生物檢定法的學(xué)習(xí)課件

生物檢定法的學(xué)習(xí)課件第1頁(yè)/共29頁(yè)**生物檢定法定義：p103生物檢定屬生物法分析，是利用藥物對(duì)生物體（整體動(dòng)物、離體組織、微生物等）的作用以測(cè)定其效價(jià)或生物活性的一種方法。它以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，統(tǒng)計(jì)學(xué)為工具，選用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在一定條件下比較供試品和相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品所產(chǎn)生的特定反應(yīng)，通過(guò)等反應(yīng)劑量間比例的計(jì)算，從而測(cè)得供試品中活性成分的效價(jià)。第2頁(yè)/共29頁(yè)由于生物差異的存在，生物檢定結(jié)果誤差較大，重現(xiàn)性比較差，需要控制的條件較多

測(cè)定費(fèi)時(shí)、計(jì)算繁瑣。所以，生物檢定主要用于無(wú)適當(dāng)理化方法進(jìn)行檢定的藥物，補(bǔ)充理化檢驗(yàn)的不足。由于科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些品種的生物檢定可能被理化檢驗(yàn)代替，而一些新藥的生物檢定方法又在不斷建立。第3頁(yè)/共29頁(yè)生物檢定包括整體和離體測(cè)定整體測(cè)定：直接反映藥品對(duì)生物的綜合作用，但需要?jiǎng)游铩?/p>

需用供試品量多，耗時(shí)長(zhǎng)、精密度和靈敏度較差。離體測(cè)定：個(gè)體差異小，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，精密度和敏度較高，能在一定程度上保留藥理作用特性，尤其適用于微量激素的測(cè)定，缺點(diǎn)是不一定能反映供試品在整體的作用。第4頁(yè)/共29頁(yè)一、生物檢定的應(yīng)用范圍

1．藥物的效價(jià)測(cè)定

對(duì)一些理化方法不能測(cè)定含量或理化測(cè)定不能反映臨床生物活性的藥物，可用生物檢定來(lái)控制藥物質(zhì)量。例如洋地黃、胰島素、肝素、絨促性素、縮官素等的生物測(cè)定法，以

及多種抗生素的微生物測(cè)定法。有些天然藥物、生物制品往往因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且往往又是由結(jié)構(gòu)類(lèi)似、比例不定的多種成分組成，很難用理化方法反映其生物活性；另一些藥物，尤其是一些激素類(lèi)藥物，其結(jié)構(gòu)相近相近，而生物活性不同；還有些藥物雖可用理化方法測(cè)定含量，但含量完全不能反映效價(jià)。因此這些藥物的質(zhì)量控制都離不開(kāi)生物檢定。第5頁(yè)/共29頁(yè)2.體內(nèi)微量生理活性物質(zhì)的測(cè)定

一些神經(jīng)介質(zhì)、激素等微量生理活性物質(zhì)，由于其很強(qiáng)的生理活性，在體內(nèi)的濃度很低，加上體液中各種物質(zhì)的干擾，很難用理化方法測(cè)定，而不少活性物質(zhì)的生物鑒定法由于靈敏度高，專(zhuān)一性強(qiáng)，對(duì)供試品稍作處理即可直接測(cè)定。第6頁(yè)/共29頁(yè)3.中藥質(zhì)量的控制

中藥成分復(fù)雜，大部分中藥的有效成分尚未搞清，難以用理化方法加以控制，一部分中藥可用一些以其療效為基礎(chǔ)的生物測(cè)定方法來(lái)控制其質(zhì)量。第7頁(yè)/共29頁(yè)4、某些有害雜質(zhì)的限度檢查如農(nóng)藥殘留、熱原質(zhì)、抗生素及生化制劑中降壓物質(zhì)的限度檢查等。第8頁(yè)/共29頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)品

生物檢定法，一般需要應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品，以降低由于生物差異造成的實(shí)驗(yàn)誤差，使在不同實(shí)驗(yàn)室中檢定同一藥物時(shí)，即使實(shí)驗(yàn)條件或影響因素不盡相同，但由于同時(shí)作用于標(biāo)準(zhǔn)品和供式品，在比檢定中這些影響因素可以互相抵消，它們之間的反應(yīng)強(qiáng)度比例保持不變這樣就大大提高了生物檢定的可靠性和精密度。藥典所采用的標(biāo)準(zhǔn)品：為參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)品，由中國(guó)藥品與生物制品檢定所發(fā)放，單位效價(jià)相當(dāng)于國(guó)際單位效價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)品有均勻、穩(wěn)定而持久的性質(zhì)，應(yīng)存放于除去氧氣的干燥器中，低溫處避光貯放。第9頁(yè)/共29頁(yè)效價(jià)檢定的基本內(nèi)容

（一）生物反應(yīng)是生物檢定的基礎(chǔ)

被測(cè)物特有的生物學(xué)作用都可作為生物法分析的基礎(chǔ)，例如生長(zhǎng)素具有促進(jìn)生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)同化、脂肪動(dòng)員作用，可致糖尿、血酮，影響鹽類(lèi)代謝，已據(jù)之設(shè)計(jì)出多種的生長(zhǎng)素的生物學(xué)定量法（見(jiàn)書(shū)上表5-1）。第10頁(yè)/共29頁(yè)（二）劑量與反應(yīng)關(guān)系

生物檢定是利用藥物不同劑量引起生物體反應(yīng)程度的變化以進(jìn)行藥物效價(jià)測(cè)定的，要計(jì)算效價(jià)，首先要研究劑量與反應(yīng)之間的關(guān)系。

在生物檢定中，劑量與反應(yīng)間一般都是曲線關(guān)系，可通過(guò)各種坐標(biāo)轉(zhuǎn)換的方法，使劑量與反應(yīng)間呈直線關(guān)系，即數(shù)學(xué)表達(dá)式為簡(jiǎn)單的直線方程：y=a+bx，最便于處理和應(yīng)用。生物反應(yīng)基本上可分為以下兩種類(lèi)型，即質(zhì)反應(yīng)和量反應(yīng)。第11頁(yè)/共29頁(yè)*1．質(zhì)反應(yīng)

當(dāng)一定劑量的藥物注入動(dòng)物體內(nèi)后，觀察某一反應(yīng)或反應(yīng)的某一特定程度出現(xiàn)與否例如死或不死，驚厥或不驚厥，只有出現(xiàn)與不出現(xiàn)兩種情況，故不能用量來(lái)表示個(gè)體的反應(yīng)程度，只能用一組動(dòng)物中出現(xiàn)正（或負(fù)）反應(yīng)的百分率來(lái)表示，如死亡率、驚厥率，這類(lèi)稱(chēng)質(zhì)反應(yīng)。第12頁(yè)/共29頁(yè)在質(zhì)反應(yīng)中，將動(dòng)物分組，分別給以不同劑量，通過(guò)調(diào)節(jié)劑量，使最大劑量組接近但

不全部產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，最小劑量組接近但不全部產(chǎn)生陰性反應(yīng)，則各組陽(yáng)性反應(yīng)動(dòng)物的百分率隨劑量的增加而遞升，劑量與反應(yīng)率之間的關(guān)系是一條長(zhǎng)尾的“肩斜”形曲線，如

將劑量轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)，反應(yīng)率轉(zhuǎn)換為適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)后則呈直線關(guān)系，常見(jiàn)的轉(zhuǎn)換方法有概率單位logit、角度等。第13頁(yè)/共29頁(yè)*2．量反應(yīng)

藥物對(duì)生物體所引起的反應(yīng)隨著藥物劑量的增加產(chǎn)生的量變可以測(cè)量者，稱(chēng)為量反應(yīng)例如血壓的變化值，血糖濃度、組織器官重量的增減，抑菌圈直徑的大小等。時(shí)反應(yīng)雖有某些特殊性，但基本上仍可屬于量反應(yīng)，它是觀察某一反應(yīng)或反應(yīng)的某種程度出現(xiàn)所需的時(shí)間，例如血液的凝結(jié)時(shí)間、動(dòng)物生存時(shí)間等。第14頁(yè)/共29頁(yè)（三）對(duì)比檢定

生物檢定的目的是將供試品（T）和已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品(S)進(jìn)行效力對(duì)比，根據(jù)它們的反應(yīng)程度，求供試品的效力相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品效力的倍數(shù)，再?gòu)闹杏?jì)算出供試品的效價(jià)，因此它屬于對(duì)比檢定。第15頁(yè)/共29頁(yè)胰島素生物檢定法

胰島素是從哺乳動(dòng)物胰8的胰島口細(xì)胞中提取的一種蛋白類(lèi)激素，為六方系結(jié)晶，相對(duì)分子量6000，易溶于80%乙醇和酸性水溶液，在pH2.5的酸性溶液中比較穩(wěn)定。

*胰島素主要藥理作用是降低血糖，大劑量注入可引起驚厥、休克甚至死亡。第16頁(yè)/共29頁(yè)胰島素生物檢定法-具體方法本品效價(jià)測(cè)定采用生物檢定法，基于其有降低血糖的作用而采用小鼠血糖法、小鼠驚厥法、家兔血糖法。長(zhǎng)效制劑的延效作用只能用血糖法。第17頁(yè)/共29頁(yè)肝素生物檢定法

肝素系由健康牛、豬、羊等食用動(dòng)物的肺、肝、腸粘膜中提取的有延長(zhǎng)凝血時(shí)間作用的粘多糖類(lèi)物質(zhì)，為白色或淡黃色無(wú)晶形粉末，有吸濕性，在水中易溶。本品相對(duì)分子質(zhì)量及抗凝血效價(jià)隨動(dòng)物種屬和臟器來(lái)源不同而有差異，相對(duì)分子質(zhì)量為6000-20000，由肝肺提出的肝素，每mg不得低于110U，由腸粘膜提出的肝素，每mg不得低于140U。**本品在中性及微堿性中較穩(wěn)定。第18頁(yè)/共29頁(yè)肝素生物檢定法-具體方法肝素的生物檢定法是根據(jù)對(duì)數(shù)劑量與血凝時(shí)間的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系而設(shè)計(jì)的，常用的有兔全血法，硫酸鈉兔全血法，此外還有使用牛、羊血法測(cè)定肝素效價(jià)的方法。第19頁(yè)/共29頁(yè)抗生素的微生物檢定法

由于抗生素多為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多組分物質(zhì)，異構(gòu)體多，且不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生降解雜質(zhì)故各國(guó)藥典均以微生物檢定法為主要含量測(cè)定法。因?yàn)榭股厮幤返尼t(yī)療作用主要是它的抗菌活力，而微生物檢定法正是以抗生素的抗菌活力為指標(biāo)來(lái)衡量抗生素效價(jià)的一種方法。其測(cè)定原理與臨床要求相一致，能直接反映抗生素醫(yī)療價(jià)值，因此一直是各國(guó)藥典所采用的主要測(cè)定方法。

第20頁(yè)/共29頁(yè)微生物檢定法測(cè)定抗生素效價(jià)，一般可分為：稀釋法比濁法瓊脂擴(kuò)散法以瓊脂擴(kuò)散法應(yīng)用最為廣泛，為目前國(guó)際上測(cè)定抗生素效價(jià)的通用方法。第21頁(yè)/共29頁(yè)**瓊脂擴(kuò)散法-管碟法的原理

瓊脂擴(kuò)散法，亦稱(chēng)管碟法。系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，采用量反應(yīng)平行線原理的設(shè)計(jì)，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。第22頁(yè)/共29頁(yè)將不銹鋼小管安置在攤布特定試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基平板上，當(dāng)小管內(nèi)加入抗生素溶液后，抗生素分子就隨溶劑向培養(yǎng)基內(nèi)呈球形擴(kuò)散。同時(shí)將培養(yǎng)基平板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗(yàn)菌就開(kāi)始繁殖?？股胤肿釉诃傊囵B(yǎng)基中的濃度，隨離開(kāi)小管的距離增大而降低。當(dāng)抗生素分子擴(kuò)散到T時(shí)間，這時(shí)瓊脂培養(yǎng)基中抗生素的濃度恰高于該抗生素對(duì)試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度，試驗(yàn)菌的繁殖被抑制而呈現(xiàn)出透明的抑菌圈。在抑菌圈的邊緣處，瓊脂培養(yǎng)基

中所含抗生素的濃度即為該抗生素對(duì)試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度。將已知效價(jià)的抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液與未知效價(jià)的供試品溶液在同樣試驗(yàn)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，比較兩者抑菌圈的大小。第23頁(yè)/共29頁(yè)由于同質(zhì)的抗生素對(duì)特定試驗(yàn)菌所得的兩條劑量反應(yīng)曲線為平行直線，故可根據(jù)此原理，設(shè)計(jì)一劑量法、二劑量法及三劑量法（《中國(guó)藥典》只收載了二劑量法和三劑量法）等，從而可以較準(zhǔn)確地對(duì)比出供試品的效價(jià)。第24頁(yè)/共29頁(yè)**影響效價(jià)測(cè)定的因素1．試驗(yàn)菌種2．培養(yǎng)基3．雙碟的制備4．雙碟的培養(yǎng)溫度和時(shí)間第25頁(yè)/共29頁(yè)生物制品的效力檢定

生物制品的效力，從實(shí)驗(yàn)室檢定來(lái)講，一是指制品中有效成分的含量水平，二是指制制品在機(jī)體中建立自動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫后所引起的抗感染作用的能力。對(duì)于診斷用品，其效力則表現(xiàn)在診斷試驗(yàn)的特異性和敏感性。制品的質(zhì)量，主要是從效力上體現(xiàn)出來(lái)。無(wú)效的制品，不僅沒(méi)有使用價(jià)值，而且可能給防疫、治療或診斷工作帶來(lái)貽誤疫情或病情的嚴(yán)重后果。因此，必須十分重視制品的效力檢定，有的制品必要時(shí)還要進(jìn)行人體效果觀察。第26頁(yè)/共29頁(yè)效力檢定的方法有兩大類(lèi)：一是體外測(cè)定法；二是機(jī)體內(nèi)試