微生物菌種保藏原理與方法

微生物菌種保藏原理與方法第1頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六菌種保藏基本原則保藏菌種時(shí)首先要選擇它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等，并創(chuàng)造一個(gè)低溫、干燥、缺氧、避光和缺少營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境條件，以利于休眠體能較長(zhǎng)時(shí)間維持其休眠狀態(tài)。對(duì)于不產(chǎn)孢子的微生物，也要使其新陳代謝處于最低水平，又不會(huì)死亡，從而達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。第2頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六常用菌種保藏方法1常用的簡(jiǎn)易保藏法：斜面?zhèn)鞔２胤?、半固體穿刺保藏法（適用于細(xì)菌和酵母菌）、石蠟油封法2甘油保藏法3干燥保藏法4真空冷凍干燥保藏法5液氮超低溫保藏法第3頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1簡(jiǎn)易保藏法基本原理：利用低溫來(lái)抑制微生物生命活動(dòng)。通常將在斜面或半固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好時(shí)培養(yǎng)物直接放到2~10℃冰箱中保藏，當(dāng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡后再重新移植到新的培養(yǎng)基上，故又稱(chēng)定期移植保藏法或傳代培養(yǎng)保藏法。第4頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1簡(jiǎn)易保藏法定期移植時(shí)間間隔：一般不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌約2周至1個(gè)月；放線菌、酵母菌和絲狀真菌4~6個(gè)月；石蠟油封法一般可保藏1年。優(yōu)缺點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，可隨時(shí)觀察菌種生長(zhǎng)狀況，但較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因經(jīng)常移植傳代，微生物物易發(fā)生變異。第5頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1.1斜面?zhèn)鞔２胤ㄙN標(biāo)簽：菌種菌株接種日期接種：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期成熟的孢子培養(yǎng)：細(xì)菌—37℃，18~24h酵母—28~30℃

，36~60h放線菌和絲狀真菌—28℃

，4~7d收藏：管口面塞用牛皮紙包扎，或用融化的固體石蠟封棉塞后置4冰箱保存。第6頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1.2半固體穿刺保藏法貼標(biāo)簽穿刺接種：將菌種直刺入直立柱中央培養(yǎng)：同傳代保藏法收藏：待菌長(zhǎng)好后，用浸有石蠟的無(wú)菌軟木塞或橡皮塞代替面塞并塞緊，置4℃冰箱中保藏，保藏0.5~1年。第7頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1.3石蠟油封法石蠟油滅菌：將石蠟油裝入三角瓶中，裝量不超過(guò)總體積的1/3，塞上面塞，外包牛皮紙，加壓蒸汽滅菌（121℃

，30min），連續(xù)滅菌2次。然后在40℃溫箱中放置2周或置105~110℃烘箱中烘2h，除去石蠟油中的水分。培養(yǎng)加石蠟油：以無(wú)菌吸管吸石蠟油加至菌種管中，加入量以高出斜面頂端或直立柱培養(yǎng)基表面約1cm為宜。收藏：面塞外包牛皮紙或用無(wú)菌橡皮塞，把菌種管直立放置于4℃冰箱中。放線菌、霉菌及產(chǎn)芽孢細(xì)菌一般可保2年，酵母菌及不產(chǎn)芽孢細(xì)菌可保1年。第8頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2甘油保藏法保護(hù)劑：40%左右的甘油機(jī)理：適當(dāng)濃度甘油中，少量甘油分子進(jìn)入細(xì)胞，使菌種細(xì)胞在冷凍過(guò)程中緩解了其由于強(qiáng)烈脫水及胞內(nèi)形成冰晶而引起的破壞。保藏溫度：-20℃左右或-70℃特點(diǎn):操作簡(jiǎn)單，保藏期長(zhǎng)，保存期間取樣測(cè)試方便，在基因工程中常用于保存含質(zhì)粒的菌株，一般可保3~5年。第9頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2甘油保藏法方法步驟：無(wú)菌甘油的制備：80%的甘油在121℃滅菌20min保藏培養(yǎng)物的制備：活化純化性能檢測(cè)制備菌種培養(yǎng)物保藏菌懸液的制備：液體法菌苔法-20℃保藏快速冷凍；乙醇-干冰液氮超低溫保藏：-70℃一般細(xì)菌、酵母保存期為3~5年。第10頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3干燥保藏法基本原理：將微生物賴(lài)以生存的水分蒸發(fā)掉，使細(xì)胞處于休眠和代謝停滯狀態(tài)，從而達(dá)到較長(zhǎng)期保藏的目的。低溫條件下，保藏期可達(dá)數(shù)年至十幾年之久。砂土管保藏法、明膠片保藏法、硅膠保藏法、麩皮保藏法第11頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六砂土管保藏法—產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌及形成孢子的霉菌和放線菌。方法：處理砂土裝沙土管制備菌液加孢子液干燥收藏恢復(fù)培養(yǎng)明膠片保藏法—細(xì)菌制備菌懸液制備菌液制備蠟紙加菌液干燥收藏恢復(fù)培養(yǎng)3干燥保藏法第12頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六硅膠保藏法—絲狀真菌。方法：制備硅膠制備菌液加菌液干燥收藏恢復(fù)培養(yǎng)麩皮保藏法—產(chǎn)孢子的絲狀真菌。制備麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種干燥收藏恢復(fù)培養(yǎng)3干燥保藏法第13頁(yè)，共15頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4冷凍真空干燥保藏法該法集中了菌種保藏中低溫、缺氧、干燥和添加保護(hù)劑等多種有利條件，是微生物代謝處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)。該法可同時(shí)用于細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌、（除少數(shù)不產(chǎn)孢子或只產(chǎn)生絲狀體真菌外）、酵母菌及病毒的保藏。該方法保藏菌種范圍廣