遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座

第八章遺傳重組遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第1頁(yè)概述第一節(jié)同源重組第二節(jié)位點(diǎn)專(zhuān)一性重組第三節(jié)細(xì)菌中轉(zhuǎn)座成份第四節(jié)真核生物中轉(zhuǎn)座成份遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第2頁(yè)概述：?

只要有DNA，就會(huì)發(fā)生重組減數(shù)分裂高等生物體細(xì)胞核基因、葉綠體和線粒體噬菌體轉(zhuǎn)座?生存→變異→突變，重組損傷修復(fù)、適應(yīng)環(huán)境、加速進(jìn)化遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第3頁(yè)?

重組可分為四類(lèi)（DNA序列、蛋白質(zhì)因子）?狹義遺傳重組：包括到DNA分子內(nèi)斷裂-復(fù)合基因交流?遺傳重組與重組DNA技術(shù)異常?廣義遺傳重組：任何造成基因型改變基因交流過(guò)程遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第4頁(yè)第一節(jié)同源重組遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第5頁(yè)1、

同源重組（homologousrecombination）:發(fā)生在同源DNA序列之間。一、特征2、

特征：?包括同源序列間聯(lián)會(huì)配對(duì)，且交換片段較大?包括DNA分子在特定交換位點(diǎn)發(fā)生斷裂和錯(cuò)接生化過(guò)程?需要重組酶?單鏈DNA分子或單鏈DNA末端是交換發(fā)生主要信號(hào)遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第6頁(yè)雙倍體染色體交換遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第7頁(yè)二、同源重組機(jī)制1、

斷裂復(fù)合及Holliday中間體形成?

Holliday結(jié)構(gòu)同源重組中有4股DNA鏈，在連接處為了轉(zhuǎn)換配對(duì)，形成連接鏈交叉。?Holliday結(jié)構(gòu)形成分子機(jī)制（斷裂復(fù)合起始機(jī)制）雙鏈侵入模型、單鏈侵入模型、雙鏈斷裂修復(fù)模型?同源重組都包括到DNA分子內(nèi)－－斷裂—復(fù)合遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第8頁(yè)3‘5‘5‘3‘Meselson-Radding模型單鏈入侵模型置換侵入Loop切除同化異構(gòu)化分支遷移5’切割遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第9頁(yè)5‘5‘（1）（2）其中－－全部模型和假說(shuō)都包含切斷、鏈置換、連接等過(guò)程雙鏈侵入模型

遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第10頁(yè)雙鏈斷裂修復(fù)模型遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第11頁(yè)2、分枝遷移和Holliday結(jié)構(gòu)拆分?分枝遷移（branchmigaration）－－雙螺旋形成交叉連接以拉鏈?zhǔn)叫?yīng)擴(kuò)散遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第12頁(yè)Holliday異構(gòu)化產(chǎn)生重組體拆分Holliday結(jié)構(gòu)一經(jīng)生成即可不停地處于異構(gòu)化－－異源雙鏈heteroduplexDNA重組結(jié)果取決于拆分時(shí)配對(duì)鏈上切口位置遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第13頁(yè)（1）（2）（1）（2）?Holliday結(jié)構(gòu)拆分產(chǎn)生含異源雙鏈親本DNA分子產(chǎn)生重組體遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第14頁(yè)三、原核同源重組（E.coli）?發(fā)生在雙方DNA同源區(qū)域

部分復(fù)制染色體DNA之間或染色體DNA與外源DNA之間

1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位點(diǎn)?含有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、

序列特異性單鏈內(nèi)切酶活性?單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生含有游離末端單鏈－－－RecA作用位點(diǎn)?RecBCD有固定切割位點(diǎn)遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第15頁(yè)3‘?RecBCD識(shí)別和切割位點(diǎn)a、RecBCD結(jié)合在DNA平頭末端b、外切、解鏈、移動(dòng)（ATP）c、兔耳狀loop結(jié)構(gòu)產(chǎn)生（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop單鏈區(qū)

chi位點(diǎn)處切斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶）?

chi位點(diǎn)：GCTGGTGG當(dāng)前發(fā)覺(jué)重組熱點(diǎn)

遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第16頁(yè)RecA入侵單鏈被置換連RecA引發(fā)鏈侵入模型遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第17頁(yè)RecA引發(fā)鏈交換和Holliday結(jié)構(gòu)生成

遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第18頁(yè)?RecBCD和

RecA共同作用遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第19頁(yè)

3、原核同源重組其它蛋白

需要E.coli中三個(gè)基因ruvA,ruvB和ruvC產(chǎn)物a、RuvA識(shí)別Holliday結(jié)構(gòu)連接點(diǎn)b、RuvB為分枝遷移提供動(dòng)力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸內(nèi)切酶---專(zhuān)一性識(shí)別Holliday結(jié)構(gòu)連接點(diǎn)體外切段連接點(diǎn)以拆分重組體遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第20頁(yè)第二節(jié)位點(diǎn)專(zhuān)一性重組遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第21頁(yè)一、位點(diǎn)專(zhuān)一性重組（site-specificrecombination）1、概念：發(fā)生在專(zhuān)一序列而次序極少相同DNA分子間重組如：噬菌體基因整合到細(xì)菌染色體基因中2、特征：?在特定結(jié)合序列部位，有專(zhuān)一酶催化斷裂重接----產(chǎn)生準(zhǔn)確DNA重排?都含有整合作用兩個(gè)基本特征a、經(jīng)典保守性重組b、發(fā)生在噬菌體和細(xì)菌DNA短同源序列專(zhuān)一性核苷酸上遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第22頁(yè)二、λ整合與切除1、實(shí)現(xiàn)機(jī)制：均是經(jīng)過(guò)---細(xì)菌DNA和λDNA上特定位點(diǎn)之間重組2、特定位點(diǎn)-----附著位點(diǎn)（attachmentsiteatt）?E.coliattB含BOB’三序列23bp?λphage

attP含POP’三序列240bp?關(guān)鍵序列“O”完全一致

（同源部分）---位點(diǎn)特異性重組發(fā)生地方遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第23頁(yè)3、整合過(guò)程?整合后附著位點(diǎn)為attL（BOP’）attR（POB’）?整合位點(diǎn)---attB、attP切除位點(diǎn)---attL、attR?整合過(guò)程需要λ整合酶

和寄主整合宿主因子IHF共同作用遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第24頁(yè)溶源性細(xì)菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌體遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第25頁(yè)4、整合分子機(jī)制?關(guān)鍵序列O全長(zhǎng)15bp，富含A-T?發(fā)生在O內(nèi)重組交換位點(diǎn)相距7bp?整合酶結(jié)合位點(diǎn)：attP240bp、attB23bp?attP位點(diǎn)負(fù)超螺旋為重組所必須---加強(qiáng)了Int和IHF親和力

?Int結(jié)合----關(guān)鍵序列反向位點(diǎn)（切割位置）----結(jié)合在att臂上（臂與關(guān)鍵區(qū)靠近）遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第26頁(yè)intIHF遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第27頁(yè)?整合體及其作用整合體（intasome）---Int和IHF結(jié)合到attP時(shí)復(fù)合物?整合體捕捉attB說(shuō)明-----

a、attB和attP最初識(shí)別靠Int識(shí)別兩序列能力b、兩序列同源性在鏈交換時(shí)為主要原因遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第28頁(yè)第三節(jié)細(xì)菌中轉(zhuǎn)座成份遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第29頁(yè)一、轉(zhuǎn)座成份概述1、轉(zhuǎn)座子(元)或轉(zhuǎn)座元件:基因組無(wú)須借助于同源序列就能夠移動(dòng)DNA片段，它們能夠直接從基因組一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)。轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座元轉(zhuǎn)移過(guò)程。2、發(fā)覺(jué)和發(fā)展?1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes玉米果皮、糊粉層花斑突變玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機(jī)理跳躍基因（jumpinggene）?1947冷泉港試驗(yàn)室（美）BarbaraMcClintock遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第30頁(yè)a)不依賴(lài)供體序列與靶位點(diǎn)間序列同源性b)轉(zhuǎn)座不是簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)移，包括轉(zhuǎn)座子復(fù)制d)一些轉(zhuǎn)座因子（Tn3）對(duì)同類(lèi)轉(zhuǎn)座因子插入含有排他性

（免疫性）e)靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)形成正向重復(fù)f)轉(zhuǎn)座因子切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜遺傳學(xué)效應(yīng)3、轉(zhuǎn)座重組特點(diǎn)c)轉(zhuǎn)座插入靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī)（插入專(zhuān)一型）遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第31頁(yè)二、轉(zhuǎn)座子種類(lèi)?兩種類(lèi)型：簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子（simpletransposon）復(fù)合轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）?共同特征：a）兩端有20～40bp相同編碼區(qū)b）有編碼轉(zhuǎn)座酶基因1、插入序列（插入序列insertionsequenceIS）?最簡(jiǎn)單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和一些噬菌體正常組分?命名：IS＋編號(hào)（判定類(lèi)型）長(zhǎng)度700～bp遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第32頁(yè)?特點(diǎn)：a）兩端為轉(zhuǎn)座酶識(shí)別位點(diǎn)b）插入靶位點(diǎn)后會(huì)出現(xiàn)靶位點(diǎn)正向重復(fù)（3～9bp）遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第33頁(yè)?IS能夠正反方向插入到DNA（宿主、質(zhì)粒或一些噬菌體），常對(duì)插入位點(diǎn)后面基因表示有所影響。遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第34頁(yè)a)Tn/TnAfamily

l含有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)整基因（解離酶）l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2.5kb20kb

Tn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp轉(zhuǎn)座酶

regulatorβ-內(nèi)酰胺酶

2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子?兩種類(lèi)型遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第35頁(yè)b）兩端重復(fù)序列為IS復(fù)合轉(zhuǎn)座子

e.g.

IS插入到功效基因兩端，可能形成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子ISISISISLISR臂中心區(qū)臂transposition遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第36頁(yè)?當(dāng)兩個(gè)IS組件相同時(shí)，其中任一個(gè)都可行使轉(zhuǎn)座功效?不一樣時(shí)，主要依靠一個(gè)遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第37頁(yè)3轉(zhuǎn)座噬菌體Muphage

（巨型轉(zhuǎn)座子）

C

repressorforA,BB33kd與轉(zhuǎn)座相關(guān)A70kd轉(zhuǎn)座酶U,S毒性蛋白attL,attR與寄主同源，反向重復(fù)，轉(zhuǎn)座必需attLCABSUattR150bp1.5kb

G倒位區(qū)38kbPgin?以E.coli為寄主溫和型噬菌體（溶源、裂解）遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第38頁(yè)?Mu插入路徑a）侵入Mu在溶源化過(guò)程中任意插入寄主DNA（兩側(cè)各5bp靶位點(diǎn)序列重復(fù)）b）進(jìn)入裂解生長(zhǎng)后，復(fù)制產(chǎn)生后代MuDNA幾乎全部插入寄主DNA中，并可繼續(xù)轉(zhuǎn)座（形成寄主DNA和Mu共合體），噬菌體成熟——切段共合體——包裝遺傳和重組專(zhuān)題知識(shí)專(zhuān)家講座第39頁(yè)三、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)作機(jī)制及模式?三種類(lèi)型：復(fù)制型、非復(fù)