肽鏈折疊而成的結(jié)構(gòu)域。邊界序列可以精確地對應(yīng)蛋白質(zhì)折疊的鉸鏈區(qū)。第63頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一不連續(xù)基因的分子進(jìn)化結(jié)構(gòu)基因來源于以外顯子作為模板構(gòu)成的嵌合體?；蜻M(jìn)化中，外顯子可以發(fā)生復(fù)制不同基因間，外顯子可以重復(fù)出現(xiàn)。第64頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一3真核生物基因組的序列異質(zhì)性也就是序列的不均一性。可以通過復(fù)性動力學(xué)反應(yīng)基因組序列復(fù)雜性。第65頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一DNA復(fù)性與Cot分析K復(fù)性速度常數(shù)第66頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一Cot1/2=1/kXDNA序列復(fù)雜度，量綱為核苷酸對的長度第67頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一DNA的復(fù)雜度通過與已知復(fù)雜度的標(biāo)準(zhǔn)DNA相比較而確定。復(fù)雜度以DNA的相對長度描述DNACot1/2／E.coli的DNACot1/2＝DNA復(fù)雜度／4.2＊106bp(P98)根據(jù)復(fù)性快慢將同一物種的總DNA分為幾個部分，也可以計(jì)算DNA的長度，和化學(xué)測定法結(jié)合測定序列的重復(fù)頻率。第68頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一據(jù)出現(xiàn)的頻率不同可將DNA序列分為3類：1.高度重復(fù)序列在基因組中的重復(fù)次數(shù)>1052.中度重復(fù)序列在基因組中的重復(fù)次數(shù)為101-1053、低度重復(fù)序列在基因組中的重復(fù)次數(shù)為2－10拷貝4.單拷貝序列在整個基因組中出現(xiàn)1次或少數(shù)幾次P101真核生物基因組的序列類型第69頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一散在重復(fù)順序是人類基因組中非串聯(lián)非反向的重復(fù)順序，包括少數(shù)活躍的轉(zhuǎn)位因子，根據(jù)重復(fù)序列的長度可將該家族分為2個主要類型，短散在核元件和長散在核元件。1.SINEs(shatinterspersednuclearelements)2.LINES(longinterspersednuclearelements)

代表Alu家族(逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)

KpnI家族（1）序列中含Alu限制酶位點(diǎn)（1）序列中含KpnⅠ限制酶位點(diǎn)（2）基因組中重復(fù)數(shù)3-5×105（2）全長6-7kb（3）Alu順序之間間隔:3-5kb（3）KnpⅠ消化后可見4條帶（4）相對集中在染色體R帶（4）集中分布在染色體G或Q帶

逆轉(zhuǎn)來轉(zhuǎn)座子RNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)座,合成cDNA→基因組編碼組蛋白、5SRNA，TRNA的基因也是中度重復(fù)序列第70頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一真核基因組中的轉(zhuǎn)座子

在真核基因組中，編碼序列在染色體中的位置相對比較穩(wěn)定，但一些中度重復(fù)序列往往是可移動的。通常為RNA編碼。在些可移動成分的結(jié)構(gòu)與原核基因組的轉(zhuǎn)位因子相似，是通過DNA介導(dǎo)的。

而另外一些中度重復(fù)序列的轉(zhuǎn)移成分，要先轉(zhuǎn)錄成RNA，再逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,然后重新整合到基因組中，這種逆轉(zhuǎn)錄旁路的轉(zhuǎn)移成分稱為逆轉(zhuǎn)錄座子（retroposon），是RNA介導(dǎo)的。第71頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一衛(wèi)星DNA簡單重復(fù)序列，異染色質(zhì)區(qū)，梯度離心時，主DNA峰之外的小峰，小衛(wèi)星DNA微衛(wèi)星DNA第72頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)位因子

轉(zhuǎn)位因子（transposableelement）即可移動的基因成分（可移動基因，movablegenemob），是指能夠在一個DNA分子內(nèi)部或兩上DNA分子之間移動的DNA片段。在細(xì)菌中指在質(zhì)粒和染色體之間或在質(zhì)粒和質(zhì)粒之間移動的DNA片段（文獻(xiàn)上有時形象地稱其為是跳躍基因，jumpinggene）。轉(zhuǎn)位也是DNA重組的一種形式。

第73頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一移動基因最早由美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室（coldspringHarborLaboratory）的女科學(xué)家B.MClintock于上個世紀(jì)40年代晚期在玉米中首次發(fā)現(xiàn)的。60年代，為J.A.Shapirc研究大腸桿菌高效突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)。1983年榮獲諾貝爾生物學(xué)醫(yī)學(xué)獎。第74頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（一）轉(zhuǎn)位因子的種類及特征細(xì)菌的轉(zhuǎn)位因子包插入序列，轉(zhuǎn)座子及可轉(zhuǎn)座的噬菌體。1.插入序列（insertionsequence,IS）IS的形體圖TSTranspcsasegeneTSIRIRTStargetsite靶位點(diǎn)Transposasegene轉(zhuǎn)位酶基因IRinvertedrepeated反向（倒轉(zhuǎn)重復(fù)順序）第75頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（1）IS是一類較小的轉(zhuǎn)位因子，長度約700-2000bp，按發(fā)現(xiàn)順序IS1、IS2…命名，只攜帶轉(zhuǎn)移的必需基因，不含有其它偏碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因，本身沒有表型效應(yīng)。（2）IS兩側(cè)為反向（倒轉(zhuǎn)）重復(fù)順序（16-41bp），中間為轉(zhuǎn)位酶基因，在插入新的位點(diǎn)側(cè)有3~116p順向重復(fù)順序（directwrepeatedsequencedk）,DR是靶位點(diǎn)序列復(fù)制的產(chǎn)物。（3）IS到處活動，可以插入到E.coli染色體的各個位置上，也可以插入到質(zhì)粒和某些噬菌體基因組上，甚至同一基因不同位點(diǎn)上。這種插入作用可以雙向進(jìn)行，可以是正向，也可以是反向插入IS這種移動方式稱為轉(zhuǎn)位作用（transposition）。（4）在一個世代的107細(xì)菌中有1次插入。*TR（反向倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列）：GGAAGGT、、、ACCTTCCCTTCCA、、、TGGAAGG*DR（正同向重復(fù)序列）：TACGTTACGT第76頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一2.轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn）(1)Tn是一類較大的可移動成分，除mobgene外，尚含有其它基因，如抗藥基因等。Tn是在研究抗藥基因中發(fā)現(xiàn)的，由此知道抗藥基因可在質(zhì)粒之間，質(zhì)粒與染色體之間或質(zhì)粒與可轉(zhuǎn)座的噬菌體之間來回移動，Tn的轉(zhuǎn)位原理和Is基本相同，轉(zhuǎn)位頻率為10-3~10-6/拷貝。(2)根據(jù)結(jié)構(gòu)特征的不同，Tn可以分為2個亞類：

① 復(fù)合型Tn:轉(zhuǎn)座酶由IS編碼，IS可以是反向（或正向）重復(fù)構(gòu)型。② TnA:數(shù)個結(jié)構(gòu)基因（mob、mdr等）十IR組成。

StructuralgenesIRIRStructuralgeneIS1IS1第77頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一3.可轉(zhuǎn)座的噬菌體（transposablephage）(1)包括Mu和D108兩種噬菌體，是一類溫和噬菌體*。(2)感染細(xì)菌后，可以整合到細(xì)菌染色體中，插入位點(diǎn)是隨機(jī)的（而入phage插入位點(diǎn)是專一的），可以插到結(jié)構(gòu)基因內(nèi)部，引起突變，Mu即Mutator(突變子)因此得名。(3)插入部位的2側(cè)有短的DR，插入時，一個拷貝留在原位，新合成的拷貝插入新的部位。(4)和IS，Tn相比，Mu末端不含IR，這是可轉(zhuǎn)座成分的一個例外。第78頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一*噬菌體（phage）—是侵襲細(xì)菌的病毒，主要由蛋白質(zhì)和核酸組成。噬菌的生活周期分為①溶菌周期和②溶原周期。溶原性噬菌體（溫和噬菌體）→宿主菌→將自身DNA整合到細(xì)菌染色體中→和細(xì)菌染色體一起復(fù)制→隨細(xì)菌增殖傳到細(xì)菌子代中去，不產(chǎn)生子代Phage.第79頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一(二)轉(zhuǎn)位作用的機(jī)理1.復(fù)制性轉(zhuǎn)位機(jī)理共聯(lián)體生成和解離，靶序列的切割與復(fù)制。2.非復(fù)制型轉(zhuǎn)位作用轉(zhuǎn)位將供體DNA轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)各切斷一條單鏈并與靶序列的兩個游離末端連接，隨后并沒有復(fù)制過程，而是由轉(zhuǎn)座酶將供體DNA轉(zhuǎn)座因子的另一端也切斷，因此在供體DNA留下一個致死性缺口。轉(zhuǎn)座子的兩條游離單鏈在靶位點(diǎn)退火接合，DNA聚合酶項(xiàng)平缺口。第80頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一（三）轉(zhuǎn)位的遺傳效應(yīng)1.基因重排可能產(chǎn)生1個新的蛋白分子等，基因重排是進(jìn)化的動力。2.基因突變插入到基因內(nèi)部，可引起插入失活。3.插入位點(diǎn)引入新的基因如引進(jìn)抗藥基因。第81頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一真核生物的基因家族和基因簇基因家族(genefamily)基因家族是指核苷酸序列或編碼產(chǎn)物具有一定程度同源性的一組基因.（來源同，結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)）基因家族中各個基因之間的關(guān)系:1.家族中各基因的核苷酸序列相同這些基因族也被稱為單純多基因家庭(如rRNA,tRNA家族)和復(fù)合多基因家族(如組蛋白基因家族).2.家族中各基因核苷酸序列高度同源3.家族中各基因編碼的蛋白質(zhì)有高度的同源性，但基因的核苷酸序列可能不同。4.家族各基因編碼的蛋白質(zhì)中具有很小的保守基序（conservedmotif)。5.基因超家族（genesuperfamily）基因超家族是指一組由多基因家族及單基因家族組成的更大的基因家族。它們的結(jié)構(gòu)有程度不等的同源性，因此它們可能起源于相同的祖先基因，但是它們的功能并不一定相同，這一點(diǎn)正是與多基因家族的差別所在。這些基因在進(jìn)化上也有親緣關(guān)系，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，故將其稱為基因超家族。第82頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一基因簇：指基因家族中各成員緊密成簇排列成大段的串聯(lián)重復(fù)單位，定位于染色體的特殊區(qū)域，為同一個祖先的基因擴(kuò)增產(chǎn)物。第83頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一按照基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄方向可以分為簡單的多基因家族、復(fù)雜的多基因家族。第84頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一簡單的多基因家族如rRNA基因家族5SrRNA家族tRNA家族和tRNA基因:人類基因約有1300個tRNA基因，編碼50多種tRNA。每種tRNA可有10-幾百個基因拷貝。同種tRNA往往串聯(lián)在一起形成基因簇，但基因間有非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)分隔，常常比結(jié)構(gòu)基因長近10倍。第85頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一復(fù)雜的的多基因家族由幾個多基因家族組成，如組蛋白基因家族5個成員，受發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜多基因家族：這些基因家族的各個成員在DNA分子上的排列順序按照發(fā)育的不同階段先后次序排列，故也稱“發(fā)育控制復(fù)合多基因家族”。如α-珠蛋白和β-珠蛋白基因家族第86頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一基因超家族（genesuperfamily）基因超家族是指一組由多基因家族及單基因家族組成的更大的基因家族。它們的結(jié)構(gòu)有程度不等的同源性，因此它們可能起源于相同的祖先基因，但是它們的功能并不一定相同，這一點(diǎn)正是與多基因家族的差別所在。這些基因在進(jìn)化上也有親緣關(guān)系，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，故將其稱為基因超家族。如：免疫球蛋白超基因家族表達(dá)產(chǎn)物都有免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。有2個微球蛋白、MHCI類抗原的α鏈,Ⅱ類抗原的α鏈和β鏈,Thy1、CD4、CD8等與免疫有關(guān)的分子。在后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多免疫系統(tǒng)內(nèi)以及與免疫無關(guān)的家族成員。第87頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一假基因（pseudogene)

1.假基因在多基因家族中某些與正常功能基因在核苷酸序列上相似，但不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后生成無功能基因產(chǎn)物的DNA序列，被稱為假基因。DNA序列，被稱為假基因。2.假基因常用符號ψ表示，如ψα1表示與α1相似的假基因.3.假基因與有功能的基因同源,原來也可以是有功能的基因,由于發(fā)生缺失(deletion)、例位(inversion)或點(diǎn)突變（pointmutaion）等，成為無功能的基因，即形成了假基因，哺乳動物基因組中的1/4基因?yàn)榧倩?，可能為進(jìn)化的痕跡。

第88頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.6.3線粒體基因與基因組的結(jié)構(gòu)一個線粒體有多個DNA分子閉合雙鏈環(huán)狀分子大小差異大.動物<植物不與組蛋白結(jié)合,自主復(fù)制轉(zhuǎn)錄,缺乏修復(fù)機(jī)制編碼了呼吸鏈中的蛋白質(zhì)亞基突變率高,與衰老相關(guān),生物密碼的通用性及個例:P111第89頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一4.6.3葉綠體基因與基因組的結(jié)構(gòu)編碼了呼吸鏈中的蛋白質(zhì)亞基類囊體膜蛋白組分以及與氧化還原反應(yīng)相關(guān)的酶類基因組較大,閉合雙鏈環(huán)狀分子不與組蛋白結(jié)合,含有數(shù)萬堿基對的兩個反向重復(fù)序列,大拷貝區(qū),小拷貝區(qū),P112第90頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一人類基因組簡介第91頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一人類基因組的組成（3×109bp）第92頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一一、什么是HGP?

人類基因組計(jì)劃(HumanGenomeProject,HGP)是由美國科學(xué)家于1985年率先提出，由六個國家的科學(xué)家共同參加的旨在闡明人類基因組30億個緘基對的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因，破譯人類全部遺傳信息，使人類在分子水平上真正全面認(rèn)識自我的科學(xué)計(jì)劃。

第93頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一人類基因組計(jì)劃

基因科學(xué)發(fā)展的必然要求是偏重單個基因的研究，還是轉(zhuǎn)到從整體水平上研究基因組？人類認(rèn)識自身的必然要求例如：人類的進(jìn)化？疾病產(chǎn)生的機(jī)制？人的生老病死？第94頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一HGP提出過程中的幾個事件：

1985年，加州大學(xué)校長Sinsheimer首次提出了測定人類基因組全序列的動議

1986年，諾貝爾獎獲得者DulbeccoR在《科學(xué)》雜志上熱情宣傳開展人類基因組計(jì)劃的意義1986年，美國能源部(DOE)，正式提出實(shí)施測定人類基因組全序列的計(jì)劃

第95頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一1986年6月，HGP在美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室召開的分子生物學(xué)會議上引起了激烈辯論1988年2月，國家科學(xué)研究委員會（NRC）的15位專家撰寫完成“人類基因組的作圖與測序（mappingandsequencingthehumangenome）”的報(bào)告美國國會正式批準(zhǔn)美國的“人類基因組計(jì)劃”于1990年10月1日正式啟動

第96頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一2.誰參與了HGP國際人類基因組測序協(xié)作組（公共計(jì)劃組）由6個國家、20個研究中心的2000多位科學(xué)工作者組成。國家承擔(dān)的測序任務(wù)美國54%英國33%日本7%法國2.8%德國2.2%中國1%第97頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一中國參與HGP研究的情況

HGP參加國：美國、英國、德國、日本、法國、中國。中國是唯一的發(fā)展中國家。中國開展基因組研究的情況：

1987年，開展模式生物水稻基因組計(jì)劃研究（“863”項(xiàng)目），2002年4月完成；1993年，中華民族基因中若干位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)研究（國家自然科學(xué)基金委）；1996年，人類重大疾病相關(guān)基因的定位、克隆、結(jié)構(gòu)與功能研究（國家自然科學(xué)基金委）；

第98頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一中國HGP研究機(jī)構(gòu)：以強(qiáng)伯勤為主任的中國人類基因組北方中心（北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)）；以陳竺為主任的中國人類基因組南方中心（上海瑞金醫(yī)院）；1999年7月，以楊煥明為主任的中科院遺傳所人類基因組研究中心（北京）在國際人類基因組組織注冊。承擔(dān)任務(wù)：申請承擔(dān)其中1%的測序任務(wù)，即第3號染色體上的3000萬個堿基對；2000年，成立以楊煥明為主任的杭州華大基因研究中心（杭州）。

第99頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一研究進(jìn)展：2000年3月底，中國科學(xué)家完成了第3號染色體上的3千萬個堿基對的測序和初步安裝工作，并計(jì)劃2003年完成全部組裝及分析工作。第100頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一中國的水稻基因組計(jì)劃：完成時間：2002年4月。堿基數(shù)目：基因組總基因序列達(dá)4.6億bp。基因總數(shù)：46022—55615個之間。完成單位：由來自北京、杭州華大基因研究中心暨中科院基因組信息學(xué)中心、中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等12個單位完成。

第101頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一人類基因組計(jì)劃研究進(jìn)展

2000年6月，人類基因組工作草圖繪制成功。2001年2月，人類基因組精細(xì)圖譜繪制完成，并進(jìn)行了初步解讀。

至2001年，包括小鼠、果蠅、線蟲、擬南芥、酵母、大腸桿菌、枯草桿菌等在內(nèi)的模式生物基因組測序完成，發(fā)現(xiàn)并克隆到許多基因。

第102頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一科學(xué)家公布人類基因組細(xì)節(jié)研究成果

一、基因數(shù)量少得驚人。一些研究人員曾經(jīng)預(yù)測人類約有14萬個基因，但塞萊拉公司將人類基因總數(shù)定在2.6383萬—3.9114萬個之間。最終確定出的基因數(shù)在這個范圍內(nèi)，比如3萬個左右，那么，人類只比果蠅多大約1.3萬個基因。塞萊拉公司的科學(xué)家測出的序列準(zhǔn)確地覆蓋了基因組的95%，并已經(jīng)確定了所有基因的2／3，平均測序精度為99.96%。二、人類基因組中存在“熱點(diǎn)”和大片“荒漠”。人類基因組序列中所謂的“荒漠”就是包含極少或根本不包含基因的部分，基因組上大約1／4的區(qū)域是長長的、沒有基因的片段?；蛎芏仍诘?7、第19和第22號染色體上最高，在X染色體、第4、第18號和Y染色體上相對貧瘠。三、35.3%的基因組包含重復(fù)的序列。這意味著所有這些重復(fù)序列，即原來被認(rèn)為的“垃圾DNA”應(yīng)該被進(jìn)一步研究。事實(shí)上，第19號染色體57%是重復(fù)的。除了重復(fù)片段，科學(xué)家還鑒定了210萬個人與人之間不同的基因序列，這些序列被稱為“單核苷酸多態(tài)性”，它們通常是無害的。四、地球上人與人之間99.99%的基因密碼是相同的。研究發(fā)現(xiàn)，來自不同人種的人比來自同一人種的人在基因上更為相似。在整個基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬分之一。第103頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一研究目標(biāo)從基因組整體水平上解碼生命現(xiàn)象，認(rèn)識生命起源、個體差異的起因、疾病產(chǎn)生的機(jī)制，衰老等的原因。第104頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一人類基因組研究的內(nèi)容1、描繪遺傳圖譜2、制作物理圖譜3、完成序列圖譜

4、基因鑒定5、建立基因信息系統(tǒng)，儲存處理及開發(fā)相應(yīng)軟件第105頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一遺傳圖譜轉(zhuǎn)錄圖譜0.7cM或kb

序列圖譜物理圖譜100kbSTSmap四張圖：物理圖轉(zhuǎn)錄圖遺傳圖序列圖

連鎖作圖序列作圖遺傳標(biāo)記連鎖單位厘摩cM第106頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一遺傳圖遺傳圖又稱連鎖圖，是通過計(jì)算連鎖的遺傳標(biāo)記之間的重組頻率來確定他們之間的相對距離，測定單位用CM表示，這對疾病基因的定位是至關(guān)重要的。在摩爾根研究的交叉互換中，他應(yīng)用果蠅的許多不同性狀通過反復(fù)的雜交，從各性狀的重組率即可確定基因間的距離。遺傳學(xué)距離簡單的說就是在減數(shù)分裂過程中同源染色體間發(fā)生交換的可能，重組率與染色體上兩個座位間距離呈正相關(guān)。但實(shí)際細(xì)胞遺傳學(xué)中的交換與經(jīng)典遺傳學(xué)中的重組是兩個不同的概念。如果父源與母源染色體在某兩座位上的等位基因完全相同，這時就不可能檢出任何重組的遺傳效應(yīng)。因此，只有具有多態(tài)性的座位才有可能檢測到重組的發(fā)生，才有作為遺傳標(biāo)記的價值。因此，人類基因組遺傳圖的建立需要：1、遺傳標(biāo)記多，2、多態(tài)性，3、某座位上等位基因呈共顯性。第107頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一遺傳標(biāo)志最早的遺傳標(biāo)志是經(jīng)典的性狀遺傳標(biāo)記，如ABO血型、性別、HLA標(biāo)志等，但這些蛋白多態(tài)性少、等位基因數(shù)目有限、分布不夠均勻、檢測技術(shù)復(fù)雜第一代遺傳標(biāo)記：RFLP，DNA順序的改變遍于整個基因組（尤其基因組），平均每200bp就有一個，這種改變可通過限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的有無，導(dǎo)致酶切片段長度多態(tài)。1983年，Huntington舞蹈癥定位就是應(yīng)用此技術(shù)。但此法限制酶種類有限、還需同位素標(biāo)記探針，復(fù)雜煩瑣。第二代遺傳標(biāo)記：VNTR或STR，不但具多態(tài)性高頻率，還可PCR擴(kuò)增而自動化第三代遺傳標(biāo)記：SNP，數(shù)量多，覆蓋密度高，還與基因功能密切相關(guān)。第108頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一遺傳圖與基因定位遺傳圖對疾病基因的定位至關(guān)重要：一個基因位點(diǎn)至少有兩個等位基因，一個正常，一個異常，只有通過異常才發(fā)現(xiàn)正常，如紅綠色盲基因的發(fā)現(xiàn)，才定位此基因。如我們想知道某種病的基因定位就可分析此位點(diǎn)與某一遺傳標(biāo)記的交換情況，就可在這遺傳標(biāo)記附近找這基因。進(jìn)一步找基因就需要物理圖了（進(jìn)一步找遺傳標(biāo)記旁的物理標(biāo)記，再沿著找相鄰片段群）

第109頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一17cM11cMXg（血型基因）ich（普通魚鱗病）OA(眼白化癥)遺傳圖譜舉例：重組頻率用于X染色體上基因的連鎖和定位第110頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一物理圖物理圖用于確定各遺傳標(biāo)記之間的物理距離，用kb或Mb表示。1CM相當(dāng)1Mb物理圖有兩種1、以一段已知核苷酸序列的DNA片段即序列標(biāo)記部位STS（sequencetaggedsite）為路標(biāo)，以Mb或kb做圖距的基因組圖。STS的要求：在基因組有明確的位置，且是一段已知的序列因此，可用一段已知的DNA序列做探針，就可找到某一位置的路標(biāo)。至1996年10月已建立22000個STS，分辨率達(dá)199kb2、建立以DNA克隆片段相互重疊的鄰接克隆群（contig），即由225個YAC連續(xù)克隆重疊群組成的覆蓋人類基因組75%的物理圖。如將含有一個STS路標(biāo)的DNA片段一個個接起來稱為相鄰片段群，或相鄰克隆群。（相鄰克隆群的建立為大片段測序創(chuàng)造了條件）第111頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)錄圖轉(zhuǎn)錄圖又稱表達(dá)圖。它是以部分5端或3端cDNA序列即EST為路標(biāo)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄順序的位置和距離所繪制的圖。人體每一特定組織，只有10%的基因是表達(dá)的，只要分離某一發(fā)育階段、某一組織的mRNA，進(jìn)而合成相應(yīng)的cDNA，然后克隆、測序，這些cDNA序列標(biāo)記即表達(dá)的標(biāo)簽序列EST。轉(zhuǎn)錄圖有特定的意義：①首先由于DNA轉(zhuǎn)錄是有組織和時間特異的，它來源于已知的某一生育階段的某一組織，它可使我們了解某一基因在不同時間、不同組織、不同水平的表達(dá)，也可以了解某一特定時間不同組織、不同基因的表達(dá)②為HGP提供表達(dá)序列③為基因功能研究提供信息④為基因鑒定提供侯選基因⑤編碼序列具潛在商業(yè)價值第112頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一序列圖序列圖即分子水平的物理圖，測定長度約1米的31億個核苷酸的順序。策略：從上而下：①建立人基因組DNA的酵母人工染色體（YAC）重疊群②利用DNA標(biāo)志或DNA指紋圖譜建立有序排列的連續(xù)克隆系，常用的標(biāo)志有STS和EST③將這些克隆系列分別定位于染色體的不同區(qū)域，構(gòu)成全基因組物理圖譜④再對這些克隆進(jìn)行亞克隆，作為測序模板⑤再進(jìn)行序列分析，尋找開放閱讀框全基因組鳥槍法：不需構(gòu)建YAC的重疊群，而是直接對人類基因組的大小不同的隨機(jī)克隆進(jìn)行直接測序，然后運(yùn)用計(jì)算機(jī)分析，將各測序片段進(jìn)行排列。

第113頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一遺傳標(biāo)記的種類路標(biāo)？已知的基因，多態(tài)性標(biāo)記（限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，RFLP，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（VNTR）SIR，，STR，SNP，STS虛列標(biāo)簽位點(diǎn)第114頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一人工染色體：YAC人工染色體載體是利用釀酒酵母Saccharomycescerevisiae）的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。釀酒酵母的形態(tài)為扁圓形和卵形，生長的代時為90分鐘；含16條染色體，其大小為225-1900kb，總計(jì)有14×106bp；具真核mRNA的加工活性。

第115頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一YAC載體的復(fù)制元件是其核心組成成分，其在酵母中復(fù)制的必需元件包括復(fù)制起點(diǎn)序列即自主復(fù)制序列autonomouslyreplicatingsequence，ARS）、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（centromere,CEN）和兩個端粒（TEL）。

YAC載體為能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細(xì)胞間的分離及保持染色體穩(wěn)定的需要，必須含有以下元件：

·端粒重復(fù)序列（telomericrepeat，TEL）：定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

·著絲粒（centromere，CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個細(xì)胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。如pYAC4使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。

·自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicationsequences，ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號。

第116頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一YAC載體的選擇標(biāo)記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突變抑制基因sup4。第117頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一“逐個克隆法”：對連續(xù)克隆系中排定的BAC克隆逐個進(jìn)行亞克隆測序并進(jìn)行組裝(公共領(lǐng)域測序計(jì)劃)人類基因組計(jì)劃：大規(guī)模測序基本策略“全基因組鳥槍法”：在一定作圖信息基礎(chǔ)上，繞過大片段連續(xù)克隆系的構(gòu)建而直接將基因組分解成小片段隨機(jī)測序，利用超級計(jì)算機(jī)進(jìn)行組裝(美國Celera公司）第118頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一1、逐個克隆法（clonybyclony）：將YAC、BAC克隆逐一序列分析，然后排列組裝。2、鳥槍法（shotgunapproach）：隨機(jī)挑取克隆測序，然后通過計(jì)算機(jī)排序并連接，Celera公司首創(chuàng)。大規(guī)模測序的基本策略第119頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一二、基本策略1、對基因組進(jìn)行標(biāo)記和劃界將每條染色體劃分為長臂、短臂、帶、亞帶和亞亞帶，這為定位基因和特定序列提供了染色體標(biāo)志。一般以500kb標(biāo)以一個特異的DNA標(biāo)記，作為特定基因或序列的界標(biāo)。2、切割和排序標(biāo)記好后，再對基因組DNA用一定內(nèi)切酶切割成片段并進(jìn)行克隆，并用已知的標(biāo)記將這些克隆有序排列。3、建立遺傳圖譜、物理圖譜和基因圖譜（轉(zhuǎn)錄圖譜）4、進(jìn)行全序列測定5、確定每一個基因結(jié)構(gòu)、特性和功能第120頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一基因是否應(yīng)該被申請專利？人類基因現(xiàn)在也被授予了專利。如肥胖基因，該基因的克隆曾被一家生物制藥公司以3000萬美元收購；但該公司并未自己生產(chǎn)減肥藥物，而是在第二年以7000萬美元的高價轉(zhuǎn)手獲利，年利率高達(dá)250％。可見，與基因有關(guān)的買賣將會在今后大量涌現(xiàn)。第121頁，共159頁，2023年，2月20日，星期一1997年11月11