中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座

中藥判定創(chuàng)新方法體系建立與推廣

DNAbarcodingsystemforherbalmaterials

陳士林ShilinChen中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第1頁(yè)中藥判定技術(shù)瓶頸

一萬(wàn)余種中藥材物種判定品種混亂傳統(tǒng)四大判定方法體系局限路在何方？基原判定形態(tài)判定顯微判定理化判定中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第2頁(yè)DNA條形碼中藥判定領(lǐng)域變革與突破經(jīng)典中藥判定方法難以滿足當(dāng)代需求判定方法缺失造成嚴(yán)重安全性事件

--關(guān)木通誤當(dāng)木通服用，造成急性腎功效衰竭（馬兜鈴酸腎病事件）

--土三七誤當(dāng)三七服用，造成嚴(yán)重肝毒性Hoangetal.ScienceTranslationalMedicine,,5:197ra102.NortierJL,MartinezMCM,SchmeiserHH,etal.NewEnglandJournalofMedicine,,342(23):1686-1692.關(guān)木通baidu百科木通中藥材天地網(wǎng)中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第3頁(yè)DNAbarcodingcanachievearapidandaccurateidentificationforherbsApowerfultoolforidentifyingmedicinalplantsandtraditionalChinesemedicinalmaterialsAbruscantoniensis

Abrusprecatorius

MedicinalplantsChineseherbalmedicinesDNAbarcodingtechnologyusesashortandstandardizedgeneregiontoidentifyspeciesOnesequenceOnespecies中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第4頁(yè)課題組首次提出并驗(yàn)證ITS2條形碼，引發(fā)國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注

國(guó)際期刊PLoSONE關(guān)注藥用植物DNA條形碼。該文提出ITS2序列為藥用植物通用條形碼序列，為陸地植物DNA條形碼序列篩選提出了新視角，由此引發(fā)同行關(guān)注和討論。被德國(guó)專業(yè)網(wǎng)站選為近25年來(lái)在ITS2領(lǐng)域最受關(guān)注16篇文章之一http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/該文發(fā)表后3年引文288次中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第5頁(yè)首次驗(yàn)證ITS2為藥用植物判定通用條形碼經(jīng)過(guò)研究比較psbA-trnH,matK,rbcL,rpoC1,ycf5,ITS2和

ITS等七個(gè)候選DNA條形碼，發(fā)覺(jué)ITS2是最正確條形碼序列ITS2長(zhǎng)度約230bp，易于擴(kuò)增和測(cè)序，物種判定能力強(qiáng)，適合中藥材等存在DNA降解材料判定人參、西洋參、羌活、寬葉羌活DNA條形碼判定方法正在納入國(guó)家藥典中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第6頁(yè)

Relativedistributionofinter-specificdivergencebetweencongenericspeciesandintra-specificvariationforfourloci.Thetwobarsineachboxrepresentinter-specific(above)andintra-specific(below)geneticdistances.IdentificationofthefamilyRosaceaeW+W-RelativeRanks,n,PvalueResultITS2matKW+=703,W-=0,n=37,P≤1.139×10-7ITS2>matKITS2rbcLW+=703,W-=0,n=37,P≤1.137×10-7ITS2>rbcLITS2rpoC1W+=703,W-=0,n=37,P≤1.133×10-7ITS2>rpoC1matKrbcLW+=620,W-=46,n=36,P≤6.479×10-6matK>rbcLmatKrpoC1W+=655,W-=11,n=36,P≤4.174×10-7matK>rpoC1rbcLrpoC1W+=359,W-=106,n=30,P≤0.009rbcL>rpoC1Wilcoxonsigned-ranktestsofinter-specificdivergenceamongloci.ITS2andrbcL,matK,rpoC1werecompared.For54samplesfrom43speciesin19diversegenera,thesuccessfulidentificationratewithITS2was100%,followedbymatK(94%)andrbcL(65%).

For1410samplesfrom893speciesin96genera

No.ofgenera(≥2species):47(1351samples)

No.ofspecies(≥2samples):297(814samples)

IdentificationratewithITS2was100%and78%at

genusandspecieslevel,respectively.XPang,ShilinChen*.Cladistics,2011,27中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第7頁(yè)ComparativeanalysisofalargedatasetindicatesthatITSshouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants

ChinaPlantBOLGroup,LiDezhuetal.,PNAS,WethereforeproposethatITS/ITS2shouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants.(提議ITS/ITS2應(yīng)成為種子植物關(guān)鍵條形碼)IncaseswhereitisdifficulttoamplifyanddirectlysequenceITSinitsentirety,justusingITS2isausefulback-upasitiseasiertoamplifyandsequencethissubsetofthemarker.(ITS難以擴(kuò)增和測(cè)序時(shí)，ITS2能夠有效地填補(bǔ)該缺點(diǎn))中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第8頁(yè)

創(chuàng)建ITS2為主體條形碼中草藥判定體系研究一萬(wàn)余份藥材樣本（包括數(shù)千個(gè)基原物種）70余篇相關(guān)文章發(fā)表于Cladistics、PLoSONE、PNAS、BMCEvolBiol、中國(guó)科學(xué)等雜志出版《中藥DNA條形碼分子判定》人民衛(wèi)生出版社起草中國(guó)藥典中藥材DNA條形碼分子判定指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，已獲準(zhǔn)納入國(guó)家藥典建立中藥DNA條形碼分子判定標(biāo)準(zhǔn)流程中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第9頁(yè)冬蟲(chóng)夏草混偽品及近緣種人造偽品：滇紫菀冬蟲(chóng)夏草及其混偽品/近緣種背景：分布范圍狹窄，生態(tài)環(huán)境脆弱，資源蘊(yùn)藏量有限（產(chǎn)量每年80-100噸）；

市場(chǎng)產(chǎn)不足銷，價(jià)格已超黃金(Guo,)

混偽品泛濫，如古尼蟲(chóng)草，蛹蟲(chóng)草，人造偽品滇紫菀等

樣品：冬蟲(chóng)夏草與13種混偽品及近緣種，冬蟲(chóng)夏草采自四川、青海、西藏等主產(chǎn)區(qū)

185

條ITS/ITS2序列

(冬蟲(chóng)夏草樣品53份，偽品45份，GenBank序列87條)A：正品：冬蟲(chóng)夏草B：偽品：亞香棒蟲(chóng)草/古尼蟲(chóng)草C：人造偽品：滇紫菀D：偽品涼山蟲(chóng)草E：偽品：蟬花F：偽品：下垂蟲(chóng)草G：偽品：Cordycepsrobertsii（新西蘭）結(jié)果：基于BLAST/DISTANCE判定效率：100%基于NJtree判定結(jié)果：全部冬蟲(chóng)夏草序列單獨(dú)聚為一支，

并能與全部混偽品及近緣種區(qū)分開(kāi)XiangL,ChenSL,etal.FEMSmicrobiologyletters,,347(2):156-162.DNA條形碼判定冬蟲(chóng)夏草及其偽品中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第10頁(yè)《中國(guó)藥典》中藥材DNA條形碼分子判定指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第11頁(yè)

Morphologicalcharacteristicsofthepowder,decoctionpieces,seed,seedling,andfibreamongtheP.ginseng,P.quinquefolius,Pnotoginsenganditscloselyrelatedspeciesaresimilar.Itisdifficulttoidentifysomanydifferentpanaxspeciesandginsengproduceinmedicinalusesbytraditionalclassificationmethods.UsingDNAbarcodetoidentifypanaxmedicinalspecies人參類及其混偽品判定中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第12頁(yè)13

15101520253035404550SN01:p.ginseng;SN03:p.quinquefolius顯示人參、西洋參ITS2序列SNPs位點(diǎn)信息。Position32and43為區(qū)分人參和西洋參SNPs位點(diǎn)為驗(yàn)證該方法準(zhǔn)確性，我們下載了GenBank全部些人參、西洋參ITS2序列，表明兩個(gè)SNPs位點(diǎn)穩(wěn)定存在樣品起源：采集了主產(chǎn)區(qū)吉林，遼寧，黑龍江，北京，山東,加拿大及上海和香港藥市人參西洋參樣品共計(jì)72份應(yīng)用ITS2序列兩個(gè)SNPs能夠快速準(zhǔn)確判他人參西洋參，所得組合為C-T，則確定為人參，所得組合為T(mén)-C，則確定為西洋參ITS2sequenceposition1-50ofp.ginsengandp.quinquefolius

方法結(jié)果結(jié)論基于ITS2條形碼判定人參和西洋參Gene,,530(1):39-43.AFastSNPIdentificationofMedicinalPanaxSpeciesBasedonDNABarcodingAnalysis,

中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第13頁(yè)14金銀花藥材及其混偽品ITS2條形碼判定金銀花（忍冬）山銀花（紅腺忍冬）山銀花（黃褐毛忍冬）山銀花（灰氈毛忍冬）研究對(duì)象：包含24份金銀花藥材。M:marker1、26:陰性對(duì)照(CK)2-25:金銀花27-47：混偽品DNA提取：取金銀花藥材約25mg，利用植物基因組DNA提取試劑盒(TiangenBiotechCo.,China)提取總DNA。ITS2序列PCR擴(kuò)增程序及電泳圖94℃變性5min94℃變性30sec58℃退火30sec72℃延伸45sec72℃延伸10min40個(gè)循環(huán)BLAST判定中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第14頁(yè)

IdentificationofCortexHerbsSunZY,ChenSL*.JNatMed..Theidentificationefficiencyof51samplesbelongingto19kindsof

cortexherbsinChinesePharmacopoeia

examinedwas100%usingITS2sequenceasDNAbarcode.ApplytheITS2barcodetoauthenticate

medicinalmaterials皮類藥材條形碼判定中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第15頁(yè)條羌N.franchetii大頭羌N.franchetii蠶羌N.incisumPhylogenetictreeconstructedwiththeITS/ITS2sequencesadulterantsITSITS231medicinalmaterialssamplesStabilityandAccuracyoftheIdentificationusingITS/ITS2barcodes

(Notopterygii)羌活藥材ITS/ITS2條形碼判定及其穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性研究TheNJtreesshowedthatQianghuoanditsadulterantscanbeeasilydifferentiatedaccordingtotheirmonophyly..ITSITS2HaplotypeVariablesitesHaplotypeVariablesitesN.incisum4433N.franchetii61045XinTChenS*,etal.ActaPharmSin.,8中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第16頁(yè)UseofthepotentialDNAbarcodeITS2toidentifyherbalmaterials全草類DNA條形碼判定

TheITS2barcodecoulddistinguishsuccessfullyallthe34herbsfromtheir111adulterants.Figure1.Thepresence/absenceofbarcodegapsbetweenherbsandtheiradulterants.

PangXH,ChenSL*etal.JNatMed.中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第17頁(yè)建立中藥材DNA條形碼判定系統(tǒng)網(wǎng)站中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第18頁(yè)

DNAbarcodesystemshowsstrongabilitiesinidentifyingherbcrypticspeciesBLASTPROCESS打開(kāi)網(wǎng)址，進(jìn)入中藥材DNA條形碼判定系統(tǒng)主頁(yè)點(diǎn)擊物種判定，選擇植物類藥材判定（ITS2/ITS）進(jìn)入右圖界面。中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第19頁(yè)在空白處粘貼入需要校正確序列（Query）點(diǎn)擊左下角提交比對(duì)序列相同性信息100.0%為人參，說(shuō)明該序列判定結(jié)果為人參Quick-and-easyDNAidentificationofherbsisunderway中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第20頁(yè)華潤(rùn)三九中藥材DNA條形碼判定專用軟件中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第21頁(yè)2023/4/24中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第22頁(yè)

七葉皂苷注射劑娑羅子藥材基原植物為七葉樹(shù)Aesculus

chinensis、浙江七葉樹(shù)Aesculus

chinensisvar.chekiangensis和天師栗Aesculus

wilsonii娑羅子藥材DNA條形碼判定1.材料

七葉樹(shù)屬10個(gè)物種42份樣本采自云南、四川、陜西、湖北、浙江和北京各個(gè)分布區(qū)域結(jié)論七葉樹(shù)屬候列擴(kuò)增效率與測(cè)序成功率均為100%，而且物種判定效率最高，為95.4%，更適合用于七葉樹(shù)屬判定分析。psbA-trnH序列種間差異最大，在區(qū)分物種上含有優(yōu)勢(shì)?；趐sbA-trnH序列構(gòu)建NJ樹(shù)，可準(zhǔn)確判別其各個(gè)基原物種。七葉樹(shù)屬植物psbA-trnH序列比對(duì)變異位點(diǎn)圖正品中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第23頁(yè)柴胡Chaihu正品：為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.、狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.干燥根。近緣種：同屬植物麗江柴胡B.rockii，小葉黑柴胡B.smithiivar.parvifolium，抱莖柴胡B.longicaulevar.amplexicaule，細(xì)莖有柄柴胡B.petiolulatumvar.tenerum和窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllum。（三）柴胡與其近緣種NJ樹(shù)圖所表示：柴胡正品基原柴胡與狹葉柴胡均獨(dú)立聚為一支，與其混偽品能夠區(qū)分開(kāi)。結(jié)果表明：基于ITS2序列能很好區(qū)分柴胡及其近緣種（一）柴胡及其及其近緣物種ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)：（二）柴胡與其混偽品ITS2序列間存在較多變異位點(diǎn)柴胡不一樣基原ITS2條形碼consensus序列柴胡ITS2序列峰圖中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第24頁(yè)慣用中藥材進(jìn)行了DNA條形碼研究課題組已經(jīng)進(jìn)行DNA條形碼研究慣用中藥材包含：人參，西洋參，三七，大黃，石斛，重樓，金銀花，丹參，天南星，紅豆蔻，肉蓯蓉，京大戟，麻黃，高良姜，何首烏，吳茱萸，連翹，甘草，玉竹，冬蟲(chóng)夏草，羌活等中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立和推廣專家講座第25頁(yè)

PublishedpapersonDNAbarcodeCladistics,,27:BMCEvol.Biol.,,10:324

PLoSONE,,5:e13102.ChinaPlantBOLGroup.PNAS,,108(49)FEMSMicrobiologyLetters,

PLoSONE,,7(5):e35146.Jingyu