微生物學(xué)課件

第七章

微生物的遺傳和變異1掌握微生物遺傳、變異的物質(zhì)基礎(chǔ)掌握基因突變、基因重組的機(jī)制和方式熟悉菌種選育和保藏的基本理論、方法熟悉質(zhì)粒的基本特征及醫(yī)學(xué)上重要的質(zhì)粒本章要求2遺傳（heredity）—親代將遺傳信息傳遞給子代，使子代獲得與親代相似的性狀（形態(tài)、結(jié)構(gòu)、代謝、毒力等）變異（variation）—子代與親代相比，性狀發(fā)生改變遺傳是相對(duì)的，變異是絕對(duì)的—適應(yīng)新環(huán)境3第一節(jié)微生物的變異現(xiàn)象菌體形態(tài)、結(jié)構(gòu)變異毒力變異菌落形態(tài)變異酶活力的變異5菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)變異

青霉素、溶菌酶

正常形態(tài)細(xì)菌──────→L型變異

(部分或完全失去胞壁)

正常霍亂弧菌霍亂弧菌L型6毒力變異

β-溫和噬菌體

白喉棒狀桿菌────→獲得白喉毒素7菌落變異

光滑型菌落─────→粗糙型菌落

S

R

失去LPS的特異性多糖重復(fù)單位誘導(dǎo)酶的形成eg：與乳糖代謝有關(guān)的酶在陳舊培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)或在有免疫力的人體內(nèi)酶活力變異8轉(zhuǎn)化（transformation）實(shí)驗(yàn)

10活R菌加S菌的DNA加S菌的DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA及DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白質(zhì)加S菌的莢膜多糖長(zhǎng)出S菌只長(zhǎng)R菌證明轉(zhuǎn)化因子是DNA的細(xì)菌實(shí)驗(yàn)112、感染3、兩種沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，均可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體證明噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA（三）TMV病毒粒子的重建實(shí)驗(yàn)TMV：植物病毒，ssRNA32P－phageE.coli（正常培養(yǎng)基）離心沉淀中有放射性

35S－phageE.coli

E.coli

離心上清液中有放射性吸附使蛋白質(zhì)外殼與E.coli分離外殼吸附131、TMV因?yàn)镽NA是裸露的，所以感染頻率較低2、HRV霍氏車前花葉病毒花葉癥狀TMVTMVHRV花葉花葉HRVTMV拆開重建感染分離純化苯酚振蕩感染煙草分離純化所以，遺傳物質(zhì)是核酸，而非蛋白質(zhì)14二、微生物的遺傳物質(zhì)（一）真核微生物的遺傳物質(zhì)化學(xué)組成：線狀dsDNA和蛋白質(zhì)（sp：組蛋白）存在形式：染色質(zhì)（分裂間期）；染色體（分裂期）結(jié)構(gòu)單位：核小體（200bp的DNA和5種組蛋白組成）（二）原核生物的遺傳物質(zhì)細(xì)菌、放線菌

DNA實(shí)質(zhì)是一條雙鏈、高度折疊盤繞的大分子（三）病毒和噬菌體的遺傳物質(zhì)除朊病毒外，已知的均為裸露的DNA或RNA（ds、ss）15（三）醫(yī)學(xué)上重要的質(zhì)粒1、F因子（致育因子fertility)編碼細(xì)菌性菌毛，有F因子的為F＋菌株，可通過接合的方式轉(zhuǎn)移2、R質(zhì)粒（抗藥質(zhì)粒）編碼細(xì)菌對(duì)抗菌藥物或重金屬鹽類的耐藥性。分類：根據(jù)能否借接合而轉(zhuǎn)移分1）接合型耐藥質(zhì)?？顾帥Q定因子（r-det）：決定耐藥性，可同時(shí)攜帶多種抗藥基因抗藥轉(zhuǎn)移因子（RTF）：決定轉(zhuǎn)移性

2）非接合型耐藥質(zhì)粒（r因子）：只有抗藥決定因子（r-det）17耐藥機(jī)制：

1）產(chǎn)生頓挫酶破壞抗菌作用的酶eg：β－內(nèi)酰胺酶，可水解β－內(nèi)酰胺類抗生素的內(nèi)酰胺環(huán)—抗生素失活2）改變細(xì)胞膜通透性使藥物無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而無法發(fā)揮作用3）改變藥物的原始作用點(diǎn)eg：R因子使細(xì)菌核糖體30S亞基發(fā)生變化，鏈霉素不能與之結(jié)合，因此不能發(fā)揮抗菌作用3、Col質(zhì)粒編碼大腸菌素（colicin）的質(zhì)粒大腸菌素（colicin）:是一類可使沒有Col質(zhì)粒的而親緣關(guān)系密切的菌株死亡的蛋白質(zhì)4、V質(zhì)粒：編碼腸道細(xì)菌毒力18第三節(jié)基因突變一、基因突變的概念突變（mutation）：DNA結(jié)構(gòu)（種類、排列方式）的改變，導(dǎo)致其控制的性狀發(fā)生改變突變體（mutant）：具有突變型的細(xì)胞或個(gè)體二、基因突變的來源根據(jù)引起突變的原因分1、自發(fā)突變（sportaneousmutation）在外界自然條件下發(fā)生的DNA結(jié)構(gòu)改變。突變率：10-9～10-6包括基因突變：又稱為點(diǎn)突變，指DNA局部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變?nèi)旧w畸變：大段DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，常導(dǎo)致菌體死亡自發(fā)突變誘發(fā)突變19按誘變劑是直接還是間接引起置換，分別討論置換機(jī)制1、直接引起置換的誘變劑eg：亞硝酸、羥胺、烷化劑（部分可引起顛換）以亞硝酸為例說明誘變機(jī)制：亞硝酸可使堿基發(fā)生氧化脫氨作用，結(jié)果AH，CUH烯醇式：與C配對(duì)酮式：與T配對(duì)ATHNO2HT酮式ATHC烯醇式GCHT酮式212、間接引起置換的誘變劑（DNA復(fù)制時(shí)摻入）誘變劑均為堿基類似物eg：5－BU（5－溴尿嘧啶），5－AU（5－氨基尿嘧啶），8－NG（8－氮鳥嘌呤）等以5－BU為例：5－BU酮式：與A配對(duì)烯醇式：與G配對(duì)當(dāng)微生物培養(yǎng)液中含有5－BU時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有一部分新合成的DNA的T被5－BU取代AT5-BUA5-BU酮式ATG5-BU烯醇式GCA5-BU酮式堿基類似物只對(duì)正在進(jìn)行新陳代謝和繁殖著的微生物才有作用，而對(duì)靜止細(xì)胞、離體DNA沒有作用22（二）嵌合劑和移碼突變移碼突變（frame-shiftmutation）:指誘變劑使DNA分子中的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸插入或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯錯(cuò)誤的一類突變eg：丫啶類染料，包括丫啶橙、核黃素、丫啶黃、

α－氨基丫啶等23（三）輻射誘變

包括UV、X-射線、激光、離子束等1、UV的誘變機(jī)制條件：波長(zhǎng)254nm，強(qiáng)度15W，距離30cm左右，t不定（10s～2min）機(jī)制：形成胸腺嘧啶二聚體（TT）

UV的修復(fù)：1）光復(fù)活作用：T=TT+T2）SOS修復(fù)：應(yīng)急差錯(cuò)修復(fù)，使突變率增加

可見光光復(fù)活酶252、電離輻射的誘變作用X－射線、γ－射線

X－射線作用機(jī)制：1）直接作用：DNA雙螺旋氫鍵的斷裂，DNA單鏈的斷裂，DNA雙鏈之間的交聯(lián)等2）間接作用a：使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過氧化氫及自由基—誘變劑b：使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生堿基類似物—誘變劑3、激光誘變He-Ne激光26ConjugationTransformationTransduction29一、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于肺炎球菌中轉(zhuǎn)化（transformation）:受體細(xì)胞直接從周圍環(huán)境中吸收比較大的游離的DNA片段，并整合于受體細(xì)胞的基因組中從而使受體細(xì)胞獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)染（transfection）:若病毒或噬菌體的DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)的受體細(xì)胞，產(chǎn)生正常的子代病毒或噬菌體的轉(zhuǎn)化方式。30（一）轉(zhuǎn)化的前提條件1、感受態(tài)細(xì)胞并非所有的細(xì)胞都可以吸收DNA，只有在某一條件下培養(yǎng)的部分細(xì)胞才有吸收DNA的能力。將有這種能力的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。

感受態(tài)：能接受轉(zhuǎn)化作用的細(xì)胞的生理狀態(tài)感受態(tài)影響因素：菌種、培養(yǎng)時(shí)間、菌齡等。2、轉(zhuǎn)化DNA

dsDNA，分子量106～108道爾頓。31轉(zhuǎn)化過程32（二）自然轉(zhuǎn)化的過程與機(jī)制以肺炎球菌為例:1、轉(zhuǎn)化因子（dsDNA）的結(jié)合與吸收1）細(xì)胞表面的結(jié)合dsDNA與受體細(xì)胞表面相結(jié)合特點(diǎn)：特異性、不可逆性2）轉(zhuǎn)化因子的吸收降解產(chǎn)生能量協(xié)助把ssDNA推進(jìn)受體細(xì)胞。結(jié)合后的dsDNA107Dr片段ssDNA核酸內(nèi)切酶核酸外切酶332、轉(zhuǎn)化因子的整合

ssDNA以被保護(hù)的形式被轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞染色體同源區(qū)段，發(fā)生基因置換式重組。3、轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生途徑：1）通過錯(cuò)配修復(fù)，將不配對(duì)的受體菌堿基切除再經(jīng)修復(fù)合成后形成轉(zhuǎn)化子。若切除的是不配對(duì)的供體堿基則不產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子。2）雜合雙鏈分子直接發(fā)生染色體復(fù)制，再經(jīng)細(xì)胞分裂在部分子代細(xì)胞中出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。34Bacterialconjugation(mating)isaprocessofgenetictransferthatinvolvescell-to-cellcontact.接合（Conjugation）35二、接合（一）接合的概念

接合（conjugation）—在供體菌與受體菌直接接觸時(shí)，通過性菌毛的作用，遺傳物質(zhì)從供體菌轉(zhuǎn)移至受體菌內(nèi)的轉(zhuǎn)移方式。接合是原核微生物中應(yīng)用最廣泛的一種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移方式能發(fā)生結(jié)合作用的細(xì)菌多是G-。接合作用與供體菌中所含的接合因子有關(guān)。36以E.coli中F因子的接合作用為例說明：根據(jù)細(xì)胞中是否存在有F因子及其存在方式的不同，將E.coli分為四種菌株：

1、F＋菌株細(xì)胞內(nèi)有游離的F因子，控制性菌毛的生成及自身的接合轉(zhuǎn)移。

2、F－菌株細(xì)胞內(nèi)無F因子，表面沒有性菌毛。37383、Hfr（高頻重組）菌株

細(xì)胞內(nèi)F因子整合到宿主染色體上，隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，但仍有編碼性菌毛及接合轉(zhuǎn)移的能力。。4、F’菌株—攜帶F’因子的菌株

F’因子－帶有宿主染色體基因的特殊F因子。Hfr菌株中，F(xiàn)因子可以從染色體上切離下來，Hfr菌株變?yōu)镕＋菌株；當(dāng)不正常切離時(shí)，成為F’因子。39

F因子的存在方式及相互關(guān)系40

（二）接合的機(jī)制1、F＋與F－接合1）胞質(zhì)橋的形成

性菌毛連接細(xì)胞后，使細(xì)胞緊密接觸，接觸處形成胞質(zhì)橋—F因子的轉(zhuǎn)移通道2）DNA的轉(zhuǎn)移

ssDNA進(jìn)入受體細(xì)胞后，兩端相連形成環(huán)狀DNA分子，復(fù)制形成dsDNA分子—F因子，最終所以F＋X

F－2F＋。3）分離兩個(gè)F＋細(xì)胞的分離。41

F+×F－雜交42

2、Hfr與F－的接合過程同F(xiàn)＋與F－的接合遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移順序：

OriT-小段F因子-染色體-大段F因子全部染色體DNA轉(zhuǎn)入F－菌約需100min，該過程中易受環(huán)境影響而中斷，因此只有一小部分F因子轉(zhuǎn)移入F－中。3、F’與F－的接合過程同F(xiàn)＋與F－的接合，結(jié)果

F’F－2F’。X43Hfr菌株染色體基因轉(zhuǎn)移4445三、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將供體菌的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移入受體菌，通過基因重組而使受體菌獲得供體菌的部分遺傳性狀。轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）

通過轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得新的遺傳性狀的受體菌，所用噬菌體均為缺陷型噬菌體（包括溫和、烈性噬菌體）轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)完全轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)46通過完全缺陷的噬菌體將供體菌的任何DNA片段轉(zhuǎn)移至受體菌的現(xiàn)象分類：1、完全轉(zhuǎn)導(dǎo)（completetransduction）噬菌體：溫和或烈性噬菌體噬菌體的DNA裝配入衣殼中時(shí)，偶爾出現(xiàn)裝配錯(cuò)誤，裝入與噬菌體DNA大小相似的供體菌DNA片段，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。當(dāng)供體細(xì)胞裂解后，釋放出極少的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，感染其他受體菌后，通過交換重組，供體菌基因整合入受體菌基因組，形成重組子，即轉(zhuǎn)導(dǎo)子—遺傳性狀穩(wěn)定，是完全轉(zhuǎn)導(dǎo)（一）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generaltransduction）472、流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）

經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得供體菌DNA片段的受體菌，若外源DNA在細(xì)胞內(nèi)不能整合入受體基因組并復(fù)制，也不迅速消失，而僅能表達(dá)，該現(xiàn)象稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)

在選擇培養(yǎng)基上形成微小菌落48普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)49（二）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduction）噬菌體：溫和噬菌體

50theDNAoflambdaisinsertedintothehostDNAatthesiteadjacenttothegalactosegenesOninduction,Underrareconditions,thephagegenomeisexcisedincorrectly

AportionofhostDNAisexchangedforphageDNA,calledlambdadgal(dgalmeans"defectivegalactose“)PhagesynthesisiscompletedCelllysesandreleasesdefectivephagecapableoftransducinggalactosegenesSpecializedTransduction(λphage)51普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別區(qū)別要點(diǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生的時(shí)期裂解期溶原期轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳物質(zhì)供體菌染色體DNA任何部位或質(zhì)粒噬菌體DNA及供體菌DNA的特定部位轉(zhuǎn)導(dǎo)的后果完全轉(zhuǎn)導(dǎo)或流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌獲得供體菌DNA特定部位的遺傳特性轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率受體菌的10-7轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率較普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)增加1000倍(10-4)52（三）溶原性轉(zhuǎn)換溶原性轉(zhuǎn)換是當(dāng)噬菌體感染細(xì)菌時(shí)，宿主菌染色體中獲得了噬菌體的DNA片段，使其成為溶原狀態(tài)時(shí)而致細(xì)菌獲得新的性狀。白喉棒狀桿菌與轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別：噬菌體不攜帶外源基因噬菌體不是缺陷型的不形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子宿主獲得的形狀隨噬菌體的消失而消失53原生質(zhì)體融合（protopastfusion)原生質(zhì)體融合是將兩種不同的菌經(jīng)溶菌酶或青霉素等處理，失去細(xì)胞壁成為原生質(zhì)體后進(jìn)行彼此融合的過程。聚乙二醇可促使二種原生質(zhì)體的融合。原生質(zhì)體融合是一種人工基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，本質(zhì)上與基因轉(zhuǎn)移無關(guān)或關(guān)系很小。54原生質(zhì)體融合（protopastfusion)55第五節(jié)微生物遺傳學(xué)的應(yīng)用一、菌種選育指應(yīng)用微生物遺傳變異的理論，在微生物群體中選出所需性狀菌種的過程。目的：提高產(chǎn)量、改進(jìn)菌種質(zhì)量途徑：自然選育、誘變育種、雜交育種56（一）自然選育利用菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程eg：

1、從污染噬菌體的發(fā)酵液中分離抗噬菌體的菌株。

2、酒精工業(yè)中，從產(chǎn)黑色孢子的宇佐美曲霉3758號(hào)菌株分離到一株分生孢子為白色的糖化菌種，糖化力增強(qiáng)，培養(yǎng)條件更粗放。自發(fā)突變率低，一般10－9～10－6，正變率更低，所以獲得優(yōu)良菌種的可能性極低誘變育種（突變率提高10～上萬倍）。57正向變異：生產(chǎn)中菌種產(chǎn)量增加的變異負(fù)向變異：生產(chǎn)中菌種產(chǎn)量降低的變異（二）誘變育種

利用物理、化學(xué)或生物誘變劑，促使微生物發(fā)生突變，再采用一定的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合育種目的的突變株優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，突變率高，周期短缺點(diǎn)：缺少定向性（隨機(jī)性大）過程：出發(fā)菌株的制備，誘變處理，篩選目的菌株581、出發(fā)菌株的制備選優(yōu)良的出發(fā)菌株：要求：A、純種，單細(xì)胞或單孢子懸液B、對(duì)誘變劑敏感：一些菌發(fā)生某一變異后，會(huì)提高對(duì)其它誘變因素的敏感性C、具有優(yōu)良性狀避免長(zhǎng)出不純菌落分散態(tài)的細(xì)胞可均勻地接觸誘變劑生長(zhǎng)速度快營(yíng)養(yǎng)要求低產(chǎn)孢子早而多2、誘變處理選擇合適的誘變劑、合適的劑量、合適的中止方法（預(yù)實(shí)驗(yàn)）593、篩選突變株

基因突變的類型很多，誘變處理后，會(huì)出現(xiàn)各種突變株以營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選為例，說明篩選過程：1）所需培養(yǎng)基A、基本培養(yǎng)基（MM)－僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)需要的最低組合培養(yǎng)基不同的微生物MM不同，有的極復(fù)雜（如乳酸菌的培養(yǎng)基），有的極簡(jiǎn)單（如E.coli’sMM）。并非所有的基本培養(yǎng)基都不含有生長(zhǎng)因子。60B、完全培養(yǎng)基（CM）－可滿足各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基。一般是在MM中加入一些富含氨基酸、維生素和堿基之類的天然物質(zhì)（eg：蛋白胨、酵母膏等）配制而成C、補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）－在MM中加入某種微生物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株所不能合成的代謝物所配制的培養(yǎng)基612）與營(yíng)養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體A：野生型－從自然界中分離得到的發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株B：營(yíng)養(yǎng)缺陷型－野生型菌株誘變處理后，由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)的突變株C:原養(yǎng)型－營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株經(jīng)回復(fù)突變或重組后形成的菌株，其營(yíng)養(yǎng)要求在表型上與野生型相同623）篩選過程

誘變劑處理（同一般誘變方法）

淘汰野生型（處理后營(yíng)養(yǎng)缺陷型的比例一般較低，所以要淘汰野生型）方法：

抗生素法、菌絲過濾法631、抗生素法

a：青霉素法－適用于細(xì)菌

原理：青霉素能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，因此可殺死處于生長(zhǎng)繁殖期的細(xì)菌，而不能殺死靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)菌。

方法：將誘變后的細(xì)菌培養(yǎng)在含青霉素的MM中，殺死大部分生長(zhǎng)繁殖活躍的野生型菌株，從而達(dá)到“濃縮”營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞的目的。b：制霉菌素法－適用于真菌

原理：制霉菌素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可與真菌細(xì)胞膜上的甾醇作用，從而引起細(xì)胞膜的損傷。只能殺死生長(zhǎng)繁殖著的酵母菌或霉菌，所以可以達(dá)到淘汰野生型的目的。642、菌絲過濾法－適用于絲狀真菌或放線菌

原理：MM中野生型的孢子能發(fā)芽長(zhǎng)成菌絲，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型的孢子則不能。

方法：將誘變后的孢子在MM中培養(yǎng)一段時(shí)間后，再用擦鏡紙等合適濾紙過濾。重復(fù)數(shù)次后，可除去大部分野生型個(gè)體，達(dá)到“濃縮”的目的。65C：營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出多數(shù)營(yíng)養(yǎng)缺陷型在CM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，菌落形態(tài)和野生型沒有明顯區(qū)別，所以需要檢出。方法：在同一培養(yǎng)皿中檢出：夾層培養(yǎng)法，限量補(bǔ)充培養(yǎng)法在不同培養(yǎng)皿檢出：逐個(gè)檢出法，影印接種法66夾層培養(yǎng)法：培養(yǎng)皿中先倒一薄層無菌的MM培養(yǎng)基，冷凝后倒上一層混有經(jīng)誘變處理的菌液的培養(yǎng)基，其上再倒一薄層無菌的MM培養(yǎng)基，成為“三明治”狀。培養(yǎng)后，對(duì)首次出現(xiàn)的菌落作標(biāo)記；最后再在皿內(nèi)倒上一薄層第四層培養(yǎng)基－CM，再培養(yǎng)后出現(xiàn)的形態(tài)較小的新菌落，多數(shù)是營(yíng)養(yǎng)缺陷型。限量補(bǔ)充培養(yǎng)法：把誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量（0.01%以下）蛋白胨的MM上，野生型生長(zhǎng)快，菌落大，而缺陷型菌落小，若想得到某一特定缺陷型菌株，可直接在MM上加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。67逐個(gè)檢出法：將誘變后的細(xì)胞涂在CM培養(yǎng)基上，長(zhǎng)成單菌落后，用接種針或無菌牙簽把單菌落逐個(gè)依次點(diǎn)種于MM及CM培養(yǎng)基上。培養(yǎng)后，在CM某位置生長(zhǎng)而MM相應(yīng)位置上不生長(zhǎng)的是營(yíng)養(yǎng)缺陷型。影印法：將誘變后的細(xì)胞涂布于CM上，培養(yǎng)得到單菌落，用無菌影印裝置把此皿上的菌落轉(zhuǎn)印到另一MM上，培養(yǎng)后比較兩平板，CM上有而MM上沒有的即為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。68影印培養(yǎng)694）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定方法：生長(zhǎng)譜法（auxanography）步驟：a：菌懸液或單孢子懸液的制備把生長(zhǎng)在CM上的營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞或孢子用無菌水洗下，經(jīng)無菌水洗滌離心（除CM），制備成濃度為107～108個(gè)/ml的懸液b：制備混菌平板

取0.1ml與冷卻到50℃左右的MM混合均勻，倒于平皿中70c：分區(qū)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基凝固后，在皿背劃分為若干區(qū)域，在正面加微量的氨基酸、維生素、堿基等的粉末或結(jié)晶（也可用濾紙片法）d：檢出培養(yǎng)后，某一營(yíng)養(yǎng)物周圍有微生物的生長(zhǎng)圈，說明它是該營(yíng)養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型71雜交：細(xì)胞水平上的一種基因重組雜交育種：兩個(gè)不同基因型的菌株通過一定的方式使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選出具有新性狀的菌株育種方法如接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)（原核生物）；有性、準(zhǔn)性生殖（真核生物）；原生質(zhì)體融合等用途：1、改變菌株的遺傳物質(zhì)，獲得雜種菌株2、集中不同菌株的優(yōu)良性狀3、擴(kuò)大變異范圍，創(chuàng)造新品種（三）雜交育種72二、基因工程（geneengineering）

在誘變育種及分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)的一個(gè)人為控制的育種新領(lǐng)域。基因工程：在各種酶的作用下，將目的基因的DNA分子與載體DNA分子相連接，形成重組的DNA分子，以一定的方式導(dǎo)入原無該類分子的宿主細(xì)胞，并使宿主生物變?yōu)樽匀唤缭瓉頉]有并能連續(xù)傳代的新生物。工程菌：經(jīng)基因工程改造后的菌株7374（一）基因工程的基本操作1．分離目的基因的DNA片段。2．目的基因與有選擇標(biāo)記的載體形成重組分子。3．將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。4．篩選重組轉(zhuǎn)化子（抗性、酶切、雜交、PCR、測(cè)序）。75載體須具備的條件：有自主復(fù)制能力較高的復(fù)制率最好只有一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA