魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座

試驗(yàn)四動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基配置和原代培養(yǎng)魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第1頁一試驗(yàn)項(xiàng)目介紹1、試驗(yàn)課時(shí)6課時(shí)2試驗(yàn)過程：A動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液配置B采取組織培養(yǎng)法培養(yǎng)魚類細(xì)胞魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第2頁二、試驗(yàn)原理原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動(dòng)物體內(nèi)獲取細(xì)胞、組織或器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作方法，從動(dòng)物體內(nèi)取出所需組織(或器官)，經(jīng)消化，分散為單個(gè)游離細(xì)胞，在人工培養(yǎng)下，使其不停地生長及繁殖。細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)試驗(yàn)技術(shù)。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第3頁魚類細(xì)胞組培一些方法：

（1）組織塊固定法當(dāng)組織量較少時(shí)可采取此法。它是將組織剪成約一立方毫米小塊,按一定百分比將組織塊貼在瓶壁上,最少三十分鐘以上,然后輕輕加人營養(yǎng)液置溫箱培養(yǎng)。（2）機(jī)械分散法此法適合用于細(xì)胞間連接較渙散組織,如胚胎組織及幼魚全魚。將組織剪成約一立方毫米耐小塊,放入底部有一銅網(wǎng)注射器內(nèi),用手壓力將組織擠出網(wǎng)孔,最終將分散組織吹打后加人營養(yǎng)液分裝培養(yǎng)。（3）絡(luò)合劑分散法當(dāng)前使用絡(luò)合劑主要是乙二胺四乙酸,它能與細(xì)胞間鈣離子、鎂離子結(jié)合而使細(xì)胞連接渙散,經(jīng)吹打即可分散。該法當(dāng)前主要用于囊胚細(xì)胞培養(yǎng)及上皮型細(xì)胞系傳代。（4）酶消化法該法是當(dāng)前采取極為廣泛方法,適合用于絕大多數(shù)組織器官。所用酶主要是胰酶,慣用濃度是0.25%。依據(jù)酶消化時(shí)溫度不一樣,又可深入分為冷消化法及熱消化法。（5）冷消化法此法是將組織剪成約刀小塊,然后置一倍體積胰酶中,四攝氏度培養(yǎng)。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第4頁三、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)1、掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)緩沖液、消化液配置。2掌握動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)基本過程。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第5頁四、試驗(yàn)試劑DMEM培養(yǎng)基胰蛋白酶Hanks緩沖液抗生素溶液牛血清70%乙醇去離子水魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第6頁五、試驗(yàn)用具器材：解剖剪、解剖鑷、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第7頁六、試驗(yàn)步驟培養(yǎng)液配置1、DMEM培養(yǎng)液配置：將1袋袋裝干粉溶解于1L去離子水中，加3.7gNaHCO3,溶解，調(diào)整PH7.2,過濾除菌，4℃保留。2、雙抗溶液配置：將青霉素、鏈霉素溶解于生理鹽水中，至青霉素最終濃度為100U/mL。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第8頁六、試驗(yàn)步驟3、D-Hanks緩沖溶液：稱取8gNaCl，0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4,0.35gNaHCO3溶解于1000mL去離子水中，高壓滅菌，4℃保留。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第9頁六、試驗(yàn)步驟魚類細(xì)胞組織培養(yǎng)法1．取材：快速處死動(dòng)物，無菌分離肝臟,置D-Hanks液中,沖洗肝臟至灰白色。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第10頁六、試驗(yàn)步驟2.接種、培養(yǎng)：將肝臟剪成1mm×1mm×1mm組織塊,用D-Hanks液洗3次,去掉血細(xì)胞,37℃下用0.25%胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用D-Hanks液洗2次,培養(yǎng)液洗2次,將肝組織塊貼壁于組織培養(yǎng)瓶中,每個(gè)培養(yǎng)瓶放組織塊20～25塊。加少許培養(yǎng)液,將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)置于培養(yǎng)箱中,在37℃條件下培養(yǎng),2h后補(bǔ)充培養(yǎng)液,并翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第11頁六、試驗(yàn)步驟3．觀察置于37℃培養(yǎng)細(xì)胞．需逐日進(jìn)行觀察．主要觀察：(1)培養(yǎng)物是否被污染，如培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且混濁，表示該瓶被污染。(2)細(xì)胞生長情況與培養(yǎng)液顏色改變，如培養(yǎng)液變?yōu)樽霞t色，普通細(xì)胞生長不好?？赡苁瞧咳瓷w緊或營養(yǎng)液pH過高。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第12頁六、試驗(yàn)步驟待細(xì)胞已基本長成致密單層時(shí)，此時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)了。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第13頁七、注意事項(xiàng)

細(xì)胞培養(yǎng)要求無菌操作。無菌是細(xì)胞培養(yǎng)成功首要條件。重視進(jìn)人無菌室操作前必須將培養(yǎng)瓶外表消毒提防試劑瓶中液體浸濕瓶蓋,這往往是試驗(yàn)污染主要原因之一。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第14頁八魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)意義魚類培養(yǎng)細(xì)胞作試驗(yàn)驗(yàn)對(duì)象，有著活體魚無法比擬優(yōu)點(diǎn)：(I)成本低，細(xì)胞系維護(hù)不需要大型養(yǎng)殖設(shè)備和大量換水與換氣。(2)重復(fù)性好，試驗(yàn)條件能夠準(zhǔn)確控制。所以，對(duì)魚類細(xì)胞系進(jìn)行深入研究，不論在理論研究方面，還是在實(shí)際應(yīng)用方面，都含有深遠(yuǎn)意義。魚類細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)專家講座第15頁八魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)意義在對(duì)細(xì)胞營養(yǎng)需求有比較深人認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上,化學(xué)成份明確無蛋白培養(yǎng)基已被用于中國倉鼠卵巢細(xì)胞匯和