大學生創(chuàng)新訓練計劃項目-大學生創(chuàng)新訓練智能管理系統(tǒng)

大學生創(chuàng)新訓練計劃項目

項目研究成果概述項目名稱松材線蟲對不同松樹寄主的適生性變化研究項目類型指導項目資助經(jīng)費元項目負責人吳思穎指導教師應晨希所在學院林學院專業(yè)森林保護項目團隊成員陸柯言、劉彥彤、黃一萍、伏鼎一、研究內(nèi)容、目的為研究松材線蟲對不同松樹寄主的適應性的影響，本試驗選取不同致病力的松材線蟲蟲株，通過多次接種松材線蟲至不同抗性松樹體內(nèi)，測定松樹對松材線蟲種群繁殖及其致病力的影響。結(jié)果表明，松材線蟲在抗性松樹體內(nèi)和易感松樹體內(nèi)的不斷擴繁均會使得其種群致病力提高；松材線蟲種群性比的穩(wěn)定及種群的致病力與種群對寄主的適應性有關(guān)。二、研究方法、過程、結(jié)果1供.試松材線蟲蟲株選擇前期經(jīng)對2年生黑松進行致病性測定試驗而獲得的2株分別具強、弱致病力的松材線蟲蟲株，采用單異活體培養(yǎng)法在灰葡萄孢（Botrytiscinerea）上25℃繼代培養(yǎng)并保存?zhèn)溆?。供試蟲株的來源與寄主見表1。表1供試松材線蟲的寄主、來源和致病力Tab.1Thehost,sourceandpathogenicityofthetestB.xylophilus松材線蟲對2年生黑松致病力Pathogenicity編號NO.寄主Host來源SourceZJ馬尾松(Pinusmassoniana)浙江省富陽市病死木樣強YW4思茅松(Pinuskesiyalangbianensis)云南省德宏市病死木樣弱供試寄主松樹選取年生的易感寄主黑松（ b中抗寄主火炬松（ ）和來自于由江蘇林科院篩選獲得的高抗寄主馬尾松（ ）用于試驗。其中，黑松和火炬松購于安徽全椒林場，抗性馬尾松由江蘇省林科院提供。在試驗期間置于溫室內(nèi)定期澆水，統(tǒng)一管理。.線蟲接種液的制備將單異活體培養(yǎng)的供試線蟲采用貝爾曼漏斗法分離。將線蟲收集在 的離心管中，分別用硫酸鏈霉素洗滌3次、無菌水洗滌1次進行表面消毒。為方便計數(shù)，先根據(jù)肉眼觀察，粗略調(diào)出一個合適的濃度，定下體積，然后用微量進樣器吸取充分混勻的線蟲懸浮液0滴成數(shù)滴在潔凈的載玻片上，置于體視顯微鏡（， ）低倍鏡下觀察計數(shù)。重復次，取平均值換算線蟲濃度及總數(shù)。.松材線蟲對不同松樹寄主的致病性測定試驗從6月上旬至11月上旬進行，采用人工皮接法使松材線蟲進入不同松樹寄主體內(nèi)。具體方法為，用消毒的鋒利解剖刀在松苗莖干中下部位置由上往下割開樹皮，深入木質(zhì)部，但不超過松苗直徑的1/。3掀開樹皮，塞入合適大小的棉球，然后用透明膠布將樹皮和棉球包裹好，最后用微量進樣器注入線蟲的懸浮液。接種蟲量為 條株松苗，每種松樹苗木重復次，對照接入無菌水。在接種后第、和觀察記錄松苗的發(fā)病率和感病指數(shù)。發(fā)病率和感病指數(shù)計算參考 中方法。、.不同松樹體內(nèi)松材線蟲寄生適應性測定采用 提出的相關(guān)寄生適應性（ b ）系數(shù)分析不同致病力的松材線蟲在種不同抗性寄主體內(nèi)的定殖、擴張情況。 系數(shù)的計算公式為：接種后松苗死亡率X每棵死亡松苗分離線蟲平均數(shù) 。3種不同抗性的松樹和2種不同致病力的松材線蟲共組成6組接種處理，當任一處理中松苗出現(xiàn)全部死亡時，即將所有供試松苗連根取回，去掉針葉，將枝干洗凈后用鋒利的解剖刀切成細條，貝爾曼法分離線蟲，后收集，分別統(tǒng)計種松樹體內(nèi)松材線蟲總量、雌雄蟲性比。以統(tǒng)計結(jié)果中最少的線蟲群體數(shù)量為標準，將各個處理所得線蟲接入灰葡萄孢擴繁，放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)、培養(yǎng)后再次按方法接入原寄主松樹內(nèi)，重復上述步驟共次。這期間原強毒蟲株和弱毒蟲株在灰葡萄孢上繼代培養(yǎng)以作未接種松樹的對照。6.不同松樹體內(nèi)松材線蟲分泌的纖維素酶活性測定6.供1試線蟲和線蟲胞外纖維素酶的提取測定不同抗性寄主松樹上分離所得的松材線蟲種群分泌的纖維素活力，方法參考文獻［9稍］作修改，將線蟲收集后調(diào)整濃度為X,L后收集上清液，期間不時震蕩搖動，置于℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.葡2萄糖標準曲線的繪制取 i加 去離子水使之懸浮，邊混合邊慢慢加入氫氧化鈉溶液每去離子水中含 氫氧化鈉。將該懸浮液置于0水浴中溫熱至澄清，不斷混合下緩緩，加入酒石酸甲鈉至溶液中，用去離子水稀釋至 ，貯存于棕色瓶中。取 的葡萄糖溶液分別加入 號管中，每管用去離子水補足體積為 ，然后加 溶液，沸水浴 ，補足體積為 ，以號管為空白對照，采用紫外分光光度計（ ， ）測定 吸光度將測定得值輸 ，求得標準曲線方程及值。6.纖3維素酶活性的測定TOC\o"1-5"\h\z用法測定。反應系統(tǒng)為 的羧甲基纖維素鈉（M國藥集團上海）的醋酸鈉緩沖液， 酶液，經(jīng)C反應，加溶液，置沸水浴 ，冷卻后加入去離子水使得總體積為 ，在處比色。以每分鐘每毫升酶液產(chǎn)生1微克葡萄糖的量作為1個活性單位，將測的葡萄糖含量值代入下式，求得纖維素酶活性值。 XX7.不同抗性松樹上松材線蟲的致病力變化測定將經(jīng)過3次接種不同抗性松樹上分離的松材線蟲進行致病力測定，選取2年生黑松苗為接種對象，接種量為300條0/株，每個種群接種8株，接種后每5天觀察并記錄松樹發(fā)病情況，以持續(xù)在灰葡萄孢上繼代培養(yǎng)的強、弱毒蟲株作為對照。8.數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析采用 統(tǒng)計軟件進行處理。采用 多重比較法檢驗各處理的差異顯著性，顯著性檢驗水平為 。三、討論（結(jié)論）松材線蟲通過不斷侵染松樹，在寄主松樹體內(nèi)的種群性比會不斷上升并趨于穩(wěn)定，線蟲種群持續(xù)增殖，種群數(shù)量擴增，分泌的纖維素酶活力增強，可以使得線蟲更好的獲得寄主體內(nèi)營養(yǎng)，從而表現(xiàn)出對寄主適生性和致病力的提高。在自然環(huán)境中，松材線蟲的寄主發(fā)生轉(zhuǎn)換的可能是存在的，當線蟲從易感寄主轉(zhuǎn)換至高抗寄主體內(nèi)時，最初種群適應性不高，可能并不會對寄主產(chǎn)生嚴重影響，但如果這種情況持續(xù)發(fā)生，存活的線蟲種群的寄生適應性會不斷提高，