單克隆抗體的制備

單克隆抗體的制備原理骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；而抗原免疫的B淋巴細胞能產生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞，繼承了兩個親代細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無限制增殖的特性，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗體的能力。經在HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)下，未融合的B細胞核骨髓瘤細胞不能存活。只有融合的細胞可以存活和增殖。經過克隆選擇，可篩選出能產生特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，在體內或體外培養(yǎng)，即可無限制地大量制備單克隆抗體。制備流程1、抗原制備及免疫程序可溶性抗原（蛋白質）以lmg/m1?5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點小鼠皮下注射，總量為0.3m1?0.6m1,間隔3?5周再同樣注射一次,l0天后，斷尾取血一滴，測抗體效價，選滴度高的小鼠做融合試驗。一個月后可以經靜脈（尾靜脈）給予無佐劑抗原0.2m1?0.4m1，3?4天后，殺死小鼠取脾做融合用。顆粒性抗原如抗原來源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以1%濃度每只皮下注射0.2ml，每周2次，共免疫5?8次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人認為最后一次免疫劑量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫動物以小白鼠為好。就品系而言以Balb/c小白鼠應用最廣，因為所有的小白鼠骨髓瘤系均從Balb/c小白鼠系誘導出來。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以8~12周齡為宜。免疫程序、劑量和方法是關系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關鍵之一。一般認為加強免疫后的第三天應殺鼠取脾做細胞融合。2、飼養(yǎng)細胞和免疫脾細胞制備（1）飼養(yǎng)細胞：常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞。飼養(yǎng)細胞的量為一般為2x104或105細胞/孔。腹腔滲出細胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細胞，另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細胞和細胞碎片，為融合細胞的生長造成良好的環(huán)境。腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同系鼠。（2）制備免疫脾細胞最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次脾臟研碎，過細胞篩離心，細胞用培養(yǎng)液洗2次計數(shù)取108脾淋巴細胞懸液備用骨髓瘤細胞株可直接從相關單位引進。由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要胰酶處理。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前，可將培養(yǎng)基內加入15ixg/ml8—氮鳥嘌吟。取約1X107?6X107對數(shù)生長期（即培養(yǎng)15h?20h）的骨髓瘤細胞，在室溫離心（400g）10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再懸浮并計數(shù)。3細胞融合將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。90s內加入37°C預溫的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37C水浴作用90s。加37C預溫的無血清培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。離心，500rpm,5min。充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細胞，加到已有飼養(yǎng)細胞層的兩個24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5毫升。一般一個免疫脾臟可接種2塊24孔板。⑦將培養(yǎng)板置37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4雜交瘤細胞株的選擇每2—3天換一次HAT培養(yǎng)液，連續(xù)2周觀察雜交瘤細胞是否出現(xiàn)。2周后使用HT培養(yǎng)基。在用HAT選擇培養(yǎng)1?2天內，將有大量瘤細胞死亡，3?4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7?10天后應換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2?3天換一半培養(yǎng)液檢測抗體的方法應根據(jù)抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。雜交瘤細胞的大量繁殖克隆化的細胞可以在體外進行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細胞具有從親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細胞就開始無限地繁殖，直至宿主死亡。產生腫瘤細胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價往往高于培養(yǎng)細胞上清液的100~1000倍。利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細胞血清等，可以加速和促進腫瘤的生長?？寺』姆椒ê芏啵畛Ｓ玫氖怯邢尴♂尫?．有限稀釋法克?。?） 克隆前1天制備飼養(yǎng)細胞層（同細胞融合）。（2） 將要克隆的雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內輕輕吹干，計數(shù)。（3） 調整細胞為3?10個細胞/ml。（4） 取頭天準備的飼養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細胞100”。孵育于37°C、5%CO2孵箱中。（5） 在第7天換液，以后每2?3天換液1次。（6） 8?9天可見細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。（7） 將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養(yǎng)。（8）每個克隆應盡快凍存。（五）雜交瘤細胞的凍存與復蘇1．雜交瘤細胞的凍存細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0°c后放入-70C超低溫冰箱，次日轉入液氮中。2.細胞復蘇方法將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37C水浴中，在lmin內使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶內，置37°C、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。（六）單克隆抗體的大量生產大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：（1） 體外使用旋轉培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養(yǎng)液內抗體含量為10?60“g/m如,果大量生產，費用較高。（2） 體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1?3x107/ml接種于小鼠背部皮下,每處注射0.2m1,共2