重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講

DNA重組質(zhì)粒構(gòu)建醫(yī)學(xué)生物所病毒免疫室重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第1頁基因克隆genecloning應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將目標(biāo)基因與載體DNA結(jié)合成一含有自我復(fù)制能力DNA分子（重組體），繼而經(jīng)過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)菌或細(xì)胞、篩選出含有目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化子細(xì)菌或細(xì)胞，再進(jìn)行擴增、提取取得大量同一DNA分子拷貝。關(guān)鍵技術(shù)：DNA重組技術(shù)

（recombinantDNAtechnique）重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第2頁基因克隆基本程序：

分—切—接—轉(zhuǎn)—篩PCR酶切連接轉(zhuǎn)化&轉(zhuǎn)染抗性或標(biāo)識篩選目標(biāo)基因DNA片段取得外源DNA分子與載體DNA分子體外重組重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)受體菌或細(xì)胞重組DNA分子克隆篩選和判定目標(biāo)基因或其表示產(chǎn)物純化和判定基因克隆技術(shù)特點：

1.可在體外人工,有目標(biāo),依據(jù)需要進(jìn)行基因重組、表示、測序、誘變、修復(fù)；

2.方法簡便、快速、準(zhǔn)確、特異，能確保研究與開發(fā)需要。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第3頁基因克隆示意圖重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第4頁胰島素人生長激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長激素促生長素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第5頁例：干擾素是治療癌癥主要物質(zhì)，人血液中每升只能提取0.05μg干擾素，因而其價格昂貴。但美國有一家企業(yè)用遺傳工程方法合成了價格低廉、藥性一樣干擾素，其詳細(xì)做法是：從人淋巴細(xì)胞中提取能指導(dǎo)干擾素合成基因，并使之與一個叫做質(zhì)粒DNA結(jié)合，然后移植到酵母菌內(nèi)，從而用酵母菌來產(chǎn)生干擾素。酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在較短時間內(nèi)大量生產(chǎn)干擾素。利用這種方法不但產(chǎn)量高，而且成本也較低。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第6頁DNA重組操作過程載體外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主細(xì)胞abbA重組Ab抗性篩選重組篩選重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第7頁重組質(zhì)粒構(gòu)建：目標(biāo)DNAPCR擴增

DNA片段和載體酶切

片段DNA與載體連接載體：plasmid（primary）工具酶：限制性內(nèi)切酶

連接酶

重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第8頁常見基因工程載體載體：用于攜帶重組DNA，而且能夠使外源DNA一起復(fù)制與表示運載工具。依據(jù)起源：plasmid;phage;viral;BAC;YAC依據(jù)用途分：克隆載體；原核生物表示載體；真核生物表示載體依據(jù)與宿主關(guān)系分：整合性載體、非整合性載體基因工程中用得最多是plasmid載體。下面介紹幾個常見載體。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第9頁載體基本結(jié)構(gòu)單元：1.復(fù)制起點2.克隆位點3.篩選標(biāo)識其它條件：4.適當(dāng)大小5.易于操作：包含宿主、轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、分離純化、重組等等。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第10頁質(zhì)粒(Plasmid)質(zhì)粒是獨立于宿主細(xì)胞（如細(xì)菌）染色體之外可進(jìn)行復(fù)制和遺傳遺傳單位-雙鏈閉合環(huán)狀超螺旋DNA分子。是一個環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小從1K-200Kb。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第11頁通常質(zhì)粒含有一些染色體沒有基因，負(fù)責(zé)編碼一些功效蛋白，這些功效并不是細(xì)菌生存所必需，但在一定環(huán)境下，可對細(xì)菌宿主生存有利。由質(zhì)粒產(chǎn)生表型包含反抗生素抗性（R因子）、產(chǎn)生抗生素、降解復(fù)雜有機化合物、產(chǎn)生大腸桿菌素（大腸桿菌素因子col）、腸毒素及限制酶、修飾酶等。質(zhì)粒存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。它們復(fù)制時利用宿主細(xì)胞復(fù)制本身染色體同一組酶系。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第12頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第13頁質(zhì)粒DNA特征質(zhì)粒復(fù)制依賴宿主細(xì)胞復(fù)制機器，但能夠獨立復(fù)制。（單拷貝或多拷貝：緊密型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒）嚴(yán)緊型：這些質(zhì)粒復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下，與寄主細(xì)胞復(fù)制偶聯(lián)同時。所以，往往在一個細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝；松馳型：這些質(zhì)粒復(fù)制是在寄主細(xì)胞松弛控制之下，每個細(xì)胞中含有10-200份拷貝重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第14頁不相容質(zhì)粒攜帶復(fù)制子基本相同，復(fù)制系統(tǒng)也相同，在復(fù)制和分配到子細(xì)胞過程中相互競爭。質(zhì)粒DNA所編碼基因產(chǎn)物賦予細(xì)菌一些性狀特征。質(zhì)粒并非細(xì)菌生存所必不可少遺傳物質(zhì)，能夠在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移與丟失。質(zhì)?？勺孕惺セ蚪?jīng)人工處理而消失可有幾個質(zhì)粒同時共存在于一個細(xì)菌內(nèi)，但同群質(zhì)粒有不相容性（同群質(zhì)粒含有同源性，能夠產(chǎn)生相同阻遏蛋白，故彼此間有相互抑制作用，不能共存于同一細(xì)胞）重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第15頁（四）人工構(gòu)建質(zhì)?；驹⑹紡?fù)制子：使質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中能夠復(fù)制抗性基因：用于篩選陽性克隆。多克隆位點：插入外源基因。對于表示載體還需要開啟子、多聚A尾等.易于操作：包含宿主、轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、分離純化、重組等等。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第16頁pBR322plasmid是一個克隆載體，作為一個克隆載體最基本要求都具備：復(fù)制起點:Ori克隆位點:EcoRI;HindIII;BamHI;SalI篩選標(biāo)識:Ampr。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第17頁T-vectorPCR產(chǎn)物亞克隆載體重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第18頁T—Vector是一個高效克隆PCR產(chǎn)物(TACloning)專用載體，由pUC18載體改建而成。在pUC18載體多克隆位點處XbaI和SalI識別位點之間插入了EcoRV識別位點，用EcoRV進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)3‘端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物3’末端添加一個“A”特征,所以用本制品可大大提升PCR產(chǎn)物連接、克隆效率。

T-vector克隆PCR產(chǎn)物時用高效連接液LigationSolutionI能夠在極短時間內(nèi)(30分鐘～1小時)完成連接反應(yīng)，大大地方便了試驗操作。用途克隆PCR產(chǎn)物。對克隆后PCR產(chǎn)物使用M13primers進(jìn)行DNA測序。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第19頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第20頁

原核生物表示載體Bacterialexpressionvector重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第21頁復(fù)制起點克隆位點篩選標(biāo)識開啟子﹡轉(zhuǎn)錄終止序列﹡核糖體結(jié)和位點：起始密碼子ATG和SD序列（翻譯識別）原核生物表示載體基本結(jié)構(gòu)單元包含：重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第22頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第23頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第24頁

真核生物表示載體（mammalianexpressionvector)重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第25頁真核生物表示載體結(jié)構(gòu)單元復(fù)制起點（真核和原核）克隆位點篩選標(biāo)識(原核和真核標(biāo)識）增強子/開啟子﹡PolyA﹡終止信號重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第26頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第27頁LocationofFeaturesPCMVIE:

CMVIEenhancer:1-659

CMVIEpromoter:669-750Interveningsequence(IVS):890-1022T7RNApolymerasepromoter:1067-1085Multiplecloningsite:1085-1137T3RNApolymerasepromoter:1158-1137SV40fragmentcontainingpolyadenylationsignal:1167-1388f1originofreplication:1483-1938重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第28頁EGFPexpressioncassette:-3455SV40enhancer/earlypromoter:-2420

EGFPstructuralgene:2449-3168

Kozakconsensustranslationinitiationsite:2442-2452

Startcodon(ATG):2449-2451;Stopcodon:3166-3168

InsertionofValatposition2:2452-2454

GFPmut1chromophoremutations(Phe-64toLeu;Ser-65toThr):2731-2735

His-231toLeumutation(A-->T):3143

Bovinegrowthhormone(BGH)genefragmentcontainingpolyadenylationsignal:3182-3455SV40originofreplication:2318

Ampicillinresistance(b-lactamase)gene:3449-4709

Startcodon(ATG):3849-3451

Stopcodon(TAA):4707-4709重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第29頁噬菌體載體λ噬菌體(λphage)外源DNA：9~23kb慣用：EMBL系列、λgt系列、charon系列粘性質(zhì)粒(cosmid)：λDNA

cos區(qū)+質(zhì)粒，雙鏈環(huán)狀DNA，克隆容量：40~50kbM13噬菌體重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第30頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第31頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第32頁λ噬菌體(λphage)

特點：一個能感染大腸桿菌病毒，野生型為雙鏈線狀DNA分子，長度48.5kb,分子兩端各有一個12bp組成粘性末端,感染大腸桿菌后,線狀DNA經(jīng)過粘性末端互補連接成環(huán),連接處稱COS位點。

1.本身有復(fù)制體系;2.中間(J-N間)是λ生長非必需區(qū),可被其它外源DNA取代;

重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第33頁

3.λDNA在體外可包裝成病毒顆粒,感染效率高;4.載體容量大,可裝入大片段外源DNA(20kb);5.可人工加入多克隆位點;6.篩選輕易——噬菌斑篩選;7.主要用于DNA文庫構(gòu)建.重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第34頁插入型載體——含單一限制性酶切位點，可接收10kb以下外源片段，可用于cDNA文庫構(gòu)建；取代型載體——含某一限制性酶兩個切點，可接收20kb左右外源片段，可用于基因組DNA文庫構(gòu)建。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第35頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第36頁粘性質(zhì)粒(cosmid)

是一個人工改造載體,雙鏈環(huán)狀DNA，含有λDNA

cos區(qū)+質(zhì)粒，克隆容量：40~50kb

1.λ-DNACOS位點;

2.質(zhì)粒復(fù)制起點和抗藥性標(biāo)識(Ampr);

3.各種單一酶切位點.

重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第37頁cosmid較小,約4–6kb,可容納40-45kb外源DNA,因為噬菌體DNA包裝時包裝蛋白識別只是DNA粘性末端附近一小段次序，所以只要一個質(zhì)粒接上此粘性末端次序，再加上外源DNA片段使其長度為野生型DNA大小75－105%，重組體可象噬菌體一樣進(jìn)行外殼裝配,形成噬菌體顆粒,感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒高得多,進(jìn)入宿主細(xì)胞后,只能象質(zhì)粒一樣擴增,并依賴抗藥性被篩選.重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第38頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第39頁優(yōu)缺點:

1.克隆效率高;

2.可利用質(zhì)粒DNA方式擴增;

3.可克隆較大DNA片段;

主要用于真核基因克隆,基因組文庫構(gòu)建

4.缺點:產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。

重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第40頁M13噬菌體

一個絲狀單鏈?zhǔn)删w，閉環(huán)正鏈ssDNA，全長6.5kb,感染大腸桿菌后,ssDNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sDNA,可用作克隆載體.

最大優(yōu)點：產(chǎn)生單鏈DNA,可制備單鏈DNA探針.

重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第41頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第42頁構(gòu)建基因文庫克隆載體粘粒(Cosmid)細(xì)菌人工染色體(BAC)酵母人工染色體(YAC)P1噬菌體人工染色體(PAC)重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第43頁P1及YAC載體

酵母人工染色體，可容納外源基因片段長達(dá)200kb-1000kb，含有酵母第4號染色體著絲粒和自主復(fù)制序列CEN4、ARS1，作為端粒Tel序列，選擇性標(biāo)志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中穩(wěn)定復(fù)制，慣用于大染色體基因組DNA文庫構(gòu)建。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第44頁一個經(jīng)典YAC系列載體重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第45頁病毒載體

DNA病毒在細(xì)胞中含有較高拷貝數(shù)，并有較強開啟子，因而是基因工程載體理想候選者。諸如：SV40（猴腎病毒）Epstein-Barr病毒(EBV病毒)牛乳頭瘤病毒（BPV）昆蟲桿狀病毒（baculovirus)重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第46頁重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第47頁因為存在容量小、宿主范圍小等缺點，天然SV40病毒作為載體極少被使用，多數(shù)載體為帶有來自SV40中轉(zhuǎn)錄元件質(zhì)粒型載體SV40增強子、開啟子和復(fù)制子，能夠在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生高效組成型表示。SV40polyA信號，能夠?qū)D(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行加工，穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性。Zeocin抗性基因，可作為大腸桿菌及哺乳動物細(xì)胞選擇標(biāo)識。Zeocin抗性基因在大腸桿菌中合成由EM-7開啟子控制，在哺乳動物細(xì)胞中表示由CMV開啟子控制，既可用于瞬時表示，也可用于篩選穩(wěn)定表示細(xì)胞系。f1復(fù)制子，可產(chǎn)生單鏈DNA。ColE1復(fù)制起始位點，使質(zhì)粒可在大腸桿菌中復(fù)制擴增。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第48頁EB病毒EB病毒重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第49頁Epstein-Barr病毒(EBV病毒)是人類皰疹病毒,可轉(zhuǎn)化人B淋巴細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中以染色體外附加體形式存在。EBV病毒順式作用因子oriP能夠在帶有EBVDNA并表示含有反式作用EBNA－1抗原貼壁細(xì)胞中維持附加體DNA分子存在，因而能作為構(gòu)建表示載體元件，該類載體也主要用于建立帶有多拷貝外源基因細(xì)胞系。可在各種細(xì)胞中表示，可表示基因組DNA和cDNA,可為表示細(xì)胞系。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第50頁ComparisonofdifferentcloningvectorsVectortypeLengthofclonedDNAPlasmid20kbPhageλ25kbCosmid45kbP1vector100kbBAC100Kb(bacterialartificialchromosome)YAC1,000kb(yeastartificialchromosome)重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第51頁DNA重組操作過程載體外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主細(xì)胞abbA重組Ab抗性篩選重組篩選重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第52頁一把特殊剪刀—限制性內(nèi)切酶30多年前，當(dāng)人們在對噬菌體宿主特異性限制-修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時，首次發(fā)覺了限制性內(nèi)切酶。細(xì)菌能夠抵抗新病毒入侵，而這種“限制”病毒生存方法則可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源DNA限制性內(nèi)切酶。這些酶可在特定位點切開DNA，產(chǎn)生可體外連接基因片段。研究者很快發(fā)覺內(nèi)切酶是研究基因組成、功效及表示非常有用工具。阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第53頁限制性內(nèi)切酶特點：限制性內(nèi)切酶形式多樣，從大小上來說，它們能夠小到如PvuII（157個氨基酸），也能夠比1250個氨基酸CjeI更大除了一些病毒以外，限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)覺在已純化分類3000種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)覺了超出250種特異識別序列。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第54頁限制性內(nèi)切酶命名限制性內(nèi)切酶命名次序以下：A用3個字母代表起源生物，如大腸桿菌（

Escherichiacoli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。B1個字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株（EcoR、Hind）C1個羅馬字母代表發(fā)覺或判定次序（EcoRI、HindIII）重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第55頁限制性內(nèi)切酶分類按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等原因限制性內(nèi)切酶可劃分為三大類：I型限制性內(nèi)切酶II型限制性內(nèi)切酶III型限制性內(nèi)切酶重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第56頁I型限制性內(nèi)切酶是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性多個亞基蛋白復(fù)合體。其特點是識別位點和切割位點不一致，沒有固定切割位點。它們在識別位點很遠(yuǎn)地方任意切割DNA鏈，不產(chǎn)生確定限制片段和明確電泳條帶，因而不具備實用性。III型限制性內(nèi)切酶也是兼有限制-修飾兩種功效酶。即使有特異切割位點，但它們在識別位點之外切開DNA鏈，極少能產(chǎn)生確定切割片段，因而不具備實用價值，也沒有些人將其商業(yè)化。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第57頁II型限制性內(nèi)切酶在其識別位點之中或臨近確實定位點特異地切開DNA鏈。它們產(chǎn)生確定限制片段和跑膠條帶，所以是三種限制性內(nèi)切酶中唯一用于DNA分析和克隆一類。II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和起源都不盡相同蛋白組成，因而任意一個限制性內(nèi)切酶氨基酸序列可能與另一個限制性內(nèi)切酶氨基酸序列截然不一樣。實際上，從已知情況上看，這些酶很可能是在進(jìn)化過程中各自獨立產(chǎn)生，而非起源于同一個祖先。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第58頁II型限制性內(nèi)切酶中最普遍是象HhaI、HindIII和NotI這么在識別序列中進(jìn)行切割酶。這一類酶是組成商業(yè)化酶主要部分。大部分這類酶都以同二聚體形式結(jié)合到DNA上，因而識別是對稱序列；但有極少酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續(xù)序列（如EcoRI識別GAATTC）；而另一些識別不連續(xù)序列（如BglI識別GCCNNNNNGGC）。限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生一個3‘羥基端和一個5’磷酸基團(tuán)。它們活性要求鎂離子存在，而對應(yīng)修飾酶則需要S-甲硫氨酸腺苷存在。這些酶普通都比較小，亞基普通都在200-300個氨基酸左右。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第59頁一些概念粘末端和平末端同尾酶同裂酶同識異切酶消化星號活力重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第60頁限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端：

鈍性末端(bluntend)粘性末端(stickyend)重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第61頁同尾酶有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同粘性末端，這類酶被稱為同尾酶，能夠經(jīng)過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生一個新酶切位點。如XbaⅠ(T`CTAGA)、NheⅠ(G`CTAGC）、SpeⅠ(A`CTAGT)切割DNA序列不一樣，但均給出相同“CTAG”粘性末端。這些粘性末端連接后，以上酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新4核苷酸酶切位點，即BfaⅠ（C`TAG)酶切位點。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第62頁有時兩種限制性內(nèi)切酶識別核苷酸次序和切割位置都相同，其差異只在于當(dāng)識別次序中有甲基化核苷酸時，一個限制性內(nèi)切酶能夠切割，另一個則不能。比如HpaⅡ和MspⅠ識別次序都是5’……CCGG……3’，假如其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點酶稱為同裂酶（同切酶或異源同工酶）。同裂酶重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第63頁限制性內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下,也能切割一些與其特異識別序列類似序列。星號活性識別形式常對標(biāo)準(zhǔn)識別次序中兩側(cè)堿基沒有特異性。所以,盡可能采取規(guī)范試驗步驟,應(yīng)用推薦反應(yīng)條件。星號活力重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第64頁克?。ㄓ袝r與甲基化酶聯(lián)用）判定（基因片斷大小、正反向）檢測突變（識別位點，限制酶切圖譜多態(tài)性RFLP）制作Marker限制性內(nèi)切酶應(yīng)用重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第65頁限制性內(nèi)切酶使用一個標(biāo)準(zhǔn)酶切反應(yīng)包含：DNA適當(dāng)酶緩沖液蛋白酶為了提升酶切效率，可加入BSA。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第66頁1、建立一個標(biāo)準(zhǔn)酶切反應(yīng)通常，10個單位內(nèi)切酶能夠切割1μg不一樣起源和純度DNA。一個50μl反應(yīng)體系中，1μl酶在1XBuffer終濃度及對應(yīng)溫度條件下反應(yīng)1小時即可降解1μg已純化好DNA。假如加入更多酶，則可對應(yīng)縮短反應(yīng)時間；假如降低酶用量，對許多酶來說，對應(yīng)延長反應(yīng)時間（不超出16小時）也可完全反應(yīng)。普通說來，線性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1uglambdaDNA，需要1-2單位酶，而酶切1ug質(zhì)粒DNA，需要3-5單位酶。應(yīng)用中注意點重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第67頁2.選擇正確酶不言而喻，選擇酶在底物DNA上必須最少有一個對應(yīng)識別位點。內(nèi)切酶產(chǎn)物能夠是粘端（3'或5'突出端），也能夠是平端片段。粘端產(chǎn)物能夠與相容其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接，而全部平端產(chǎn)物都能夠相互連接重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第68頁3、加酶內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)該馬上置于冰上。酶應(yīng)該是最終一個被加入到反應(yīng)體系中（在加入酶之前全部其它反應(yīng)物都應(yīng)該已經(jīng)加好并已預(yù)混合）。酶用量視在底物上切割頻率而定。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第69頁4、DNA

待切割DNA應(yīng)該已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過多鹽離子污染，以免干擾酶活性。DNA甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到原因重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第70頁5、緩沖液對于每一個酶都提供對應(yīng)最正確緩沖液，可確保酶活性。使用時緩沖液濃度應(yīng)為1X。有酶要求100μg/mlBSA以實現(xiàn)最正確活性。不需要BSA酶假如加了BSA也不會受太大影響重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第71頁6、反應(yīng)體積內(nèi)切酶活力單位定義是：1小時內(nèi)，50μl反應(yīng)體積中，降解1μg底物DNA所需酶為一個活力單位。所以酶：DNA反應(yīng)百分比能夠由此確定。較小反應(yīng)體積更輕易受到移液器誤差影響。為了將甘油濃度控制在5%以下，要注意酶體積不要超出總體積10%（普通酶都貯存于50%甘油中）重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第72頁7、混合這是非常主要然而經(jīng)常被忽略一步。想要反應(yīng)完全，必須使反應(yīng)液充分混合。我們推薦用槍重復(fù)吸收混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩！重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第73頁8、反應(yīng)溫度大部分酶反應(yīng)溫度為37℃；從嗜熱菌中分離出來內(nèi)切酶則要求更高溫度。普通為50-65℃不等重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第74頁9、反應(yīng)時間

1酶活單位定義時間為1小時。假如加入酶較多，能夠?qū)?yīng)地縮短反應(yīng)時間；反之，假如加入酶量較少，也能夠延長時間以使反應(yīng)到達(dá)完全重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第75頁10、終止反應(yīng)假如不進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用終止液來終止反應(yīng)。我們使用以下反應(yīng)終止液：50%甘油，50mMEDTA（pH8.0），和0.05%溴酚藍(lán)（10μl/50μl反應(yīng)液）。假如要進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用熱失活法終止反應(yīng)（65℃或85℃，20分鐘）。熱失活并不能適合用于全部酶。另外，酚/氯仿抽提也能夠用于終止反應(yīng)。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第76頁11、貯存大部分酶應(yīng)貯存于-20℃。少部分酶則須在-70℃長久保留。10XBUFFER和100XBSA于-20℃保留。BSA不能與Buffer混合后保留，不然將會出現(xiàn)BSA沉淀重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第77頁12、穩(wěn)定性大部分酶在推薦保留緩沖液里在-20℃條件下十分穩(wěn)定。高于-20℃條件下穩(wěn)定性將有所降低重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第78頁13、對照反應(yīng)假如發(fā)覺DNA底物不能被成功切開，能夠進(jìn)行對照試驗以查明原因。詳細(xì)方法以下：將不加內(nèi)切酶底物DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶對照DNA（有多個已知酶切位點）同時進(jìn)行反應(yīng)。若試驗結(jié)果表明底物DNA降解，則說明DNA在純化過程中或反應(yīng)液里引入了核酸酶污染；若試驗結(jié)果發(fā)覺底物DNA保持完整，而對照DNA被成功切開，則能夠排除酶質(zhì)量原因，此時能夠?qū)φ誅NA和待切底物DNA混合起來再次進(jìn)行反應(yīng)，以確定樣品中是否有抑制劑。假如有抑制劑存在（通常是鹽、EDTA或酚），則混合物里對照DNA也無法被切開重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第79頁使用限制性內(nèi)切酶普通步驟A）測試酶切DNA量B）計算完全酶切所需酶量。為使終體積中甘油濃度低于8%，計算能加酶量，最多能加終體積10%（甘油濃度為5%）。C）10X反應(yīng)液體積應(yīng)為終體積1/10；10X反應(yīng)液體積不應(yīng)小于酶體積。D）加入計算好DNA，10X反應(yīng)液，酶。加入水到終體積（20-50ul），輕輕混勻，在適當(dāng)溫度下保溫。普通酶最適溫度為37oC，但有例外。應(yīng)查訊分析說明。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第80頁舉例質(zhì)粒DNA（2ug/ul）5ul10X反應(yīng)液5ul內(nèi)切酶2uldH2O38ul總體積50ul37oC保溫2-3小時。應(yīng)最終加酶。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第81頁提升限制性核酸內(nèi)切酶對低純度DNA制劑反應(yīng)效率，可采取方法增加限制性核酸內(nèi)切酶用量，平均每微克底物DNA可高達(dá)10個活性單位甚至更多些。擴大酶催化反應(yīng)體積，使?jié)撛谝种圃虮粚?yīng)稀釋。延長酶催化反應(yīng)保溫時間。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第82頁能否在一次反應(yīng)中用很多限制性內(nèi)切酶？能夠，普通而言，甘油濃度超出8%對酶切有抑制。有些酶在高甘油濃度中會產(chǎn)生星號活力。限制性內(nèi)切酶提供在50%甘油中，故10ul反應(yīng)體積中不應(yīng)加入超出1.6ul酶。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第83頁6.雙酶切：依據(jù)重組需要，有時需要用雙酶切（單酶切：因為只有一個酶切，載體片段很輕易相互粘連，形成空載體），這么重組效果會更加好。雙酶切時要先分析兩種酶且條件，依據(jù)兩種酶切緩沖液要求，有三種情況兼容性

處理完全兼容同時加2種酶進(jìn)行酶切完全不兼容先用一個酶切，沉淀洗鹽，再用另一個酶切相對兼容（其中一個酶活性相對較低）同時加2種酶進(jìn)行酶切只是鹽離子濃度不一樣先用低離子要求酶切，再補加酶和鹽。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第84頁7.載體酶切：酶切條件與外源DNA沒有區(qū)分。載體多位環(huán)狀DNA,假如只有一個酶切位點，用單酶切。當(dāng)前商業(yè)化載體都有多克隆位點，含有多個酶切位點，能夠進(jìn)行各種選擇和取舍。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第85頁酶切產(chǎn)物回收離心柱回收純化酶切產(chǎn)物DNA片段純化問題：純化PCR產(chǎn)物割膠還是柱式，推薦柱式，因為割膠手法不準(zhǔn)，很輕易割下大塊膠，影響純化效率?，F(xiàn)在柱式純化號稱能夠祛除引物，既然如此，酶切掉幾個堿基必定也會被純化掉了。所以，PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物純化均可應(yīng)用柱式純化。重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第86頁數(shù)據(jù)庫

限制性內(nèi)切酶數(shù)據(jù)庫/rebase

其中含有已知全部限制性內(nèi)切酶完整表，包含識別序列，甲基化敏感性，商業(yè)信息和參考文件。Company:TAKARAFermentas

重組質(zhì)粒構(gòu)建專題宣講第87頁連接酶（ligase)主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。催化相鄰DNA鏈5’-P和3’-OH末端以磷酸二酯鍵結(jié)合。E.coliDNA連接酶催化