三聚氰胺的檢測方法-HPLC

三聚氰胺的檢測方法一一HPLC一研究背景及內(nèi)容（一）研究背景今年三月中旬以來，美國發(fā)生多起寵物貓、狗中毒死亡事件。美國食品藥品管理局（FDA）從江蘇和山東兩家公司出口美國的部分小麥蛋白粉和大米蛋白粉中檢出三聚氰胺成分，并初步認(rèn)為寵物食品中含有的三聚氰胺是導(dǎo)致貓、狗中毒死亡的原因。不法廠商在植物蛋白粉中添加三聚氰胺的前提之一是，三聚氰胺物理性狀為〃白色單斜晶體、無味”，這與蛋白粉相仿。前提之二，此物質(zhì)易于購買，也易于生產(chǎn)，成本很低。符合這兩個(gè)前提的化學(xué)物質(zhì)較多，而三聚氰胺含氮量高才是最根本原因。據(jù)業(yè)內(nèi)專業(yè)人員介紹，目前，國際上使用最多的飼料蛋白質(zhì)含量檢測辦法為〃凱氏定氮法”，即測定受檢飼料中氮所占的比例，再乘以一定系數(shù)得到蛋白質(zhì)含量。南京大學(xué)高分子化學(xué)教授諶東中解釋說，蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過30%,而三聚氰胺的分子式顯示，其含氮量為66%左右。由于〃凱氏定氮法”只能測出含氮量，并不能區(qū)別飼料中有無合規(guī)添加劑或違規(guī)化學(xué)物質(zhì)，所以，加了三聚氰胺的飼料理論上可以測出較高的〃蛋白質(zhì)含量”。但是，三聚氫胺本身無法替代蛋白質(zhì)，幾乎沒有任何營養(yǎng)價(jià)值。加了這種物質(zhì)，造成的只是蛋白質(zhì)含量提高的假象。三聚氰胺并非惟一的替代添加物，很多廠商用三聚氫胺拉高飼料蛋白質(zhì)含量后，再加入低價(jià)的淀粉等，作低蛋白質(zhì)含量。以上兩種操作，從經(jīng)濟(jì)上講都有較大套利空間。出于相同的原理，只要含氮量大于普通植物蛋白質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，且性狀和價(jià)格具備條件，在理論上都存在被不法廠商利用的可能性?！毒?xì)有機(jī)化工原料及中間體手冊》顯示，三聚氰胺〃本品低毒，無刺激性……高溫下可能分解產(chǎn)生氰化物（有較大毒性），故應(yīng)避免高溫”。由國際化學(xué)品安全規(guī)劃署和歐洲聯(lián)盟委員會(huì)合編的《國際化學(xué)品安全手冊》（第三卷），對(duì)三聚氰胺則有如下描述：〃長期或反復(fù)接觸作用：該物質(zhì)可能對(duì)腎發(fā)生作用”。（二）研究內(nèi)容本論文主要以三聚氰胺為研究對(duì)象，選擇大豆蛋白、面粉、小麥粉、薄立粉、飼料面粉為研究體系，研究復(fù)雜基體的處理方法和高效液相色譜對(duì)三聚氰胺的檢測技術(shù)。前處理方法的研究主要包括提取液體積的選擇、樣品的凈化采用固體萃取凈化，考察淋洗液、淋洗體積、洗脫體積和洗脫速率的選擇及方法回收率。選擇HPLC-DAD對(duì)三聚氰胺進(jìn)行定性定量檢測，通過對(duì)液相色譜的優(yōu)化確立了分析條件。在此基礎(chǔ)上采用已建立的提取和凈化方法對(duì)各類粉進(jìn)行前處理，通過HPLC-DAD分析的結(jié)果來檢驗(yàn)所建立的檢測方法的可靠性。二三聚氰胺簡介（一）三聚氰胺的理化性質(zhì)三聚氰胺（melamine）簡稱三胺,學(xué)名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是—種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，白色結(jié)晶粉末,無毒，無味。在常壓下，354C分解，升華溫度：300C。能溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、毗啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳。三聚氰胺顯弱堿性，能夠與各種酸反應(yīng)生成三聚氰胺鹽。在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿液中，三聚氰胺發(fā)生水解，胺基逐步被羥基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺與醛類反應(yīng)生成加成化合物。其中三聚氰胺與甲醛水溶液的反應(yīng)是最重要的。（二）三聚氰胺的用途三聚氰胺是一種用途廣泛的具有均勻結(jié)構(gòu)的有機(jī)化工中間產(chǎn)品，最主要的用途是作為生產(chǎn)三聚氰胺-甲醛樹脂（MF）的原料。該樹脂飛行員熱固性樹脂，它具有阻燃，耐水、耐熱、耐老化、耐電弧、耐化學(xué)腐蝕、有良好的絕緣性能、光澤度和機(jī)械強(qiáng)度，廣泛用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)。其用途主要有以下幾個(gè)方面：1、裝飾貼面板：可制成防火、抗震、耐熱的層壓板，色澤鮮艷、堅(jiān)固耐熱、耐污染的裝飾板，作飛機(jī)、船舶和家具的貼面板及防火、抗震、耐熱的房屋裝飾材料。2、涂料：三聚氰胺在丙烯酸系、醇酸系、環(huán)氧系涂料中作交聯(lián)劑。用丁醇、甲醇醚化后，作為高級(jí)熱固性涂料、固體粉末涂料的膠聯(lián)劑、可制作金屬涂料和車輛、電器、家具用高檔氨基樹脂裝飾漆。該漆具有色澤光亮、附著力強(qiáng)、硬度高、耐老化、耐腐蝕的特點(diǎn)。3、模塑粉：經(jīng)混煉、造粒等工序可制成蜜胺塑料，無毒、抗污，潮濕時(shí)仍能保持良好的電氣性能，可制成潔白、耐摔打的日用器皿、衛(wèi)生潔具和仿瓷餐具，電器設(shè)備等的高級(jí)絕緣材料。4、紙張：用乙醚醚化后可用作紙張?zhí)幚韯?，生產(chǎn)抗皺、抗縮、防潮、不腐爛的鈔票和軍用地圖等高級(jí)紙。

5、三聚氰胺-甲醛樹酯與其它原料混配，還可以生產(chǎn)出織物整理劑、皮革鞣潤劑、上光劑和抗水劑、橡膠粘合劑、高效水泥減水劑（萘為原料）、鋼材氮化劑等。助燃劑原理三聚氰胺中氮遇高溫分解釋放出氮?dú)?，所以三聚氰胺作為聚氨酯泡沫塑料的阻燃劑。三聚氰胺膠與脲醛膠相具有粘合力強(qiáng)、耐水、耐熱等特點(diǎn)；與酚醛膠相比具有固化速度快、無毒、透明、不污染板面等特點(diǎn)。這種化學(xué)品常被用于生產(chǎn)塑料、膠水和阻燃劑,在部分亞洲國家，它也被用以制造化肥。（四）三聚氰胺的測定FDA在其網(wǎng)站上公布了相應(yīng)的檢測方法:采用GC-MS定性，采用HPLC-UV定量.若用GC,需要對(duì)樣品行衍生處理，而且方法不穩(wěn)定。針對(duì)上述情況本文采用HPLC-UV法測定植物性蛋白中的三聚氰胺。三高效液相色譜簡介（一）高效液相色譜儀的系統(tǒng)組成、工作原理高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。（二）高效液相色譜法的特點(diǎn)效（二）高效液相色譜法的特點(diǎn)效'高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來的一種以液體作流動(dòng)相的新色譜技術(shù)。高效液相色譜是在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的?，F(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點(diǎn)僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率和實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作。經(jīng)典的液相色譜法，流動(dòng)相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長。而現(xiàn)代液相色譜法弓1用了氣相色譜的理論，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動(dòng)化等特點(diǎn)。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。

色譜方法發(fā)展及優(yōu)化指的是對(duì)于復(fù)雜未知樣品先初步確定其分離條件（如模式、柱子、流動(dòng)相等），后對(duì)此方法進(jìn)行優(yōu)化，如流動(dòng)相的多臺(tái)階多二元的智能優(yōu)化以及多維色譜技術(shù)的應(yīng)用。從而在給定的柱系統(tǒng)和最佳的流動(dòng)相梯度下，樣品組分獲得交好的分離，分析時(shí)間最短，同時(shí)色譜峰分離度增加，檢測靈敏度也響應(yīng)的得到提高。（三）高效液相色譜法的分類效（三）高效液相色譜法的分類效'高效法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附-解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10pm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個(gè)分配平衡過程。涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另夕卜在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用。現(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法（NPC）和反相色譜法（RPC）。（1）正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極（2）反相色譜法一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為~（2~8），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH~10范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法反相色譜法固定相極性高~中中~低流動(dòng)相極性低~中中~高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸弓I力而分離。緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。離子對(duì)色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外卜高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基漠化銨、四丁基銨磷酸鹽。離子對(duì)色譜法常用ODS柱（即C18），流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10mmol/L的離子對(duì)試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測組分保時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。5排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。）高效液相色譜儀的應(yīng)用高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動(dòng)相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合川PLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度,使分離和同時(shí)測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展,有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)受到普遍重視,如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等;液相色譜-紅外光譜連用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測定水中的烴類，海水中的不揮發(fā)烴類,使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。（五）高效液相色譜儀的檢測系統(tǒng)高效液相色譜的檢測器有示差折光檢測器、紫外檢測器、紅外檢測器、熒光檢測器和電化學(xué)檢測器。其中應(yīng)用較為廣泛的是紫外檢測器（UVD），具有結(jié)構(gòu)緊湊、造價(jià)低、操作維修方便、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，它分為固定波長、可變波長和二極管陣列檢測三種類型?？勺儾ㄩL紫外檢測器由于可選擇的波長范圍很大，既提高了檢測器的選擇性，又可選用組分的最靈敏吸收波長進(jìn)行測定，從而提高檢測的靈敏度。光二極管陣列檢測器是80年代發(fā)展起來的一種新型的紫外吸收檢測器，它以普通紫外檢測器的區(qū)別在于進(jìn)入流通池的不再是單色光，獲得的檢測信號(hào)不是在單一波長上，而是在全部紫外光波長上的色譜信號(hào)，因此它不僅可進(jìn)行定量檢測，還可提供組分的光譜定性的信息。〃蘇丹紅”是一種化學(xué)染色劑，并非食品添加劑。它的化學(xué)成份中含有一種叫萘的化合物，該物質(zhì)具有偶氮結(jié)構(gòu)，由于這種化學(xué)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)決定了它具有致癌性，對(duì)人體的肝腎器官具有明顯的毒性作用。蘇丹紅屬于化工染色劑，主要是用于石油、機(jī)油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是使其增色，也用于鞋、地板等的增光。又名〃蘇丹”。瘦肉精是一類動(dòng)物用藥，有數(shù)種藥物被稱為瘦肉精，例如萊克多巴胺(Ractopam