血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳1

血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳1第1頁/共18頁【實(shí)驗(yàn)原理】盤狀電泳是在垂直的玻璃管內(nèi)，利用不連續(xù)的凝膠孔徑、緩沖液的組成和pH系統(tǒng)進(jìn)行的電泳。被分離的樣品區(qū)呈圓盤狀。不連續(xù)盤狀電泳應(yīng)用了三個(gè)物理效應(yīng)：樣品濃縮效應(yīng)、凝膠的分子篩效應(yīng)和一般電泳分離的電荷效應(yīng)。具體原理見本章理論部分。采用該技術(shù)可分離得到血清蛋白質(zhì)的12~30個(gè)部分。第2頁/共17頁第2頁/共18頁圓盤電泳

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成，具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物在垂直的玻璃管中進(jìn)行電泳，電泳分離的區(qū)帶類似圓盤狀故命名為圓盤電泳。第3頁/共17頁第3頁/共18頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果第4頁/共17頁第4頁/共18頁

聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳兩類

連續(xù)電泳指整個(gè)電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔的孔徑都是相同的。不連續(xù)電泳是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液，pH值和孔徑。不連續(xù)圓盤電泳的凝膠管中置有兩種不同的凝膠層：濃縮膠、分離膠。能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。第5頁/共17頁第5頁/共18頁

由于凝膠層的不連續(xù)性，蛋白質(zhì)分子在大孔與小孔凝膠中受到的阻力不同，移動(dòng)速度由快變慢，在界面處就會(huì)使樣品濃縮，區(qū)帶變窄。濃縮膠

為大孔膠，凝膠濃度2.5%，用光聚合法制備，有防對(duì)流作用。樣品在其中濃縮。分離膠為小孔膠，凝膠濃度7%，一般采用化學(xué)聚合法制備。樣品在其中進(jìn)行電泳和分子篩分離。也有防對(duì)流作用。第6頁/共17頁第6頁/共18頁【器材和試劑】器材：電泳儀、圓盤電泳槽、微量加樣器、注射器、50ml小燒杯試劑：分離膠緩沖液（pH8.9）：取三羥甲基氨基甲烷（Tris）18.2g，加入1mol/LHCl24.0ml，再加蒸餾水至100ml，4℃保存。30%單體交聯(lián)劑：稱取丙烯酰胺30.0g與甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加蒸餾水至100ml。催化劑：10％過硫酸銨（AP），臨用前現(xiàn)配。加速劑：取四甲基乙二胺(TEMED）1ml加蒸餾水稀釋到10ml。濃縮膠緩沖液（pH6.7）：取5.98gTris，用1mol/LHCl48.0ml，再加蒸餾水至100l，4℃保存。電機(jī)緩沖液（pH8.3）：取28.8g甘氨酸，6.0gTris，分別溶解后，加蒸餾水到100ml，臨用前10倍稀釋即為電極緩沖液工作液。第7頁/共17頁第7頁/共18頁上樣緩沖液：取溴酚藍(lán)0.05g，加蒸餾水溶解后，家30ml甘油，加濃縮膠緩沖液25ml，再定容至100ml。固定液：取三氯乙酸12.50g，加蒸餾水至100ml?？捡R斯亮藍(lán)R250染色液：城區(qū)1.25g考馬斯亮藍(lán)R250，溶解于227ml甲醇中，加蒸餾水227ml，加冰醋酸46ml。脫色液：甲醇：冰乙酸：水按3：1：6的比例混合。第8頁/共17頁第8頁/共18頁【操作方法】凝膠柱的準(zhǔn)備加樣（血清樣品12μL、上樣緩沖液12μL）電泳（2~3mA/管）剝膠固定、染色及漂洗第9頁/共17頁第9頁/共18頁【思考題】聚丙烯酰胺凝膠不聚合的主要原因是什么？如何克服？1忘記加催化基過硫酸銨，或者過硫酸銨失效，最好現(xiàn)配現(xiàn)用；2忘記加加速劑TEMED；3溶液的pH不對(duì)，偏酸性。4溫度過低過硫酸銨-TEMED（四甲基乙二胺）系統(tǒng)：在Acr和Bis的溶液中放入這個(gè)催化系統(tǒng)后，過硫酸銨[（NH4）2S2O8]產(chǎn)生出游離氧原子使單體成為具有游離基的狀態(tài)，從而發(fā)生聚合作用。聚合的初速度和過硫酸銨濃度的平方根成正比。這種催化系統(tǒng)需要在堿性條件下進(jìn)行。例如，在pH8.8條件下7％的丙烯酰胺溶液30分鐘就能聚合完畢；在pH4.3時(shí)聚合很慢，要90分鐘才能完成。溫度與聚合的快慢成正比。常在室溫下就很快聚合，溫度升高聚合更快。如將混合后的凝膠溶液放在近0℃的地方，就能延緩聚合。一般來講，溫度過低，有氧分子或不純物質(zhì)存在時(shí)都能延緩凝膠的聚合。為了防止溶液中氣泡含有氧分子而妨礙聚合，在合前須將溶液分別抽氣，然后再混合。第10頁/共17頁第10頁/共18頁濃縮膠為何能濃縮樣品？濃縮膠的作用原理不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)之一是可以使用稀樣品。這是因?yàn)樵跇悠愤M(jìn)入分離膠以前，先經(jīng)過大孔徑濃縮膠的遷移作用而被濃縮至一極窄的區(qū)帶。其作用原理是在緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如甘氨酸，在接近其pKa的pH值時(shí)，任何時(shí)候都只有一部分分子帶負(fù)電。如樣品和濃縮膠均用pH6.7的Tris-HCI緩沖液，電極液用Tris-甘氨酸緩沖液。此時(shí)，甘氨酸很少解離，其有效泳動(dòng)率很低，而氯離子卻有很高的泳動(dòng)率，蛋白質(zhì)分子的泳動(dòng)率介于氯離子和甘氨酸之間。一旦加上電壓，作為先導(dǎo)離子的氯離子和作為尾隨離子的甘氨酸離子分離開來，并在其后面留下一個(gè)導(dǎo)電性較低的區(qū)帶。由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便獲得較高的電壓梯度，并加速甘氨酸的泳動(dòng)，使其趕上氯離子,建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動(dòng)率乘積的相等的穩(wěn)定態(tài)，使這些帶電顆粒以相同速度泳動(dòng)，兩種離子之間具有明顯的邊界。當(dāng)甘氨酸、氯離子界面通過樣品進(jìn)入濃縮膠時(shí)，在移動(dòng)界面前有一低電壓梯度，在界面后有一高電壓梯度。第11頁/共17頁第11頁/共18頁由于在移動(dòng)界面前的蛋白質(zhì)泳動(dòng)速度比氯離子低，因此氯離子能迅速越過。移動(dòng)界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中，其泳動(dòng)速度比甘氨酸快。因此，移動(dòng)的界面將蛋白質(zhì)分子堆積到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。蛋白質(zhì)在移動(dòng)界面中的濃縮作用僅取決于樣品和濃縮膠中的Tris-HCI的濃度，而與樣品中蛋白質(zhì)的最初濃度無關(guān)。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對(duì)樣品沒有分子篩作用。移動(dòng)的界面到達(dá)濃縮膠和分離膠的界面時(shí)，凝膠的pH值明顯增加，并導(dǎo)致甘氨酸的大量解離。此時(shí)甘氨酸的有效泳動(dòng)率增加，使它越過蛋白質(zhì)并直接在氯離子后移動(dòng)。同時(shí)由于凝膠孔徑變小，使蛋白質(zhì)分子的遷移率減小。于是蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和pH值中泳動(dòng)，并根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。為什么要在樣品中加少許溴酚藍(lán)和一定濃度的甘油？溴酚藍(lán)呈藍(lán)色，而蛋白質(zhì)是白色，在SDS-凝膠中不明顯，再次，溴酚藍(lán)的相對(duì)分子量比蛋白質(zhì)(絕大部分)小，電泳時(shí)速度比蛋白質(zhì)稍快，因此可用作指示，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)電泳槽底部(可看藍(lán)色調(diào)帶)，則電泳結(jié)束。第12頁/共17頁第12頁/共18頁若無溴酚藍(lán)，不好蛋白質(zhì)電泳到槽底的時(shí)間。如果所有的蛋白質(zhì)都電泳到了底部，就沒有區(qū)別出其移動(dòng)速度(對(duì)應(yīng)于相對(duì)分子質(zhì)量)?！咀⒁馐马?xiàng)】Acr和Bis都是神經(jīng)性毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用、但在形成凝膠后則無毒，操作時(shí)應(yīng)盡量避免接觸皮膚，并注意洗手。蛋白加樣量要合適。加樣量太少，條帶不清晰；加樣量太多則泳道超載，條帶過寬而重疊，甚至覆蓋至相鄰泳道。第13頁/共17頁第13頁/共18頁過硫酸銨的主要作用是提供自由基引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合反應(yīng)，故一定要新鮮，貯存過久的過硫酸銨商品不能使用。此外，10%過硫酸銨必須現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃冰箱貯存不超過48h。灌制凝膠時(shí)，應(yīng)避免產(chǎn)生汽泡，因?yàn)槠輹?huì)影響電泳分離效果。剛灌注分離膠混合溶液后，應(yīng)在分離膠液面上加1～2cm高的水層，以阻隔空氣。膠液面上加水層時(shí)要特別小心，緩緩疊加，以免沖壞凝膠的膠面。第14頁/共17頁第14頁/共18頁電極緩沖液中甘氨酸的作用1.緩沖液會(huì)與所分離的樣品接觸，加入甘氨酸為細(xì)胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。

2.電解時(shí)緩沖液溫度較高，而Tris受溫度影響pH變化較大，甘氨酸可以起到緩沖作用。

3.甘氨酸與樣品的濃縮效應(yīng)有關(guān)，它參與形成緩沖體系離子成分與PH值的不連續(xù)性。在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有電極緩沖液（Tris-HCl,PH8.3）、濃縮膠緩沖液（Tris-HCl,PH6.8）、分離膠緩沖液（Tris-HCl,PH8.8）；兩種凝膠的孔徑也各不相同。在濃縮膠中，緩沖液中的HCl幾乎全解離為Cl-,電極中的甘氨酸（PI=6.0,PKa=9.7）只有很少解離，酸性蛋白質(zhì)也可解離出質(zhì)子。這些離子電泳時(shí)都向正極移動(dòng)：Cl-速度最快（快離子），蛋白質(zhì)次之，甘氨酸負(fù)離子最慢（慢離子）。由于Cl-很快超過蛋白質(zhì)離子，因此在其后形成一個(gè)電導(dǎo)較低，電位梯度較陡的區(qū)域，該區(qū)電位梯度最高，是在電泳過程中形成的電位梯度的不連續(xù)性導(dǎo)致蛋白質(zhì)和甘氨酸離子加快移動(dòng)，結(jié)果使蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠前被濃縮成極窄的區(qū)帶，有利于提高電泳的分辨率。當(dāng)進(jìn)入PH=8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增大，速度超過蛋白質(zhì)，所以，Cl-與甘氨酸負(fù)離子繼續(xù)前進(jìn)，蛋白質(zhì)大分子留在后面，從而分成多個(gè)區(qū)帶。第15頁/共17頁第15頁/共18頁凝膠中的蛋白區(qū)帶比較少且不清晰可能的原因最可能的是樣品中蛋白含量少濃度低，染色脫色的配方效果不好，比