生物工藝的控制

生物工藝的控制第1頁(yè)/共83頁(yè)6.1發(fā)酵過(guò)程的操作類型第2頁(yè)/共83頁(yè)6.1.1分批發(fā)酵

是指在一個(gè)密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)，使微生物生長(zhǎng)繁殖，在特定的條件下只完成一個(gè)生長(zhǎng)周期的微生物培養(yǎng)方法。一次投料，一次接種，一次收獲間歇培養(yǎng)第3頁(yè)/共83頁(yè)分批發(fā)酵過(guò)程一般可粗分為四期，即適應(yīng)（停滯）期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)穩(wěn)定期和死亡期；也可細(xì)分為六期：即停滯期、加速期、對(duì)數(shù)期、減速期、靜止期和死亡期。第4頁(yè)/共83頁(yè)

一、初級(jí)代謝的代謝變化：

初級(jí)代謝是生命細(xì)胞在生命活動(dòng)過(guò)程中所進(jìn)行的代謝活動(dòng)，其產(chǎn)物為初級(jí)代謝產(chǎn)物。菌體的生長(zhǎng)過(guò)程顯示生長(zhǎng)史的特征。但在發(fā)酵過(guò)程中，即使是同一種菌體，由于菌體的生理狀態(tài)和培養(yǎng)條件的不同，各期的生長(zhǎng)長(zhǎng)短就有所不同。生產(chǎn)中要求在對(duì)數(shù)期接種原因就在此。

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初級(jí)代謝沒(méi)有明顯的產(chǎn)物形成期，產(chǎn)物隨著菌體生長(zhǎng)在不斷的進(jìn)行合成，有的與菌體的生長(zhǎng)呈平行關(guān)系。如乳酸、醋酸，與Ｑp頂峰幾乎在同一時(shí)期出現(xiàn)，而氨基酸、酶、核酸的發(fā)酵過(guò)程比前者復(fù)雜，它的與Ｑp的大小則隨培養(yǎng)基成分、碳源、溫度、菌株等不同而變化。第6頁(yè)/共83頁(yè)二、次級(jí)代謝產(chǎn)物變化

次級(jí)代謝產(chǎn)物包括大多數(shù)的抗生素、生物堿和微生物毒素等物質(zhì)。它們的發(fā)酵屬于生長(zhǎng)與產(chǎn)物非偶聯(lián)的類型，一般分為菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成和菌體自溶３個(gè)階段。

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菌體生長(zhǎng)階段：

接種后，菌體開(kāi)始生長(zhǎng)，直達(dá)到菌體的臨界濃度。同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行分解代謝，不斷的消耗，濃度明顯減少，溶氧濃度逐漸降低到一定的水平，其中某一參數(shù)可能成為菌體生長(zhǎng)的限制因素，使菌體生長(zhǎng)速度減慢，積累了相當(dāng)量的某些代謝中間體，原有的酶活力下降，出現(xiàn)了與次級(jí)代謝有關(guān)的酶，其酶解除了控制等原因，導(dǎo)致菌體的生理狀況發(fā)生改變，菌體就從生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)入產(chǎn)物合成階段。這一階段又稱為菌體的生長(zhǎng)期或發(fā)酵前期。第8頁(yè)/共83頁(yè)

產(chǎn)物合成階段：

產(chǎn)物數(shù)量逐漸增多，直至達(dá)到高峰，生產(chǎn)速率也達(dá)到最大，直至產(chǎn)物合成能力衰減。此階段，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，產(chǎn)物不斷被合成。環(huán)境因素很重要，發(fā)酵條件應(yīng)嚴(yán)格控制，方有利于產(chǎn)物合成。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)多，菌體就進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，抑制產(chǎn)物合成，使產(chǎn)物量降低；如果過(guò)少，菌體就衰老，產(chǎn)物合成能力就下降，產(chǎn)量減少。這一階段又稱為產(chǎn)物分泌期或發(fā)酵中期。

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菌體自溶階段：

菌體衰老，細(xì)胞開(kāi)始自溶，氨氮含量增加，pＨ上升，產(chǎn)物合成能力衰退，生產(chǎn)速率下降，此時(shí)應(yīng)必須結(jié)束發(fā)酵，否則，影響產(chǎn)品的提取。這一階段又稱為菌體的自溶期或發(fā)酵后期。第10頁(yè)/共83頁(yè)分批發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)：§操作簡(jiǎn)單、周期短§染菌的機(jī)會(huì)減少§生產(chǎn)過(guò)程、產(chǎn)品質(zhì)量易掌握§不適用于測(cè)定過(guò)程動(dòng)力學(xué)§對(duì)基質(zhì)濃度敏感的產(chǎn)物，用分批發(fā)酵不合適第11頁(yè)/共83頁(yè)6.1.2補(bǔ)料分批發(fā)酵一種介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的操作方式。在進(jìn)行分批培養(yǎng)的過(guò)程中，向反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)基的一種或多種成分，以達(dá)到延長(zhǎng)生產(chǎn)期和控制培養(yǎng)過(guò)程的目的。沒(méi)有輸出或間歇放掉部分發(fā)酵液（半連續(xù)發(fā)酵）第12頁(yè)/共83頁(yè)補(bǔ)料分批發(fā)酵與傳統(tǒng)分批發(fā)酵相比，其優(yōu)點(diǎn)在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度。低基質(zhì)濃度的優(yōu)點(diǎn)：1）可解除底物抑制，產(chǎn)物的反饋抑制和快速利用碳源的阻遏效應(yīng)，并維持適當(dāng)?shù)木w濃度，使不致于加劇供氧的矛盾；2）可降低培養(yǎng)基的黏度，并盡可能地延長(zhǎng)產(chǎn)物的形成時(shí)間。3）避免培養(yǎng)基積累有毒代謝物。與連續(xù)發(fā)酵相比，補(bǔ)料分批發(fā)酵不需要嚴(yán)格的無(wú)菌條件，也不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問(wèn)題。第13頁(yè)/共83頁(yè)半連續(xù)發(fā)酵的不足：1）放掉發(fā)酵液的同時(shí)也丟失了未利用的養(yǎng)分和處于生產(chǎn)旺盛期的菌體；2）定期補(bǔ)充和帶放使發(fā)酵液稀釋，送去提取的發(fā)酵液體積更大；3）發(fā)酵液被稀釋后可能產(chǎn)生更多的代謝有害物，最終限制發(fā)酵產(chǎn)物的合成；4）一些經(jīng)代謝產(chǎn)生的前體可能丟失；5）有利于非產(chǎn)生菌突變株的生長(zhǎng)第14頁(yè)/共83頁(yè)6.1.3連續(xù)發(fā)酵

連續(xù)培養(yǎng)或連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)添加新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的速度流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)液的液量維持恒定的微生物培養(yǎng)方式。第15頁(yè)/共83頁(yè)連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)：1）可提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量，節(jié)省發(fā)酵罐的非生產(chǎn)時(shí)間；2）便于自動(dòng)控制；3）增加了染菌機(jī)會(huì)：長(zhǎng)時(shí)間不斷地向發(fā)酵系統(tǒng)供給無(wú)菌空氣和培養(yǎng)基；4）菌種發(fā)生變異的可能性較大。第16頁(yè)/共83頁(yè)6.2發(fā)酵條件的影響及其控制

微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平取決于生產(chǎn)菌種的特性和發(fā)酵條件的控制。了解發(fā)酵工藝條件對(duì)過(guò)程的影響和掌握反映菌的生理代謝和發(fā)酵過(guò)程變化的規(guī)律，可以幫助人們有效地控制微生物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)。第17頁(yè)/共83頁(yè)常規(guī)的發(fā)酵條件：罐溫、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、空氣流量、罐壓、液位、補(bǔ)料、加糖、油或前體，通氨速率以及補(bǔ)水等。表征過(guò)程性質(zhì)的狀態(tài)參數(shù)：pH、溶氧（DO）、溶解CO2、氧化還原電位、尾氣O2和CO2

含量、基質(zhì)或產(chǎn)物濃度、代謝中間物或前體濃度、菌濃等。間接狀態(tài)參數(shù)：比生長(zhǎng)速率、攝氧率、釋放速率（CER）、呼吸商（RQ）、基質(zhì)消耗速率和產(chǎn)物合成速率等。第18頁(yè)/共83頁(yè)

基質(zhì)是產(chǎn)生菌代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，既涉及菌體的生長(zhǎng)繁殖，又涉及代謝產(chǎn)物的形成。6.2.1基質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵的影響及其補(bǔ)料控制第19頁(yè)/共83頁(yè)

在分批發(fā)酵中，當(dāng)基質(zhì)過(guò)量時(shí)，菌體的生長(zhǎng)速率與營(yíng)養(yǎng)成分的濃度無(wú)關(guān)。

μ：菌體的生長(zhǎng)比速Ks：半飽和常數(shù)

S：限制性基質(zhì)濃度μmax:最大比生長(zhǎng)速度

在Sks的情況下，比生長(zhǎng)速率與基質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。第20頁(yè)/共83頁(yè)

在S>10ks時(shí)，比生長(zhǎng)速率就接近最大值。所以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均存在一個(gè)上限濃度，在此濃度以內(nèi)，菌體的比生長(zhǎng)速率隨濃度增加而增加，但超過(guò)此限，濃度繼續(xù)增加，反而會(huì)引起生長(zhǎng)速率下降，這種效應(yīng)稱基質(zhì)的抑制作用。第21頁(yè)/共83頁(yè)

在正常的情況下，可達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率，然而，由于代謝產(chǎn)物及其基質(zhì)過(guò)濃，而導(dǎo)致抑制作用，出現(xiàn)比生長(zhǎng)速率下降的趨勢(shì)。

e.g.G100~150g/l，不出現(xiàn)抑制

G350~500g/l，多數(shù)微生物不能生長(zhǎng)，細(xì)胞脫水。

第22頁(yè)/共83頁(yè)

就產(chǎn)物的形成來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基過(guò)于豐富，有時(shí)會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)旺，黏度增大，傳質(zhì)差，菌體不得不花費(fèi)較多的能量來(lái)維持其生存環(huán)境，即用于非生產(chǎn)的能量大大增加，這對(duì)產(chǎn)物合成不利。第23頁(yè)/共83頁(yè)

（1）碳源的種類和濃度的影響和控制碳源分為迅速利用的碳源和緩慢利用的碳源。迅速利用的碳源能較迅速地參與代謝、合成菌體和產(chǎn)生能量，并分解產(chǎn)物（如丙酮酸），有利于菌體的生長(zhǎng)。但有的分解代謝產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用。

慢速利用的碳源為菌體緩慢利用，有利于延長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的合成（如抗生素），許多藥物發(fā)酵采用。例如乳糖、蔗糖、麥芽糖、玉米油分別是青霉素、頭孢菌素C、鹽霉素、核黃素及生物堿發(fā)酵的最適碳源。因此選擇最適碳源對(duì)提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是很重要的。

在工業(yè)上，發(fā)酵培養(yǎng)基中常采用迅速和緩慢利用的混合碳源，來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。第24頁(yè)/共83頁(yè)

碳源的濃度也對(duì)發(fā)酵有影響。由于過(guò)于豐富所引起的菌體異常繁殖，對(duì)菌體的代謝和產(chǎn)物合成和氧的傳遞會(huì)產(chǎn)生不良影響。若產(chǎn)生阻遏作用的碳源用量過(guò)大，則產(chǎn)物的合成會(huì)受到明顯的抑制。反之，僅僅供給維持量的碳源，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成就都停止。所以控制合適的碳源濃度是非常重要的。

控制碳源的濃度，可采用經(jīng)驗(yàn)法和動(dòng)力學(xué)法，即在發(fā)酵過(guò)程中采用中間補(bǔ)科的方法來(lái)控制。這要根據(jù)不同代謝類型來(lái)確定補(bǔ)糖時(shí)間、補(bǔ)糖量和補(bǔ)糖方法。動(dòng)力學(xué)方法是根根菌體的比生長(zhǎng)速率、糖比消耗速率及產(chǎn)物的比生成速率等動(dòng)力學(xué)參數(shù)來(lái)控制。

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2）氮源的種類和濃度的影響和控制氮源象碳源一樣,也有迅速利用的氮源和緩慢利用的氮源。

迅速利用的氮源有：氨基態(tài)氮的氨基酸、硫酸銨、玉米漿。慢速利用的氮源有：黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉等蛋白質(zhì)。

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快速利用氮源容易被菌體所利用，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但對(duì)某些代謝產(chǎn)物的合成，特別是某些抗生素的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，影響產(chǎn)量。如鏈霉菌的竹桃霉素發(fā)酵中，采用促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的銨鹽，能刺激菌絲生長(zhǎng)，但抗生素產(chǎn)量下降。

緩慢利用的氮源對(duì)延長(zhǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的分泌期，提高產(chǎn)物的產(chǎn)量是有好處的。但一次投入，也容易促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和養(yǎng)分過(guò)早耗盡，以致菌體過(guò)早衰老而自溶，從而縮短產(chǎn)物的分泌期，因而要選擇適當(dāng)?shù)牡春瓦m當(dāng)?shù)臐舛?。?7頁(yè)/共83頁(yè)

發(fā)酵培養(yǎng)基一般是選用含有快速和慢速利用的混合氮源。如氨基酸發(fā)酵用銨鹽和麩皮水解液、玉米漿；鏈霉素發(fā)酵采用硫酸銨和黃豆餅粉。但也有使用單一的銨鹽或有機(jī)氮源(如黃豆餅粉)。它們被利用的情況與快速和慢速利用的碳源情況相同。為了調(diào)節(jié)菌體生長(zhǎng)和防止菌體衰老自溶，生產(chǎn)中也要控制氮源的濃度，除了在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中控制氮源濃度外，在發(fā)酵過(guò)程中，補(bǔ)加氮源來(lái)控制濃度。第28頁(yè)/共83頁(yè)

（2）磷酸鹽濃度的影響和控制

磷是微生物生長(zhǎng)繁殖所必需的成分，也是合成代謝產(chǎn)物所必需的。微生物生長(zhǎng)良好所允許的磷酸鹽濃度為0.32-300mmol，但對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成良好所允許的最高平均濃度僅為1.0mmol，提高到10mmol，就明顯影響其合成。第29頁(yè)/共83頁(yè)

磷酸鹽濃度在初級(jí)代謝中的要求不如次級(jí)代謝嚴(yán)格。

對(duì)抗生素來(lái)說(shuō)，常常是采用生長(zhǎng)亞適量（對(duì)菌體生長(zhǎng)不是最適合但又不影響生長(zhǎng)的量）磷酸鹽濃度，其最適濃度取決于菌種特征、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基的組成和來(lái)源等因素。第30頁(yè)/共83頁(yè)6.2.2滅菌情況

一般隨滅菌溫度的升高，時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)養(yǎng)分的破壞作用越大，從而影響產(chǎn)物的合成。如葡萄糖氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌條件對(duì)產(chǎn)酶的影響：滅菌蒸汽壓力/(lb/in2)1015時(shí)間/min15251525葡萄糖氧化酶酶活/(U/mL)48.0843.7235.0427.10第31頁(yè)/共83頁(yè)6.2.3種子質(zhì)量§接種菌齡一般，接種菌齡以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期，即培養(yǎng)液中菌濃接近高峰時(shí)所需的時(shí)間較為適宜。最適的接種菌齡要經(jīng)多次試驗(yàn)，根據(jù)其最終發(fā)酵結(jié)果而定?！旖臃N量接種量的大小是由發(fā)酵罐中菌的生長(zhǎng)繁殖速度決定的。第32頁(yè)/共83頁(yè)

§菌體濃度菌體濃度簡(jiǎn)稱菌濃（cellconcentration）是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。菌濃的大小與菌體生長(zhǎng)速率有很大的關(guān)系，菌體生長(zhǎng)速率與微生物的種類及遺傳特性有關(guān)，不同種類的微生物的生長(zhǎng)速率是不一樣的，細(xì)胞越復(fù)雜，分裂所需的時(shí)間越長(zhǎng)。第33頁(yè)/共83頁(yè)

菌濃的大小對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物有很重要的影響。在適當(dāng)?shù)谋壬L(zhǎng)速率的條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與與菌濃成正比關(guān)系，即菌濃越大，產(chǎn)物的產(chǎn)量越大。但在好氧發(fā)酵中，菌濃太大，影響氧的傳遞，故在發(fā)酵中應(yīng)控制適當(dāng)?shù)木鷿?。?4頁(yè)/共83頁(yè)6.2.4溫度對(duì)發(fā)酵的影響和及其控制

微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成都是在各種酶催化下進(jìn)行的，溫度是保證酶活性的重要條件，因此在發(fā)酵系統(tǒng)中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。第35頁(yè)/共83頁(yè)(1)溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

大多數(shù)微生物在20-40℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。嗜冷菌在溫度低于20℃下生長(zhǎng)速率最大，嗜中溫菌在30-35℃左右生長(zhǎng)，嗜熱菌在50℃以上生長(zhǎng)。第36頁(yè)/共83頁(yè)(2)溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

溫度對(duì)青霉菌生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度和青霉素生產(chǎn)速率的影響如上圖所示。可以看出，溫度對(duì)參與生長(zhǎng)繁殖、呼吸和青霉素形成的各種酶的影響是不同的。第37頁(yè)/共83頁(yè)青霉菌：生長(zhǎng)E=34kJ/mol

呼吸E=71kJ/mol

產(chǎn)物合成E=112kJ/mol青霉素形成速率對(duì)溫度最為敏感，偏離最適溫度引起的生產(chǎn)率下降比其他兩個(gè)參數(shù)的變化更為嚴(yán)重。活化能E反映溫度變化對(duì)酶反應(yīng)速率的影響第38頁(yè)/共83頁(yè)(3)溫度對(duì)發(fā)酵液物理性質(zhì)的影響＃影響氧在發(fā)酵液中的溶解度

溫度溶氧＃影響基質(zhì)的分解速率

如菌體對(duì)硫酸鹽吸收在25℃時(shí)最小第39頁(yè)/共83頁(yè)(4)溫度對(duì)生物合成方向的影響金色鏈絲菌

研究發(fā)現(xiàn)，溫度與微生物的調(diào)節(jié)機(jī)制關(guān)系密切。例如，在20℃時(shí)，氨基酸末端產(chǎn)物對(duì)其合成途徑的第一個(gè)酶的反饋抑制作用，比在其正常生長(zhǎng)溫度37℃時(shí)更大。因此，考慮在抗生素發(fā)酵的后期降低溫度，加強(qiáng)氨基酸的反饋抑制作用，使蛋白質(zhì)和核酸的正常合成途徑關(guān)閉得早些，從而使發(fā)酵代謝轉(zhuǎn)向抗生素的合成。第40頁(yè)/共83頁(yè)（5）影響發(fā)酵溫度的因素發(fā)酵熱

發(fā)酵熱指的是發(fā)酵過(guò)程中釋放出來(lái)的凈熱量，以J/(m3·h)為單位表示。第41頁(yè)/共83頁(yè)

生物熱：生產(chǎn)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的熱叫生物熱。營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)被菌體分解產(chǎn)生大量的熱能，部分用于合成高能化合物ATP，供給合成代謝所需要的能量，多余的熱量則以熱能的形式釋放出來(lái)，形成生物熱。

攪拌熱：攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)引起的液體之間和液體與設(shè)備之間的摩擦所產(chǎn)生的熱能。Q攪拌P

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蒸發(fā)熱

：空氣進(jìn)入發(fā)酵罐與發(fā)酵液廣泛接觸后，進(jìn)行熱交換，必然引起水分的蒸發(fā)，被空氣和蒸發(fā)水分帶走的熱量。Q蒸發(fā)

=G（I出-I進(jìn)）

輻射熱：由于罐外壁和大氣間的溫度差異而使發(fā)酵液中的部分熱能通過(guò)罐體向大氣輻射的熱量。

顯熱：廢氣因溫度差異所帶走的熱量。

發(fā)酵熱在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中是隨時(shí)間變化的。所以，為使發(fā)酵在一定溫度下進(jìn)行，必須采取措施——在夾套或蛇管內(nèi)通入冷水加以控制（小型的發(fā)酵罐，在冬季和發(fā)酵初期，散熱量大于產(chǎn)熱量則需用熱水保溫。）第43頁(yè)/共83頁(yè)（6）最適溫度的選擇

所謂最適溫度是指在該溫度下最適于菌的生長(zhǎng)或產(chǎn)物的合成。對(duì)不同的菌種、不同的培養(yǎng)條件、不同的酶反應(yīng)以及不同的生長(zhǎng)階段，最適溫度有所不同。第44頁(yè)/共83頁(yè)

最適生長(zhǎng)溫度與最適生產(chǎn)溫度往往是不一致的。如乳酸發(fā)酵，乳鏈球菌最適生長(zhǎng)溫度是34C，而產(chǎn)酸最多的溫度是30C，但發(fā)酵速度最高的溫度達(dá)40C。青霉素產(chǎn)生菌的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，但產(chǎn)生青霉素的最適溫度是24.7℃。發(fā)酵溫度的確定，在理論上，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中不應(yīng)只選一個(gè)培養(yǎng)溫度，應(yīng)根據(jù)發(fā)酵的不同時(shí)期，選擇不同的培養(yǎng)溫度。生長(zhǎng)階段，選最適生長(zhǎng)溫度，在產(chǎn)物分泌階段，選最適生產(chǎn)生產(chǎn)溫度。即變溫控制。e.g青霉素變溫發(fā)酵起初5小時(shí)，維持在30C，以后降到25C培養(yǎng)5小時(shí)，再降到到20C培養(yǎng)28小時(shí)，最后又提高到25C，培養(yǎng)40小時(shí)，放罐。青霉素的產(chǎn)量比在25C恒溫發(fā)酵條件下提高14.7%?！镌诓煌陌l(fā)酵階段選擇不同的溫度第45頁(yè)/共83頁(yè)★考慮培養(yǎng)基成分和濃度

例如，在使用較稀薄或較易利用的培養(yǎng)基時(shí)，提高溫度則養(yǎng)分往往過(guò)早耗竭，導(dǎo)致菌絲過(guò)早自溶，產(chǎn)量降低?！飬⒖计渌l(fā)酵條件

例如，通氣條件較差的情況下，可以適當(dāng)降低溫度，一方面增加溶解氧濃度，另一方面降低菌體的生長(zhǎng)速率，以彌補(bǔ)因通氣不足而造成的代謝異常。第46頁(yè)/共83頁(yè)

發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)液的pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，是一項(xiàng)重要的發(fā)酵參數(shù)，它對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)品的積累有很大的影響。6.2.5pH對(duì)發(fā)酵的影響和及其控制第47頁(yè)/共83頁(yè)（1）pH對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響pH影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成：（1）影響酶的活性，當(dāng)pH值抑制菌體中某些酶的活性時(shí)，會(huì)阻礙菌體的新陳代謝；（2）菌體的形態(tài)：pH值還會(huì)影響某些霉菌的形態(tài)，如細(xì)胞壁厚度、菌絲直徑。（3）細(xì)胞膜的電荷狀態(tài)：引起膜滲透性的變化，從而影響菌對(duì)養(yǎng)分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌（4）產(chǎn)物的穩(wěn)定性（5）對(duì)某些生物合成途徑有顯著影響：pH值往往引起菌體代謝過(guò)程的不同，使代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和比例發(fā)生改變。第48頁(yè)/共83頁(yè)微生物生長(zhǎng)和生物合成的最適pH微生物生長(zhǎng)：細(xì)菌（6.3~7.5),霉菌和酵母菌（3~6),放線菌（7~8)

微生物生長(zhǎng)階段和產(chǎn)物合成階段的最適pH往往不一樣，這不僅與菌種的特性有關(guān)，也取決于產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)。第49頁(yè)/共83頁(yè)

e.g.Clostridiumacetobutylicumfenmentation:

pH在中性時(shí)，菌種生長(zhǎng)良好，但產(chǎn)物產(chǎn)量很低，實(shí)際發(fā)酵合適的pH值４～６。

Streptomycesgrisusfermentation生產(chǎn)鏈霉素（

streptomycin）:菌體生長(zhǎng)的合適pH

值為6.3~6.9，而合成鏈霉素的pH

值為6.7~7.3。因此，應(yīng)根據(jù)發(fā)酵過(guò)程的不同階段分別控制不同的pH

值。在生產(chǎn)過(guò)程中，及時(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)和控制合適的pH值，以滿足不同階段的需要。第50頁(yè)/共83頁(yè)

但同一產(chǎn)品的合適pH值，還因菌種、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件有關(guān)。在確定合適的pH值時(shí)，還要考慮培養(yǎng)溫度的影響，若溫度不同合適的pH值也可能發(fā)生變動(dòng)。第51頁(yè)/共83頁(yè)產(chǎn)品菌生長(zhǎng)最適pH范圍產(chǎn)物合成最適pH范圍青霉素6.5~7.26.2~6.8鏈霉素6.3~6.96.7~7.3四環(huán)素6.1~6.65.9~6.3土霉素6.0~6.65.8~6.1紅霉素6.6~7.06.8~7.3灰黃霉素6.4~7.06.2~6.5幾種抗生素發(fā)酵的最適pH范圍第52頁(yè)/共83頁(yè)（2）發(fā)酵過(guò)程中pH的變化

發(fā)酵過(guò)程中，由于菌種在一定溫度及通氣條件下對(duì)培養(yǎng)基中碳、氮源等的利用，隨著有機(jī)酸或氨基氮的積累，會(huì)使pH產(chǎn)生一定的變化。這種變化的根源是培養(yǎng)基的成分和微生物的代謝特性。第53頁(yè)/共83頁(yè)引起培養(yǎng)液的pH發(fā)生波動(dòng)的因素引起pH下降的因素：1）培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)，碳源過(guò)多，特別是葡萄糖過(guò)量，或者中間補(bǔ)糖過(guò)多加之溶解氧不足，致使有機(jī)酸大量積累2）消沫油加得過(guò)多3）生理酸性物質(zhì)的存在引起pH上升的因素：1）氮源過(guò)多2）生理堿性物質(zhì)存在3）中間補(bǔ)料中氨水或尿素等的堿性物質(zhì)加入過(guò)多第54頁(yè)/共83頁(yè)（3）最適pH的選擇和調(diào)節(jié)選擇最適pH的原則：既有利于菌體的生長(zhǎng)繁殖，又要最大限度地使產(chǎn)物合成獲得高的產(chǎn)量。第55頁(yè)/共83頁(yè)

在各種類型的發(fā)酵過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)所得的最適pH值與微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成中3個(gè)參數(shù)的相互關(guān)系有四種情況：①第一種情況是菌體的比生長(zhǎng)速率（μ）和產(chǎn)物比生產(chǎn)速率（Qp）的最適pH值都在一個(gè)相似的較寬的適宜范圍內(nèi)（a），這種發(fā)酵過(guò)程易于控制；②第二種情況是μ（或Qp

）的最適pH值范圍很窄，而Qp

（或μ）的范圍較寬（b）；③第三種情況是μ和Qp對(duì)pH值都很敏感，它們的最適pH值又是相同的（c），第二和第三模式的發(fā)酵pH值應(yīng)嚴(yán)格控制；④第四種情況更復(fù)雜，μ和Qp有各自的最適pH值(d),應(yīng)分別嚴(yán)格控制各自的最適pH值，才能優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程。第56頁(yè)/共83頁(yè)

合適的pＨ值是根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定。

將發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成不同的出發(fā)pH值，進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中，定時(shí)測(cè)定和調(diào)節(jié)pH，以分別維持出發(fā)pH值，或者利用緩沖液配制培養(yǎng)基以維持之。到時(shí)觀察菌體生長(zhǎng)的情況，以菌體生長(zhǎng)達(dá)到最高值的pH值為菌體生長(zhǎng)的最適pH值。以同樣的方法，可測(cè)得產(chǎn)物合成的合適PH值。第57頁(yè)/共83頁(yè)

考慮發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使之有適當(dāng)?shù)谋壤?，使發(fā)酵過(guò)程pH

的變化在適合的范圍內(nèi)。因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含有代謝產(chǎn)酸[如葡萄糖產(chǎn)生酮酸、(NH4)2SO4]和產(chǎn)堿

[如NaNO3、尿素]的物質(zhì)以及緩沖劑[如CaCO3]等成分，它們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中要影響pH的變化，特別是CaCO3能與酮酸等反應(yīng)，而起到緩沖作用，所以它的用量比較重要。在分批發(fā)酵中，常采用這種方法來(lái)控制pH的變化。控制pH的方法第58頁(yè)/共83頁(yè)

利用上述方法調(diào)節(jié)pH值的能力是有限的，如果達(dá)不到要求，可以用在發(fā)酵過(guò)程直接補(bǔ)加酸或堿和補(bǔ)枓的方式來(lái)控制，特別是補(bǔ)料的方式，效果比較明顯。過(guò)去是直接加入酸或堿來(lái)控制，但現(xiàn)在常用的是以生理酸性物質(zhì)(硫酸銨)和堿性物質(zhì)(氨水)來(lái)控制。它們不僅可以凋節(jié)pH值，還可以補(bǔ)充氮源。當(dāng)發(fā)酵的pH值和氨氮含量都低時(shí)，補(bǔ)加氨水，就可以達(dá)到調(diào)節(jié)pH

和補(bǔ)充氨氮的目的。反之，pH值較高，氨氮含量又低時(shí)，就補(bǔ)加硫酸銨。第59頁(yè)/共83頁(yè)

目前，已比較成功地采用補(bǔ)枓的方法來(lái)調(diào)節(jié)pH值，如氨基酸發(fā)酵采用流加尿素的方法，特別是次級(jí)代謝產(chǎn)物抗生素發(fā)酵，更常用此法。這種方法，既可以達(dá)到穩(wěn)定pH值的目的，又可以不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是能產(chǎn)生阻遏作用的物質(zhì)。少量多次補(bǔ)加還可解除對(duì)產(chǎn)物合成的阻遏作用，提高產(chǎn)物產(chǎn)量。也就是說(shuō)，采用補(bǔ)料的方法，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、延長(zhǎng)發(fā)酵周期、調(diào)節(jié)pH值和培養(yǎng)液的特性（如菌濃等）等幾個(gè)目的。最成功的例子就是青霉素的補(bǔ)枓工藝，利用控制葡萄糖的補(bǔ)加速率來(lái)控制pH值的變化范圍（現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化），其青霉素產(chǎn)量比用恒定的加糖速率和加酸或堿來(lái)控制pH值的產(chǎn)量高25%。第60頁(yè)/共83頁(yè)第61頁(yè)/共83頁(yè)

氧是一種難溶于水的氣體。在25℃，1×105Pa條件下，純氧在水中的溶解度為1.26mmol/L，空氣中的氧在純水中的溶解度更低（0.25mmol/L）。在28℃氧在在發(fā)酵液中的溶解度只有0.22mmol/L，而發(fā)酵液中的大量微生物耗氧迅速（耗氧速率大于25~100mmol/L.h），因此，供氧對(duì)于好氧微生物來(lái)說(shuō)是非常重要的。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即使發(fā)酵液被空氣飽和，若此時(shí)停止供氧，發(fā)酵液中溶氧可在幾分鐘之內(nèi)便耗盡。

在好氧深層培養(yǎng)中，氧氣的供應(yīng)往往是發(fā)酵能否成功的重要限制因素之一。6.2.6溶氧對(duì)發(fā)酵的影響和及其控制第62頁(yè)/共83頁(yè)

好氧微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)都需要消耗氧氣，它們只有在氧分子存在的情況下才能完成生物氧化作用。液體中的微生物只能利用溶解氧，氣液界面處的微生物還能利用氣相中的氧。強(qiáng)化氣液界面也將有利于供氧。在微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)保持供氧與耗氧的平衡，滿足微生物對(duì)氧的利用。第63頁(yè)/共83頁(yè)（1）臨界氧

發(fā)酵生產(chǎn)中用空氣飽和度百分?jǐn)?shù)來(lái)表示溶氧濃度。這只能在相似的條件下，在同樣的溫度、罐壓、通氣攪拌下進(jìn)行比較。這種方法能反映菌的生理代謝變化和對(duì)產(chǎn)物合成的影響。臨界氧：不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度，如對(duì)產(chǎn)物而言，便是不影響產(chǎn)物合成所允許的最低濃度。

第64頁(yè)/共83頁(yè)

當(dāng)不存在其他限制性基質(zhì)時(shí)，溶解氧濃度高于臨界值，細(xì)胞的比耗氧速率保持恒定；如果溶解氧濃度低于臨界值，細(xì)胞的比耗氧速率就會(huì)大大下降，或者是微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降，細(xì)胞處于半?yún)挌鉅顟B(tài)，代謝活動(dòng)受到阻礙。第65頁(yè)/共83頁(yè)★呼吸臨界氧值可用尾氣O2含量變化和通氣量測(cè)定，也可用溶氧電極測(cè)定。各種微生物的臨界氧值：

細(xì)菌和酵母：3~10%放線菌：5~30%霉菌：10~15%★合成的臨界氧值：考察不同溶氧濃度對(duì)生產(chǎn)的影響，便可求得合成的臨界氧值。注意：●實(shí)際上，呼吸臨界氧值不一定與產(chǎn)物合成臨界氧值相同。

●生物合成臨界氧濃度并不等于其最適氧濃度?！裨谂囵B(yǎng)過(guò)程中并不是維持溶氧越高越好。過(guò)高的溶氧對(duì)生長(zhǎng)可能不利。第66頁(yè)/共83頁(yè)（2）溶氧作為發(fā)酵異常的指標(biāo)

生長(zhǎng)過(guò)程從培養(yǎng)液中溶氧濃度的變化可以反映菌的生長(zhǎng)生理狀況。發(fā)酵溶氧變化異常，可及時(shí)預(yù)告生產(chǎn)可能出現(xiàn)的問(wèn)題。★操作故障或事故★中間補(bǔ)料是否得當(dāng)★污染雜菌：溶氧會(huì)反常地迅速（一般2~5h)跌到零，并長(zhǎng)時(shí)間不回升。這比無(wú)菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染菌要提前幾個(gè)小時(shí)。但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)染菌后溶氧反而升高的現(xiàn)象。第67頁(yè)/共83頁(yè)

微生物的“需氧”可用耗氧速率或呼吸強(qiáng)度來(lái)表示：

耗氧速率（oxygenuptakerate)：指單位體積的培養(yǎng)液在單位時(shí)間的耗氧量。單位為mmolO2/(L·

h)，用r表示

呼吸強(qiáng)度（respiratorystrength)：?jiǎn)挝毁|(zhì)量的細(xì)胞干重在單位時(shí)間的耗氧量。單位為mmolO2/(g·干細(xì)胞

·h)，用Ｑo2表示兩者的關(guān)系：（3）溶氧的控制需氧方面第68頁(yè)/共83頁(yè)式中，r——攝氧率，mmolO2/(L·h)；

QO2——呼吸強(qiáng)度，mmolO2/(g菌·h)；

X——菌濃，g/L。若發(fā)酵液中溶氧保持不變，即供氧=需氧，則使供需失去平衡的因子也會(huì)改變?nèi)苎鯘舛?。?9頁(yè)/共83頁(yè)

在發(fā)酵工業(yè)中，耗氧對(duì)于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成之間的關(guān)系有三種類型：１．產(chǎn)物生成期的耗氧與菌體生長(zhǎng)期的耗氧一致。２．產(chǎn)物生成期的耗氧超過(guò)菌體生長(zhǎng)期的耗氧量。３．產(chǎn)物生成期的最適耗氧量低于菌體生長(zhǎng)期的耗氧量。第70頁(yè)/共83頁(yè)項(xiàng)目工藝條件項(xiàng)目工藝條件菌種特性培養(yǎng)基的性能好氣程度菌齡、數(shù)量菌的聚集狀態(tài)，絮狀或小球狀基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成、配比物理性質(zhì)；粘度、表面張力等補(bǔ)料或加糖溫度溶氧與尾氣O2及CO2水平消泡劑或油表面活性劑配方、方式、次數(shù)和時(shí)機(jī)恒溫或階段變溫控制按生長(zhǎng)或產(chǎn)物合成的臨界值控制種類、數(shù)量、次數(shù)和時(shí)機(jī)種類、數(shù)量、次數(shù)和時(shí)機(jī)影響需氧的工藝條件第71頁(yè)/共83頁(yè)

在發(fā)酵過(guò)程中，影響耗氧的因素有以下幾方面：

１．培養(yǎng)基成分和補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分和濃度顯著影響耗氧；培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)豐富，菌體生長(zhǎng)快，耗氧量大；發(fā)酵濃度高，耗氧量大；發(fā)酵過(guò)程補(bǔ)料或補(bǔ)糖，微生物對(duì)氧的攝取量隨著增大。第72頁(yè)/共83頁(yè)

２．菌齡影響耗氧：呼吸旺盛，耗氧力強(qiáng)，發(fā)酵后期菌體處于衰老狀態(tài)，耗氧能力自然減弱。３．發(fā)酵條件影響耗氧：在最適條件下發(fā)酵，耗氧量大。發(fā)酵過(guò)程中，排除有毒代謝產(chǎn)物如二氧化碳、揮發(fā)性的有機(jī)酸和過(guò)量的氨，也有利于提高菌體的攝氧量。第73頁(yè)/共83頁(yè)式中，dc/dt——單位時(shí)間內(nèi)發(fā)酵液溶氧濃度的變化[mmol/(L·h)]KL——氧傳質(zhì)系數(shù)，m/h；

a——比表面積（m2/m3)c*——氧在水中的飽和濃度，mmol/L；

cL——發(fā)酵液中的溶氧濃度，mmol/L。在穩(wěn)定情況下，氧分子從氣體主體擴(kuò)散到液體主體的傳遞速率即氧的傳質(zhì)方程式為：（3）溶氧的控制凡是使KLa和c*增加的因素都能使發(fā)酵供氧改善。供氧方面第74頁(yè)/共83頁(yè)增加C*的辦法：★在通氣中摻入純氧，提高氧分壓；★提高罐壓第75頁(yè)/共83頁(yè)提高KLa(提高設(shè)備的供氧能力）的辦法：項(xiàng)目設(shè)備條件項(xiàng)目設(shè)備條件攪拌器空氣流量類型；封閉或開(kāi)放式葉片形狀；彎葉、平葉或箭葉攪拌器直徑/罐直徑擋板數(shù)和擋板寬度攪拌器檔數(shù)和位置每分鐘體積比[(V/V)/min]空氣分布器的類型和位置攪拌轉(zhuǎn)速罐壓