生物技術(shù)課件

生物技術(shù)課件第1頁/共23頁ContentsPCR的基本原理1PCR反應(yīng)五要素2PCR的步驟3PCR反應(yīng)特點(diǎn)

4PCR技術(shù)研究新進(jìn)展5PCR儀器的發(fā)展

6在獸醫(yī)分子生物技術(shù)中的應(yīng)用7第2頁/共23頁1.1PCR的基本原理聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR），又稱無細(xì)胞克隆技術(shù)(“freebacteria”cloningtechnique)，是一種對特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。第3頁/共23頁1.2PCR的基本原理變性退火延伸PCR的基本步驟第4頁/共23頁

2、PCR反應(yīng)五要素引物酶dNTP模板緩沖液即PCR反應(yīng)的五要素第5頁/共23頁3.PCR的步驟1DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

第6頁/共23頁4、PCR反應(yīng)特點(diǎn)PCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)

對標(biāo)本的純度要求低

靈敏度高

簡便、快速

第7頁/共23頁4.1特異性強(qiáng)

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②堿基配對原則；③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；④靶基因的特異性與保守性。第8頁/共23頁4.1特異性強(qiáng)其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。第9頁/共23頁4.2靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個細(xì)菌。第10頁/共23頁4.3簡便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。第11頁/共23頁4.4對標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。第12頁/共23頁5、PCR技術(shù)研究新進(jìn)展簡并PCR的原理基本原理就是根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)兩組帶有一定簡并性的引物庫，從不同生物物種中擴(kuò)增出未知核昔酸序列的基因。簡并PCR簡并PCR的應(yīng)用找到進(jìn)行PCR的基因序列，就會發(fā)現(xiàn)新基因?；虮磉_(dá)的檢測、病毒的檢測、基因組研究等。第13頁/共23頁6、PCR儀器的發(fā)展pcr溫度循環(huán)至關(guān)重要，pcr擴(kuò)增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確。自perkin–elmercetus公司第一臺pcr擴(kuò)增儀問世以來，現(xiàn)已有幾十家不同的廠家在國內(nèi)外生產(chǎn)和銷售pcr擴(kuò)增儀。在短短的幾年間，擴(kuò)增儀經(jīng)過幾代的發(fā)展，不斷采用新技術(shù)，并且進(jìn)一步朝方便、實(shí)用、高智能化和自動化的方向發(fā)展。第14頁/共23頁國內(nèi)外生產(chǎn)的幾種DNA擴(kuò)增儀儀器型號生產(chǎn)廠家型式特點(diǎn)管數(shù)報(bào)價1109型北京新技術(shù)所與軍科院聯(lián)合機(jī)械臂變溫水浴電子調(diào)溫40×0.5ml16400元/臺90A/B型中科院遺傳所機(jī)械臂變溫水浴電熱14000元/臺PTC-51A/B型軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院變溫氣流電子調(diào)兼作套式30×0.5ml12000元/臺DNAThermalCyclerPerkin–ElmerCetus(美)變溫鋁塊壓縮機(jī)致冷48×0.5mlUS$20000.-Thermocycler＃60＃00＃180B..Braun

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DM30000.-第15頁/共23頁7、原位PCR在獸醫(yī)生物技術(shù)中的應(yīng)用1.檢測病原體2、觀察病原體在體內(nèi)的分布規(guī)律3、檢測導(dǎo)入基因原位PCR在獸醫(yī)生物技術(shù)中的應(yīng)用第16頁/共23頁7.1檢測病原體與原位雜交相比,原位pcr先對待檢測片斷進(jìn)行擴(kuò)增,因而具有高度的敏感性,可檢出原位雜交檢不出的單拷貝、低拷貝（<20）基因?，F(xiàn)已被用于多種病原體，病毒如FMDV、IBDV等,細(xì)菌如結(jié)核桿菌等,最近用原位PCR檢測組織中寄生感染的文獻(xiàn)也有報(bào)道大大提高了這些病原體的檢出率.第17頁/共23頁7.2觀察病原體在體內(nèi)的分布規(guī)律原位PCR能在感染組織的細(xì)胞內(nèi)顯示特定病毒的DNA或RNA序列,為病毒的組織細(xì)胞定位;能將擴(kuò)增結(jié)果和細(xì)胞類型聯(lián)系,確定受感染細(xì)胞的類型,探明病原的分布規(guī)律;還能動態(tài)觀察具有感染性的細(xì)胞數(shù)量百分比,以此判斷病情,評價藥效

第18頁/共23頁7.3檢測導(dǎo)入基因原位PCR可用基因檢測的手段對外來基因進(jìn)行鑒定,并判斷基因?qū)胄颅h(huán)境后發(fā)生哪些變化,為臨床獸醫(yī)分子水平的研究和診斷提供有益的幫助,現(xiàn)已應(yīng)用于基因治療和轉(zhuǎn)基因動物等導(dǎo)入基因的檢測和觀察.第19頁/共23頁P(yáng)CR小結(jié)原位PCR作為形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)前沿交叉產(chǎn)物,可能為包括獸醫(yī)分子生物技術(shù)在內(nèi)的任何生物醫(yī)學(xué)學(xué)科所應(yīng)用,對學(xué)科前沿研究和和交叉學(xué)科發(fā)展起著不可估量的作用,如果能克服原位PCR中的一些技術(shù)難題,有望利用雙重或多重原位PCR技術(shù),在同一細(xì)胞或組織中研究兩種或兩種以上相關(guān)基因的相互關(guān)系,原位PCR技術(shù)將會有更廣闊的前景%隨著原位PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善,或許有一天它會真正走出研究實(shí)驗(yàn)室,成為臨床診斷實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)手段&邁向更廣闊的實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域.第20頁/共23頁參考文獻(xiàn)PCR技術(shù)詳解及分析鄧小紅任海芳重慶工商大學(xué)藥物