酵母RNA的提取修改課件

酵母ＲＮＡ的制備、鑒定及含量測定結(jié)構(gòu)簡介二、實(shí)驗(yàn)原理選材：提取和制備RNA的首要問題是選RNA含量高的材料。微生物是工業(yè)上大量生產(chǎn)核酸的原料，其中RNA的提制以酵母最為理想，因?yàn)榻湍负怂嶂兄饕荝NA（2.67～10.0%），DNA很少（0.03～0.516％），而且菌體容易收集，RNA也易于分離。此外，抽提后的菌體蛋白質(zhì)（占干菌體的50%）仍具有很高的應(yīng)用價(jià)值。提取方法簡單地講，核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。

RNA的pI2.0~2.5DNA？實(shí)驗(yàn)室法：苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法、稀鹽溶液提取法

0.14mol/L

其中苯酚法又是實(shí)驗(yàn)室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在苯酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)，提取的RNA具有生物活性。工業(yè)法：稀堿法或濃鹽法RNA的鑒定含氮堿基：嘌呤能與Ag(NH3)2+中的銀結(jié)合生成溶解度很小的嘌呤銀鹽沉淀，從而鑒定嘌呤的存在。戊糖：核糖與強(qiáng)酸共熱生成糠醛，后者與地衣酚(3，5—二硝基甲苯)反應(yīng)，縮合成綠色化合物，以此鑒定戊糖的存在。磷酸：在酸性溶液中磷酸與鉬酸作用生成磷鉬酸。后者當(dāng)有還原刑(如抗杯血酸、氯化亞錫等)存在時(shí)，立即轉(zhuǎn)變成藍(lán)色的還原產(chǎn)物。鉬藍(lán)反應(yīng)極為靈敏，微量雜質(zhì)的磷、硅酸鹽、鐵離子以及強(qiáng)度偏高或偏低都會(huì)影響測定結(jié)果。因此實(shí)驗(yàn)用的器皿需要特別清潔。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑1．實(shí)驗(yàn)材料干酵母粉、pH0.5～5.0的精密試紙；冰塊。

2．主要儀器（1）藥物天平（2）三角瓶（100mL）（3）量筒（50mL）（4）水浴鍋（5）電爐（6）試管木夾（7）離心管（8）離心機(jī)（4000r/min）（9）燒杯（250mL,50mL,10mL）（10）滴管及玻棒（11）吸濾瓶（500mL）（12）布氏漏斗（60mm）（13）表面皿（8cm）（14）烘箱（15）干燥器（16）紫外可見分光光度計(jì)

四、操作方法（一）、RNA的制備

1．提取活性干酵母粉5g，倒入100mL三角瓶中，加NaCl5g，水50mL，攪拌均勻，置于沸水浴中提取1h。2．分離將上述提取液取出，立即用自來水冷卻，裝入大離心管內(nèi)，以3500r/min離心10min，使提取液與菌體殘?jiān)确蛛x。3．沉淀RNA將離心得到的上清液傾于50mL燒杯中，并置于放有冰塊的250mL燒杯中冷卻，待冷至10℃以下時(shí)，用6mol/LHCl小心地調(diào)節(jié)pH至2.0～2.5。隨著pH下降，溶液中白色沉淀逐漸增加，到等電點(diǎn)時(shí)沉淀量最多（注意嚴(yán)格控制pH）。調(diào)好后繼續(xù)于冰水中靜置10min，使沉淀充分，顆粒變大。4．抽濾和洗滌（二）RNA的鑒定

水解RNA：取0.5~1g提取的核酸，加入10%硫酸10mL沸水浴加熱10分鐘制成水解液，然后進(jìn)行組份鑒定。1、取冷卻后的RNA水解液0.5ml，加入0.5ml的濃氨水，再加入1ml1%的AgNO3溶液，觀察有無沉淀生成。2、取RNA水解液1ml，加入1ml地衣酚溶液，于沸水浴中加熱15分鐘，觀察溶