單核增生李斯特氏菌檢測概述

單核增生李斯特氏菌檢測概述單核增生李斯特氏菌檢測概述第1頁內容介紹李斯特氏菌屬單核增生李斯特氏菌生物學特征流行病學致病性試驗室危害及其預防檢測程序快速檢測方法單核增生李斯特氏菌檢測概述第2頁李斯特氏菌屬

李斯特氏菌屬（Listeria

）普遍存在于環(huán)境中，最新分類學研究表明，其分為六個種：單核增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeriaivanovii）無害李斯特氏菌（Listeriainnocua）斯氏李斯特氏菌（Listeriaseeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeriawelshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeriagrayi）

在李斯特氏菌屬六個種中，只有兩種致病菌：單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌能夠引發(fā)老鼠和其它動物發(fā)病。不過，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類李斯特氏菌癥（listeriosis）相關。所以，李斯特氏菌中最有檢測意義是單核增生李斯特氏菌。單核增生李斯特氏菌檢測概述第3頁生物學特征

---菌體形態(tài)及染色特征革蘭氏陽性；小、類似球形桿菌，0.4~0.5×0.5~2μm，在有些培養(yǎng)基中稍彎，兩端鈍圓，單個、成短鏈、細胞彼此連成V形，或成群細胞沿長軸方向平行排列，在較老或生長不良培養(yǎng)物中，可能形成絲狀；20-25℃以4根周生鞭毛運動，在37℃只有較少鞭毛或1根鞭毛；無芽孢、無莢膜。單核增生李斯特氏菌檢測概述第4頁單核增生李斯特氏菌檢測概述第5頁生物學特征

---培養(yǎng)特征兼性厭氧；在20--25℃培養(yǎng)有動力，穿刺培養(yǎng)2-5天可見倒立傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運動。生長溫度范圍為2-42℃（也有報道在0℃能遲緩生長），最適培養(yǎng)溫度為35--37℃。pH范圍pH4.4-pH9.6。單核增生李斯特氏菌檢測概述第6頁生物學特征

---培養(yǎng)特征在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但伴隨菌落增大，變得不透明。在5-7%血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產生窄小β-溶血環(huán)。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)瓊脂上，用45°角入射光照射菌落，經過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。單核增生李斯特氏菌檢測概述第7頁生物學特征

---生化反應觸酶陽性，氧化酶陰性。能發(fā)酵各種糖類，產酸不產氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性。單核增生李斯特氏菌檢測概述第8頁生物學特征

---血清型依據(jù)菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”。致病菌株血清型普通為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后兩型尤多。單核增生李斯特氏菌檢測概述第9頁生物學特征

---抵抗力該菌對理化原因抵抗力較強，在土壤、糞便、青儲飼料和食品中能長久存活；對堿和鹽抵抗力強，60-70℃經5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min可殺死此菌；濕熱滅菌（121℃，最少15min）和干熱滅菌（160-170℃，最少1hr）可殺滅該菌，對紫外線和γ射線敏感；該菌對青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素（已產生抗性）、氨基糖苷類、氯霉素均敏感。單核增生李斯特氏菌檢測概述第10頁流行病學

分布：廣泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、廢水、青儲飼料、動植物及其食品中都有該菌存在，所以動物很輕易食入該菌，并經過口腔-糞便路徑進行傳輸寄主范圍：哺乳動物、鳥類、魚類、甲殼類和昆蟲單核增生李斯特氏菌檢測概述第11頁流行病學

據(jù)報道，有1-10%人類腸道中存在單核增生李斯特氏菌，4-8%水產品、5-10%奶及其產品、30%以上肉制品及15%以上家禽均被該菌污染。相關食品：鮮奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是軟奶酪）、冰激凌、生蔬菜、發(fā)酵過生肉制作香腸、生和加工過禽肉、各種生肉類、生和煙熏魚肉。約有85-90%病例是由被污染食品引發(fā)。單核增生李斯特氏菌檢測概述第12頁1996年至1999年，因單核增生李斯特氏菌回收食品種類（起源：USDA及FDA匯報）單核增生李斯特氏菌檢測概述第13頁致病性及其治療該病臨床表現(xiàn)，健康成人個體出現(xiàn)輕微類似流感癥狀，新生兒、孕婦、免疫缺點患者表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結膜炎、發(fā)燒、抽搐、昏迷、自然流產或死嬰、腦膜炎、敗血癥直至死亡。由該菌造成腦膜炎致死率可高達70%，敗血癥死亡率達50%，圍產期或新生兒感染死亡率超出80%，懷孕期婦女感染，母親通常能存活下來。抗生素治療，用青霉素或氨芐青霉素注射給藥，或與氨基糖苷類抗生素一起用藥。單核增生李斯特氏菌檢測概述第14頁感染人群感染劑量未知，但與該菌毒力和易感人群年紀、免疫狀態(tài)相關。易感者：孕婦/胎兒—圍產期和新生兒感染；接收皮質激素、抗癌劑治療、器官移植治療、艾滋病患者等免疫缺損者；癌癥病人—尤其是白血病患者；不太常見報道—糖尿病、肝硬化、哮喘和潰瘍性結腸炎患者；年紀較大人；沒有免疫缺點健康人，食用污染該菌尤其是大量污染該菌食品后，也有患病危險。單核增生李斯特氏菌檢測概述第15頁致病機理單增李氏菌抗原結構與毒力無關，它致病性與毒力機理以下：

1、寄生物介導細胞內增生，使它附著及進入腸細胞與巨噬細胞；

2、抗活化巨噬細胞，單增李氏菌有細菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細胞內過氧物（為殺菌毒性游離基團）分解；

3、溶血素，即李氏桿菌素O，能夠從培養(yǎng)物上清液中取得，有α和β兩種，為毒力因子。單核增生李斯特氏菌檢測概述第16頁試驗室危害不是一個普遍與試驗室相關傳染病，當前只有少數(shù)有報道案例發(fā)生；直接攝取是最普遍一個感染方式，除此之外，暴露在該菌高濃度氣溶膠中，也可經過眼睛和破損皮膚、粘膜進入體內造成感染。單核增生李斯特氏菌檢測概述第17頁注意事項生物安全2級，操作時應有對應防污染設施，在進行可能產生氣溶膠操作時，應在生物安全柜內完成；在直接接觸有感染性材料時，必須穿著試驗服，戴手套和護目鏡；懷孕婦女應防止接觸傳染物。單核增生李斯特氏菌檢測概述第18頁操作要求濺灑：使氣溶膠沉降，穿著防護服裝，用紙巾輕輕覆蓋濺灑處，加入1%次氯酸鈉溶液，由周圍向中心加，在清理之前要留充分接觸時間（30min）；廢棄：在廢棄前應先采取凈化辦法，高壓蒸汽滅菌、化學消毒、焚燒等；儲存：在有適當標識密封容器內儲存。單核增生李斯特氏菌檢測概述第19頁檢測程序

---增菌

當前常見單核增生李斯特氏菌檢測增菌肉湯主要有半量Fraser肉湯、Fraser肉湯（FB）、UVM（ModifiedUniversityofVermontbroth，也叫UVM1）、LEB（Listeriaenrichmentbroth）和BLEB（bufferedListeriaenrichmentbroth）單核增生李斯特氏菌檢測概述第20頁半量Fraser肉湯和Fraser肉湯含有選擇性和區(qū)分性。加入檸檬酸鐵銨和七葉靈，起到區(qū)分作用。李斯特氏菌能夠水解七葉靈，與培養(yǎng)基中鐵離子反應，使培養(yǎng)基變黑，可直觀從培養(yǎng)液顏色就能夠判斷是否有單核李斯特氏菌生長。氯化鋰、吖啶黃和萘啶酮酸作為選擇性因子。半量Fraser肉湯與Fraser肉湯所用添加劑一樣半量Fraser肉湯：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黃12.5mg/LFraser肉湯：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黃25mg/L單核增生李斯特氏菌檢測概述第21頁UVMUVM只有選擇性沒有區(qū)分性加入萘啶酮酸和鹽酸吖啶黃，作為選擇性因子。即使其中含有七葉靈，不過沒有添加檸檬酸鐵銨，不能發(fā)生黑色顏色反應。單核增生李斯特氏菌檢測概述第22頁LEB和BLEB只有選擇性沒有區(qū)分性LEB是在TSB-YE基礎上加入鹽酸吖啶黃、萘啶酮酸和放線菌酮等選擇性因子；加入丙酮酸鈉，有利于受損細胞恢復；不含七葉靈和檸檬酸鐵銨，無顏色反應BLEB是在LEB基礎上加入緩沖體系：磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉單核增生李斯特氏菌檢測概述第23頁檢測程序

---分離分離培養(yǎng)基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，但首選依然是OXA。分離原理主要是基于李斯特氏菌含有β－D－葡萄糖苷酶活性，能水解培養(yǎng)基中七葉靈，產生七葉苷，與鐵離子產生顏色反應而，使菌落為棕褐色，并帶有褐色暈圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能發(fā)生這種反應還有一些選擇性顯色培養(yǎng)基，如BCM、ALOA、CHROMagarlisteria、Rapid’L.mono等，其原理主要是檢測由毒力基因編碼溶血素，而此種溶血素只存在于單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而能夠很好將此兩種菌同李斯特屬其它種分開。單核增生李斯特氏菌檢測概述第24頁OXA平板單核增生李斯特氏菌ATCC1911748h，35℃培養(yǎng)單核增生李斯特氏菌檢測概述第25頁OXA平板無害李斯特氏菌ATCC3309048h，35℃培養(yǎng)單核增生李斯特氏菌檢測概述第26頁檢測程序

---判定藍色菌落檢驗（Henryillumination）經典運動：相差顯微鏡，輕微旋轉或翻跟頭動力試驗：7天，傘形生長過氧化氫酶試驗：陽性革蘭氏染色：陽性短桿菌溶血試驗：穿刺接種血平板硝酸鹽還原試驗：5天，陰性糖發(fā)酵試驗：葡萄糖、麥芽糖和七葉靈，李斯特菌屬反應均為陽性，除格氏李斯特甘露醇陰性，李斯特其它種甘露醇陰性，木糖和鼠李糖最有檢測意義單核增生李斯特氏菌檢測概述第27頁動力試驗單核增生李斯特氏菌檢測概述第28頁

血平板單核增生李斯特氏菌ATCC1911736h，35℃培養(yǎng)單核增生李斯特氏菌檢測概述第29頁

血平板無害李斯特氏菌ATCC3309036h，35℃培養(yǎng)單核增生李斯特氏菌檢測概述第30頁

血平板伊氏李斯特氏菌ATCC1911924h，35℃培養(yǎng)單核增生李斯特氏菌檢測概述第31頁單核增生李斯特氏菌檢測流程25g樣品+225mlBLEB基礎（加入丙酮酸鈉）

加入萘啶酮酸、鹽酸吖錠黃、放線菌酮30℃4hr劃線接種OXA平板30℃

24hr和48hr

科瑪嘉李氏菌顯色培養(yǎng)基TSA-YE分純35℃

24hr-48hr

35℃

24hr過氧化氫酶試驗、革蘭氏染色、溶血試驗、糖發(fā)酵試驗（木糖、鼠李糖）APIListeria35℃

24-48hr匯報結果35℃18-24hr單核增生李斯特氏菌檢測概述第32頁方法名稱一次增菌二次增菌分離判定快速方法SN0184-1993加工MBP30℃，18-24hEB30℃，24/48hMMA/OXA（35℃，24-48h）藍色菌落；經典運動；過氧化氫酶；革蘭氏染色；溶血試驗；尿素酶試驗；硝酸鹽還原；MR-VP；三糖鐵；糖發(fā)酵；動力試驗；協(xié)同溶血*；血清學檢驗*；小鼠毒力試驗*無未加工EB（30℃，24/48h）GB/T4789.30-EB（30±1℃，48h）MMA（30±1℃，24-48h）藍色菌落；三糖鐵；動力試驗；染色鏡檢（革蘭氏染色、經典運動）；生化特征（溶血反應、硝酸鹽還原、尿素酶、MR-VP、糖發(fā)酵）；小鼠毒力試驗；協(xié)同溶血無LB1（30±1℃，24h）LB2（30±1℃，24h）FDABLEB+Phy（30℃，4h）BLEB+Phy+三種抑菌劑（30℃，20/44h）OXA/PALOM/MOX/LPM+七葉靈+Fe3+推薦BCM/ALOA/RapidL'mono/CHROMagarListeria藍色菌落*；經典運動或動力試驗；過氧化氫酶；革蘭氏染色；溶血試驗；硝酸鹽還原*；糖發(fā)酵；協(xié)同溶血；血清學檢驗；小鼠毒力試驗*篩選、判定都能夠使用快速方法USDAUVM（30±2℃，22±2h）FB（35±2℃，26-48±2h）MOX（35±2℃，26-48±2h）初步判定：純菌菌落形態(tài)；經典運動；生化判定：MICRO-ID?Listeria或Api?Listeria或BAM等方法中傳統(tǒng)生化反應；協(xié)同溶血遺傳判定：核糖體RNA檢測；PFGE*篩選取快速方法必須經過確認后才可使用判定中用到MICRO-ID?、Api?、GenProbeAccuProbe?、GENE-TRAK?各官方方法比較單核增生李斯特氏菌檢測概述第33頁各官方方法比較方法名稱一次增菌二次增菌分離判定快速方法CFIAMFHPB-30LEB（UVM）（30℃，24/48h）MFB（35℃，24-48h）OXA+LPM或MOX或PALCOM經典運動或動力試驗；溶血試驗；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速判定試劑盒*；過氧化氫酶*；革蘭氏染色*；協(xié)同溶血*；血清學試驗*作為判定可選步驟，允許使用快速方法，如Vitek或API、MicroIDListeria、ListeraAccuprobe?ISO11290-1:1996（E）半量Fraser肉湯（30℃，24±2h）Fraser肉湯（35或37℃，48±2h）OXA和PALCOM（30、35或37℃，24-48h，）PALCOM平板微需氧或好氧條件培養(yǎng)藍色菌落*；過氧化氫酶；革蘭氏染色；動力試驗或經典運動*；溶血試驗；糖發(fā)酵試驗；協(xié)同溶血；送參考試驗室（血清或噬菌體分型）無NMKLNo.1362nd1999LBⅠ（30.0±1.0℃，24±3h）LBⅡ（30.0±1.0℃，24±3h）或Fraser肉湯（37.0±1.0℃，48±4h）OXA和PALCOM（37.0±1.0℃，24±3/48±4h，好氧或微需氧）溶血試驗；過氧化氫酶；革蘭氏染色；經典運動動力試驗；糖發(fā)酵試驗；送參考試驗室（血清、噬菌體、DNA或酶分型）允許使用經過確認商業(yè)化生產單核增生李斯特氏菌菌株判定試驗，但沒列明詳細試劑盒名稱單核增生李斯特氏菌檢測概述第34頁紅肉、禽、蛋和環(huán)境樣品中分離和判定單核增生李斯特氏菌方法單核增生李斯特氏菌檢測概述第35頁紅肉、禽、蛋和環(huán)境樣品中分離和判定單核增生李斯特氏菌方法單核增生李斯特氏菌檢測概述第36頁FDA：李斯特氏菌屬快速篩選試劑盒Table2.

ListeriaGenusDetectionTestKitsPrescribedforRegulatoryScreeningAOACOfficialMethod993.09..Listeriaindairyproducts,seafoods,andmeats.Colorimetricdeoxyribonucleicacidhybridizationmethod(GENE-TRAKListeriaAssay).(3,14)AOACOfficialMethod994.03..Listeriamonocytogenesindairyproducts,seafoods,andmeats.Colorimetricmonoclonalenzyme-linkedimmunosorbentassaymethod(ListeriaTek).(5,15,32)AOACOfficialMethod995.22..Listeriainfoods.Colorimetricpolyclonalenzymeimmunoassayscreeningmethod(TECRAListeriaVisualImmunoassay[TLVIA]).(6,30)AOACOfficialMethod996.14..Assurance(PolyclonalEnzymeImmunoassayMethod).(7,21)AOACOfficialMethod997.03..VisualImmunoprecipitateAssay(VIP).(8,22)AOACOfficialMethod999.06..EnzymeLinkedImmunofluorescentAssay(ELFA)VIDASLISAssayScreeningMethod.(9,23)單核增生李斯特氏菌檢測概述第37頁FDA：生化判定替換方法VitekAutomicrobicGramPositiveandGramNegativeIdentificationcards(bioMerieux,Hazelwood,MO)APIListeria(bioMerieux,Marcy-l'Etoile,France)whichdoesnotrequireanadditionalCAMPtestTheMICRO-IDTMkit(bioMerieux,Hazelwood,MO;1,24)permitsspeciationofListeriaisolatesiftheirCAMPreactionsareknownThePhenotypeMicroArrayforListeria(BiOLOG,Hayward,CA)isanotherrecentlyintroduc