堿性磷酸酶的分離純化袁野

堿性磷酸酶的分離純化袁野第1頁(yè)/共29頁(yè)堿性磷酸酶(AKP)的分離純化第2頁(yè)/共29頁(yè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

從兔肝中提取堿性磷酸酶的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)同學(xué)綜合運(yùn)用有機(jī)溶劑沉淀、離心、分光等方法，從組織中分離純化及鑒定特定蛋白質(zhì)的技能。第3頁(yè)/共29頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理：采用有機(jī)溶劑分步沉淀法，從兔肝中提取堿性磷酸酶。

AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中則形成沉淀。通過(guò)離心可以使AKP和其他蛋白分離，從而得到純化。反復(fù)進(jìn)行純化的操作，可以獲得較高純度的AKP。第4頁(yè)/共29頁(yè)有機(jī)溶劑沉淀概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。原理：（1）降低了溶質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致沉淀。（2）由于有機(jī)溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，降低了親水性，導(dǎo)致脫水凝聚。第5頁(yè)/共29頁(yè)常用的有機(jī)溶劑沉析劑乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無(wú)毒常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣；特點(diǎn)：介電常數(shù)小:60%乙醇的介電常數(shù)是48

丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取第6頁(yè)/共29頁(yè)有機(jī)溶劑沉析的特點(diǎn)分辨率高；溶劑容易分離，并可回收使用；產(chǎn)品潔凈；容易使蛋白質(zhì)等生物大分子失活；應(yīng)注意在低溫下操作；第7頁(yè)/共29頁(yè)影響有機(jī)溶劑沉析的主要因素溫度：低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有利于提高收率（溶解度下降）；攪拌速度：散熱溶液pH值：原則是避免目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。（pI）離子強(qiáng)度:離子強(qiáng)度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L樣品濃度:0.5~2%

?。喝軇┯昧看?，回收率低，但共沉淀作用小 濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強(qiáng)，分辨率低金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+第8頁(yè)/共29頁(yè)1.稱取兔肝2g,剪碎后置于玻璃勻漿器中，加入0.01M的醋酸鎂及醋酸鈉混合液4ml,進(jìn)行勻漿。轉(zhuǎn)入離心管，并加2ml0.01M的醋酸鎂及醋酸鈉混合液清洗勻漿器，之后將之倒入離心管，與原來(lái)的勻漿液混合。記錄體積a，取0.1ml作為A液于EP管，待測(cè)比活性用。第9頁(yè)/共29頁(yè)在離心管中剩余的液體加入2ml正丁醇，玻璃棒攪拌2min，室溫放置30min，紗布過(guò)濾，置于離心管。濾液加入等體積的冷丙酮，邊倒邊搖，混勻后3000r/min5min。棄上清，沉淀用4ml0.5MMg(AC)2溶解。記錄體積b。取0.1ml作為B液于EP管，待測(cè)比活性用。第10頁(yè)/共29頁(yè)4.(1)于懸液中緩慢加入冷95%乙醇使其終體積為30%（0.46體積），混勻后2000r/min5min，轉(zhuǎn)移上清于另一離心管。(2)上清液中緩慢加入冷95%乙醇使其終體積為60%（0.85體積），混勻后3000r/min5min，棄上清，沉淀用4ml0.01MMg(AC)2、NaAC混合液攪拌混懸。第11頁(yè)/共29頁(yè)5.(1)于懸液中緩慢加入冷95%乙醇使其終體積為30%（0.46體積），混勻后2000r/min5min，轉(zhuǎn)移上清于離心管，棄沉淀。(2)上清液中緩慢加入冷95%乙醇使其終體積為60%（0.85體積），混勻后3000r/min5min，棄上清，沉淀用3ml0.5MMg(AC)2溶解,記錄體積c。取0.1ml作為C液于EP管,待測(cè)比活性用。第12頁(yè)/共29頁(yè)6.（1）其余懸液中緩慢加入冷丙酮，使得丙酮的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到33%（0.5體積），混勻后2000r/min離心5min，取上清（棄沉淀）（2）上清中緩慢加入冷丙酮，使丙酮終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%(0.34體積），混勻后3000r/min離心15min，棄上清（3）沉淀中加入Tris-醋酸鎂緩沖液5ml，即為純化酶液。作為D液用于比活性測(cè)定。第13頁(yè)/共29頁(yè)第14頁(yè)/共29頁(yè)用于活性測(cè)定：用Tris-Mg(AC)2緩沖液將

A液稀釋25倍、B液稀釋10倍、C液稀釋5倍，D液不稀釋。用于含量測(cè)定：用Tris-Mg(AC)2緩沖液將

A液稀釋50倍、B液稀釋20倍、C液稀釋5倍，D液不稀釋。第15頁(yè)/共29頁(yè)(二)堿性磷酸酶的活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理：

AKP是一種底物特異性較低，在堿性環(huán)境中能水解磷酸基團(tuán)。最適pH范圍為8.8~10,需要鎂離子作為激活劑。血清AKP主要來(lái)自肝，小部分來(lái)自骨骼。第16頁(yè)/共29頁(yè)

酶的活性通常是在一定條件下（最適溫度、最適的pH、必要的激動(dòng)劑等），一定的時(shí)間內(nèi)，測(cè)定該酶所催化的反應(yīng)系統(tǒng)中底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量來(lái)確定。第17頁(yè)/共29頁(yè)磷酸苯二鈉磷酸鹽+酚AKP酚+4-氨基安替比林紅色醌類衍生物鐵氰化鉀第18頁(yè)/共29頁(yè)管號(hào)空白標(biāo)準(zhǔn)ABCD酶液體0.10.10.10.1酚標(biāo)準(zhǔn)液0.1Tris-Mg(AC)20.1復(fù)合底物3.03.03.03.03.03.01.取試管6支編號(hào)（體積單位為ml）2.加入底物后,立即混勻,37℃準(zhǔn)確15min后加入0.5%鐵氰化鉀2.0ml終止反應(yīng),混勻,靜置15min,510nm比色（大比色杯）第19頁(yè)/共29頁(yè)AKP純化程度鑒定AKP純化程度用酶的比活性反映。酶的比活性是指單位濃度的酶蛋白樣品中的酶活性。第20頁(yè)/共29頁(yè)BCA法測(cè)定AKP蛋白濃度BCA(bicinchoninicacid,二喹啉甲酸)Protein+Cu2+OH-Cu+BCA試劑紫色復(fù)合物(三)堿性磷酸酶的蛋白含量測(cè)定第21頁(yè)/共29頁(yè)管號(hào)空白標(biāo)準(zhǔn)ABCD酶液體0.10.10.10.1蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.1Tris-Mg(AC)20.1BCA試劑

1.51.51.51.51.51.51.取試管6支編號(hào)（體積單位為ml）2.混勻后37℃水浴30min,562nm比色（小比色杯）第22頁(yè)/共29頁(yè)管號(hào)空白標(biāo)準(zhǔn)ABCD酶液體0.10.10.10.1酚標(biāo)準(zhǔn)液0.1Tris-Mg(AC)20.1復(fù)合底物3.03.03.03.03.03.0管號(hào)空白標(biāo)準(zhǔn)ABCD酶液體0.10.10.10.1蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.1Tris-Mg(AC)20.1BCA試劑

1.51.51.51.51.51.51.取試管6支編號(hào)（體積單位為ml）酶活性測(cè)定2.取試管6支編號(hào)（體積單位為ml）酶蛋白含量測(cè)定第23頁(yè)/共29頁(yè)管號(hào)空白標(biāo)準(zhǔn)ABCD酶液體0.10.10.10.1酚標(biāo)準(zhǔn)液0.1Tris-Mg(AC)20.1復(fù)合底物3.03.03.03.03.03.01.取試管6支編號(hào)（體積單位為ml）2.加入底物后,立即混勻,37℃準(zhǔn)確15min后加入0.5%鐵氰化鉀2.0ml終止反應(yīng),混勻,靜置15min,510nm比色（大比色杯）第24頁(yè)/共29頁(yè)722S型分光光度計(jì)使用方法開機(jī)預(yù)熱15min以上（打開蓋預(yù)熱）。轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕，選用所需的波長(zhǎng)。將裝有空白、標(biāo)準(zhǔn)、樣品的比色杯放入比色杯架，使空白管對(duì)準(zhǔn)光路。按MODE

鍵選擇trans模式。打開樣品室暗箱蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），按0%ADJ

鍵，即能自動(dòng)進(jìn)行機(jī)械零點(diǎn)的調(diào)整，數(shù)碼顯示為0.000。蓋好比色杯暗箱蓋（光門自動(dòng)開啟），按100%ADJ

鍵，即能自動(dòng)進(jìn)行空白零點(diǎn)的調(diào)整，數(shù)碼顯示為100.0。（一次如有誤差可再按一次）按MODE

鍵選擇吸光度測(cè)定模式（ABS燈亮），數(shù)碼顯示自動(dòng)轉(zhuǎn)換為吸光度值0.000。拉動(dòng)比色杯架的拉桿，使測(cè)定杯進(jìn)入光路，從數(shù)碼顯示上即可讀出樣品的吸光度比色完畢后，關(guān)上電源開關(guān)，取出比色杯，將比色杯暗箱蓋好，清洗比色杯并晾干。第25頁(yè)/共29頁(yè)分光光度計(jì)必須放置在固定而且不受振動(dòng)的儀器臺(tái)上，不能隨意搬動(dòng)，嚴(yán)防振動(dòng)，潮濕和強(qiáng)光直射。分光光度計(jì)內(nèi)放有硅膠干燥袋，需定期更換。開機(jī)預(yù)熱15分鐘，待儀器穩(wěn)定以后再開始進(jìn)行測(cè)定。每年需定期進(jìn)行波長(zhǎng)校準(zhǔn)。必須保證測(cè)試樣品為澄清的溶液，肉眼看不出來(lái)的輕微濁度也能引起讀數(shù)的嚴(yán)重誤差，必要時(shí)可通過(guò)離心來(lái)去除微粒。檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)液的光吸收時(shí)例外。從冰箱中取出的樣品一定要恢復(fù)到室溫后再進(jìn)行檢測(cè)，否則低溫會(huì)使水蒸汽在比色皿表面凝結(jié)，引起讀數(shù)持續(xù)漂移上升。使用分光光度計(jì)的注意事項(xiàng)第26頁(yè)/共29頁(yè)比色杯盛液量以達(dá)到杯容積2/3左右為宜。比色杯的外表面，則必須先用濾紙吸干，再用擦鏡紙或綢布擦凈，然后才能把比色杯放入比色杯槽內(nèi)。移動(dòng)比色杯槽要輕，以防溶液濺出，腐蝕機(jī)件。不可用手拿比色杯的光學(xué)面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光學(xué)面。用完比色杯后應(yīng)立即用自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水洗凈，也可用甲醇沖洗。洗滌后應(yīng)把比色杯倒置晾干或用濾紙條將水吸去，再用擦鏡紙輕輕揩干。一定要保證比色皿正確放入光路后再進(jìn)行測(cè)量。一般