實(shí)驗(yàn)十四酵母蔗糖酶的提取純化及活力測(cè)定課件

實(shí)驗(yàn)十四酵母蔗糖酶分離、純化、活力測(cè)定、電泳檢測(cè)蔗糖酶的提取純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅毫私怆x子交換層析的基本原理。掌握蔗糖酶的提取純化及離子交換層析的基本步驟。熟悉有關(guān)生化技術(shù)的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理

蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一種水解酶。它催化蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖。因此，每水解1mol蔗糖，就生成2mol還原糖。還原糖的測(cè)定有多種方法，如Nelson比色法、斐林試劑法等。本實(shí)驗(yàn)用干酵母為原料，通過破碎細(xì)胞，熱處理，乙醇沉淀，柱層析等步驟提取蔗糖酶（invertase），并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

離子交換層析是常用的層析方法之一。它是在以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對(duì)溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。這些過程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白質(zhì)所帶的電荷存在差異，因而與離子交換劑的親和力就有區(qū)別。當(dāng)洗脫液的pH改變或者鹽的離子強(qiáng)度逐漸提高時(shí)，使某一種蛋白質(zhì)的電荷被中和，與離子交換劑的親和力降低，不同的蛋白質(zhì)按所帶電荷的強(qiáng)弱逐一被洗脫下來，達(dá)到分離的目的。

三、實(shí)驗(yàn)的主要材料

市售干酵母粉四、實(shí)驗(yàn)的主要試劑

1、石英砂（助研磨作用）。2、95％乙醇（沉淀雜蛋白）。

3.、DEAE—SepharoseFF(弱堿性陰離子交換劑，用于蛋白質(zhì)分離)。4、20mmol/LpH7.3Tris-HCl緩沖溶液（簡稱buff，用以維持蔗糖酶液的最適pH。）5、0.5mol/LNaCl（調(diào)節(jié)溶液離子強(qiáng)度）。

6、3，5-二硝基水楊酸試劑（作為還原糖顯色劑）。甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。五、實(shí)驗(yàn)的主要儀器1．冷凍離心機(jī)2．研缽3．恒溫水浴箱4．-20℃冰箱5．梯度混合器6．層析柱(1×20cm)七、實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵步驟：（以下各步驟除熱處理一步外，盡可能低溫）第一部分樣品的制備：1.稱取10.0克干酵母粉于研缽內(nèi)，加3.0克石英砂，10mlbuff（先量取總體積buff30ml），在研缽內(nèi)研磨成糊狀，約30分鐘，再分次加buff10ml并研磨10分鐘，,研磨時(shí)間大約60分鐘。轉(zhuǎn)入50mL離心管，12000r/min離心10分鐘，取上清液，并量取體積，留1.0ml上清液(定為第一步驟的樣品Ⅰ)，用于測(cè)定酶活力和蛋白濃度。2.熱處理將上步所得上清液轉(zhuǎn)入50ml離心管，迅速放入50℃恒溫水浴中，保持30分鐘，并用玻璃棒溫和攪動(dòng)抽提液，迅速用冰浴冷卻，10000rpm離心10分鐘，棄去沉淀，測(cè)量上清液體積，留1.0ml(Ⅱ樣品)測(cè)定此酶活力和蛋白濃度。3.酒精沉淀將熱處理后的上清液，加入相同體積的-20℃95％乙醇，冰浴中溫和攪動(dòng)，（注意邊攪慢加，滴加乙醇時(shí)滴與滴之間不能連成線?。。。┓胖?0min，然后10000rpm離心10min，棄去上清液，試管中沉淀放置冰箱保存或?qū)⒕凭幚砗蟮某恋砣苡?ml20mmol/LTris-HCl、pH7.3buff(Ⅲ樣品，留1.0ml樣液測(cè)活)，上樣前用7ml離心管5000rpm離心10min，待上樣。DEAE-SepharoseFF柱預(yù)先用20mmol/LTris-HCl,pH7.3buff平衡(約30ml流出液即可)，以流出液pH與buff一致為準(zhǔn)。上樣后，用20mmol/LTris-HCl,pH7.3buff進(jìn)行NaCl梯度洗脫(NaCl為0.5mol/L),層析柱連上梯度混合器，混合器中分別為50ml、20mmol/LTris-HCl,pH7.3緩沖液和50ml20mmol/LTris-HCl，pH7.3緩沖液，其中含0.5mol/LNaCl。裝柱(層析柱規(guī)格1×20cm)：裝柱前先將柱下端的出水口關(guān)閉，加進(jìn)5ml（約1/3柱床體積）20mmol/LTris-HCl、pH7.3的緩沖液，然后將處理好的DEAE—SepharoseFF輕輕攪勻（注意不能太稀，也不能太稠，剛好呈流質(zhì)狀態(tài)）沿玻棒靠近柱管壁慢慢連續(xù)加進(jìn)柱內(nèi)。注意不能帶進(jìn)氣泡，待凝膠沉積約1-2cm后松開層析柱出口，控制流速0.5ml/min；待柱內(nèi)DEAE—SepharoseFF自然沉降至所需高度并分出水層后，吸去水層，用玻棒將沉降界面攪勻，再加進(jìn)處理好的DEAE—Sephadex至距層析柱上端4cm處為止（這時(shí)須保持DEAE—SepharoseFF柱面平整）。用50ml20mmol/LTris-HCl、pH7.3的緩沖液裝進(jìn)洗脫杯，連通層析柱，進(jìn)行柱平衡，直到流出液與緩沖液的pH一致。加樣，洗脫：將平衡好的DEAE—SepharoseFF上端的水小心吸干，留下一薄層液面，用長滴管將樣品液5ml，沿管壁環(huán)形慢慢加進(jìn)柱內(nèi)，待樣品液全部進(jìn)入DEAE—SepharoseFF內(nèi)，只剩下一薄層液面時(shí)，用buff環(huán)形緩慢填滿層析柱，立即連上梯度洗脫杯（梯度洗脫杯中靠出口處的杯中裝20mmol/LTris-HClpH7.3buff50ml，另一杯中裝50mlbuff含0.5mol/LNaCl），打開洗脫杯控制開關(guān)，開動(dòng)磁力攪拌器，用蠕動(dòng)泵控制流速為3ml/15min。洗脫液通過檢測(cè)器，用部分收集器自動(dòng)收集洗脫液，每6min收集一管(約3~4ml)。洗脫至混合器中液體流完為止，比較各管的酶活力的大小，將最高活力的若干管酶液集中，均分在幾個(gè)小管中，低溫保存，用于性質(zhì)測(cè)定。留液(Ⅳ)測(cè)定酶活和蛋白量。(洗脫時(shí)，流速為0.5ml/分鐘-1ml／分鐘、4ml接收一管)八、注意事項(xiàng)：1、離心前一定要平衡，并對(duì)稱放入，蓋好蓋子。2、層析柱跟水平面要垂直。膠面要平，裝柱時(shí)注意操作壓；3、裝柱用的樹脂不能太濃也不能太?。恢鶅?nèi)不能有氣泡,，不能干膠，不能有斷層。流速不能過快。4、整個(gè)操作過程防止液面低于凝膠；清除管道內(nèi)氣泡。5、記錄儀上zero勿動(dòng)否則是一條直線。九、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析附：儀器調(diào)節(jié)指標(biāo)恒流泵流速：3ml/10min核酸蛋白自動(dòng)檢測(cè)儀A:0.2紀(jì)錄儀V:20mv走紙速度：0.5mm/min自動(dòng)收集器6min/tube共25tube上樣量5ml裝填平衡后的凝膠柱用肉眼觀察應(yīng)均勻，無紋路，無氣泡。蔗糖酶活力及蛋白濃度的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笳莆彰富盍y(cè)定的方法；學(xué)會(huì)用Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度；熟悉酶活力蛋白濃度的計(jì)算方法。干擾因素：酚類、檸檬酸；干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)；氨基酸或肽的緩沖劑。任何通過氮或碳原子把兩個(gè)羰基連在一起的化合物都能產(chǎn)生陽性結(jié)果優(yōu)缺點(diǎn)：操作簡便，靈敏度高，可測(cè)范圍25-250微克蛋白質(zhì)。不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是直線形式?？蓽y(cè)范圍25—250ug蛋白質(zhì)，而紫外的范圍大200—2000ug。三、實(shí)驗(yàn)主要材料

上一實(shí)驗(yàn)通過離子交換獲得的蔗糖酶液。四、實(shí)驗(yàn)主要試劑

1、3，5-二硝基水楊酸試劑：甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。2、1g/L葡萄糖3、5%蔗糖4、250ug/mL牛血清溶液(用Tris-HCl緩沖液配制)5、0.2mol/L乙酸緩沖液6、Folin-酚試劑A液：按下列比例：4％Na2CO3:0.2mol/LNaOH:2％酒石酸鉀(鈉)：1％CuSO4.5H2O=50:50:1:1(v/v)混合后一天有效。B液：在2L容積的磨口瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2W),25g鉬酸鈉(Na2MoO4.2H2O)及700ml水，50ml85％磷酸，100ml濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管以小火回流10h，回流結(jié)束，加入150g硫酸鋰，50ml水及數(shù)滴溴水，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以驅(qū)除過量的溴，冷卻后呈黃色(或微綠色，若呈綠色須重復(fù)滴加溴水的步驟)，稀釋至1L，使最后濃度1mol/L酸度，過濾，濾液置于棕色瓶中備用五、實(shí)驗(yàn)主要儀器722分光光度計(jì)恒溫水浴試管移液管管號(hào)試劑123456789葡萄糖1g/L（ml）0.000.050.100.200.300.400.500.600.70蒸餾水(ml)2.01.951.901.801.701.601.501.401.303,5-二硝基水楊酸(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.01.0各管溶液混合均勻，沸水浴中加熱5min。取出立即用冷水冷卻至室溫，再向每管加入7ml蒸餾水，搖勻，于520nm處測(cè)A值.A520A520平均值以還原糖(mg數(shù))為橫坐標(biāo)，A520值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。各步酶活力的測(cè)定：按下表加樣反應(yīng)（單位：ml）編號(hào)樣品空白1Ⅰ(1：50)Ⅱ(1：50)Ⅲ(1：50)Ⅳ(1：10)2345678910111213乙酸緩沖液0.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.4蔗糖5%0.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.4蒸餾水1.21.151.00.71.151.00.71.151.00.71.151.00.7酶液0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.5各管溶液混合均勻,25℃保溫10分鐘。然后向每管加入1.0ml3.5-二硝基水楊酸試劑，沸水中加熱5分鐘，取出后立即用冷水冷卻至室溫，再向每管加入7ml蒸餾水，搖勻，測(cè)A640值。A640葡萄糖μmol活力（u/ml）活力平均值八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析活力和比活力的計(jì)算：1活力單位(U)：酶在一定溫度、pH4.5的條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需的酶量。比活力=總活力單位u／總蛋白mg根據(jù)測(cè)得結(jié)果，計(jì)算出各步數(shù)據(jù)填入下表：Fraction體積(ml)蛋白(mg/ml)總蛋白(mg)活力(u/ml)總活力(u)比活力(u/mg)純化倍數(shù)回收率(%)Ⅰ1100ⅡⅢⅣ九、附注：比活力——酶的總活力單位數(shù)除以總蛋白mg數(shù)，即每mg蛋白所含有的酶活力單位數(shù)?；厥章省恳徊剿鶞y(cè)得的總活力數(shù)與第一步總活力數(shù)之比值，以百分比表示。假設(shè)第一步回收率為100%純化倍數(shù)——每一步所得的比活力與第一步比活力之比，開始時(shí)提純倍數(shù)假設(shè)為1。

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)酶分子量

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/p>

1、了解SDS的原理；2、掌握SDS測(cè)定分子量的方法。二、實(shí)驗(yàn)基本原理

在蛋白質(zhì)溶液中加入SDS（十二烷基磺酸鈉）和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵壞原；SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。由于SDS帶大量負(fù)電荷，它的量大大超過蛋白質(zhì)分子的原有電荷量。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變成橢圓棒狀，使得不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，約為1.8nm，而長軸則與蛋白質(zhì)分子量的大小成比例。因此，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝叫電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而只是與橢圓棒狀的長度也就是分子量的函數(shù)有關(guān)，即按分子量的大小而遷移。三、實(shí)驗(yàn)的主要材料

藻藍(lán)蛋白樣品四、主要試劑：

①標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：β—半乳糖苷酶（Mw116KD）牛血清白蛋白（Mw66.2KD）雞卵清蛋白（Mw45KD）乳酸脫氫酶（Mw35KD）核酸內(nèi)切酶抑制劑（Mw25KD）β—乳球蛋白(Mw18.4KD)雞蛋清溶菌酶（Mw14.4KD）②30.8%凝膠母液③1.5mol/LTris—HCl緩沖液（pH8.9)0.5mol/LTris—HCl緩沖液（pH6.7)④10%TEMED溶液⑤10%過硫酸銨⑥電極緩沖液（pH8.3）⑦樣品溶解液：內(nèi)含1%SDS、1%巰基乙醇、10%甘油、0.02%溴酚藍(lán)的0.01mol/LpH8.0Tris—HCl緩沖液。⑧固定液：454ml50%甲醇水溶液+46ml冰醋酸。⑨染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250+90.8ml50%甲醇+9.2ml冰乙酸⑩脫色液：7.5ml冰乙酸+5ml甲醇+87.5mlH2O五、實(shí)驗(yàn)主要儀器平板電泳槽電泳儀移液槍脫色搖床六、實(shí)驗(yàn)操作流程

1、凝膠制備2、樣品處理3、上樣4、電泳5、固定、染色6、脫色、結(jié)果分析七、實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵操作步驟：

1、凝膠的制備A、12%分離膠：30.8%凝膠母液3.0mlTris—HCl緩沖液（pH8.9)0.9ml蒸餾水3.5ml10%SDS75μl10%AP（過硫酸銨）60μl,TEMED（原液）4μl注意：1、10%AP及TEMED待裝板成功后再加入上述溶液中,以免凝膠凝固影響灌膠。2、將以上貯液混勻,灌膠，水封，聚合（40min左右）。3、裝板的方法；灌膠時(shí)小心不要有氣泡；水封用滴管從一角慢加；除去水分時(shí)用無毛邊的濾紙條輕吸殘留的水液。

B、4%濃縮膠：

30.8%凝膠母液0.35mlTris—HCl緩沖液（pH6.7)0.3ml蒸餾水2.3ml10%SDS25μl10%AP25μlTEMED3μl

將以上貯液混勻,灌膠，加至距玻璃邊緣0.1cm時(shí)，輕輕插上“梳子”，聚合。約30min后小心拔出梳子，將模具下端兩角打開。

2、蛋白質(zhì)樣品的處理：①標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（1mg/1ml）：使用前100℃沸水浴1-3min。②樣品若是粉末，精確稱取8mg加樣品溶解液5ml混勻，待樣品充分溶解后輕輕蓋上蓋（不要蓋緊，以免受熱沖出），置100℃水浴箱中保溫5min，取出冷卻至室溫。③取4支Eeppendorf小離心管，編號(hào)。將上周純化的樣品加樣品溶解液按以下比例配制

樣品：樣品溶解液（5×）F1：樣品溶解液＝1：2F2：樣品溶解液＝1：2F3：樣品溶解液＝1：1F4：樣品溶解液＝4：1（200μl：50μl）