生物化學葉綠體和線粒體

生物化學葉綠體和線粒體第1頁/共82頁本章內容提要第一節(jié)線粒體一、結構二、氧化磷酸化的分子基礎三、氧化磷酸化的作用機理四、線粒體的半自主性五、線粒體的增殖第二節(jié)葉綠體一、形態(tài)與結構二、光合磷酸化作用機理三、葉綠體的半自主性四、葉綠體的增殖第三節(jié)蛋白質定向轉運一、線粒體蛋白質的轉運二、葉綠體的蛋白質轉運第2頁/共82頁第一節(jié)線粒體1890年R.Altaman首次發(fā)現(xiàn)，命名為bioblast。1898年vonBenda提出mitochondrion。1900年L.Michaelis用JanusGreenB染色，發(fā)現(xiàn)線粒體具有氧化作用。Green（1948）證實線粒體含所有三羧酸循環(huán)的酶，Kennedy和Lehninger（1949）發(fā)現(xiàn)脂肪酸氧化為CO2的過程是在線粒體內完成的。第3頁/共82頁一、結構粒狀或桿狀。蛋白占干重的65-70%，脂類占25-30%。直徑0.5~1μm，長1.5~3.0μm，在胰臟外分泌細胞中可長達10~20μm，稱巨線粒體。肝細胞約1300個線粒體，占細胞體積的20%，許多哺乳動物成熟的紅細胞無線粒體。（一）形態(tài)第4頁/共82頁通常分布在細胞功能旺盛的區(qū)域。在腎細胞中靠近微血管，在精子中分布在鞭毛中區(qū)。線粒體可以向細胞功能旺盛的區(qū)域遷移，微管是其導軌、馬達蛋白提供動力。（二）分布（三）超微結構分為外膜、內膜、膜間隙和基質四部分。第5頁/共82頁Structuresofthemitochondrion第6頁/共82頁1、外膜(outmembrane)含40%的脂類和60%的蛋白，具有porin構成的親水通道，允許分子量5KD以下的分子通過，1KD以下的分子可自由通過。標志酶為單胺氧化酶。2、內膜（innermembrane）含100種以上的多肽，蛋白質和脂類的比例高于3:1。心磷脂含量高（達20%）、缺乏膽固醇，類似于細菌質膜。通透性很低，僅允許不帶電荷的小分子物質通過。第7頁/共82頁氧化磷酸化的電子傳遞鏈位于內膜。標志酶為細胞色素C氧化酶。內膜向線粒體內室褶入形成嵴（cristae），能擴大內膜表面積（達5~10倍），嵴有兩種：①板層狀、②管狀。嵴上覆有基粒?；Ｓ深^部（F1）和基部（F0）構成。3、膜間隙

(intermembranespace)：是內外膜之間的腔隙，寬約6-8nm。標志酶為腺苷酸激酶。第8頁/共82頁4、基質（matrix）為內膜和嵴包圍的空間。含有：催化三羧酸循環(huán)，脂肪酸、丙酮酸和氨基酸氧化的酶類。標志酶為蘋果酸脫氫酶。線粒體DNA（mtDNA），及線粒體特有的核糖體，tRNAs、rRNA、DNA聚合酶、氨基酸活化酶等。纖維絲和電子密度很大的致密顆粒狀物質，內含Ca2+、Mg2+、Zn2+等離子。第9頁/共82頁管狀嵴線粒體第10頁/共82頁小鼠腎曲管上皮細胞冰凍蝕刻第11頁/共82頁人黑色素瘤細胞線粒體第12頁/共82頁二、氧化磷酸化的分子基礎動物細胞中80%的ATP來源于線粒體，糖、脂肪和氨基酸徹底氧化，電子經過一系列的傳遞，傳至氧分子，逐級釋放能量，合成ATP。第13頁/共82頁第14頁/共82頁（一）電子載體NAD、黃素蛋白、細胞色素、鐵硫蛋白、輔酶Q等。1、NAD：即煙酰胺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide），連接三羧酸循環(huán)和呼吸鏈，將代謝過程中脫下來的氫交給黃素蛋白。2、黃素蛋白：含F(xiàn)MN或FAD的蛋白，可接受2個電子2個質子。黃素相關的脫氫酶類主要有：①以FMN為輔基的NADH脫氫酶。②以FAD為輔基的琥珀酸脫氫酶。第15頁/共82頁NAD＆NADP第16頁/共82頁Flavinmononucleotide(FMN)&Flavinadeninedinucleotide第17頁/共82頁3、細胞色素：分子中含有血紅素鐵，以共價形式與蛋白結合，通Fe3+、Fe2+形式變化傳遞電子，呼吸鏈中有5類，即：細胞色素a、a3、b、c、c1，其中a、a3含有銅原子。第18頁/共82頁4、鐵硫蛋白：在其分子結構中每個鐵原子和4個硫原子結合，通過Fe2+、Fe3+互變進行電子傳遞，有2Fe-2S和4Fe-4S兩種類型。第19頁/共82頁5、輔酶Q：是脂溶性小分子量醌類化合物，通過氧化和還原傳遞電子。有3種氧化還原形式，即：氧化型醌Q，還原型氫醌（QH2）和介于兩者之者的自由基半醌（QH）。第20頁/共82頁（二）呼吸鏈的復合物呼吸鏈組分按氧化還原電位由低向高的方向排列。利用deoxycholate處理線粒體內膜、分離出呼吸鏈的4種復合物。輔酶Q和細胞色素C不屬于任何一種復合物。第21頁/共82頁1、復合物I：NADH脫氫酶。組成：42條肽鏈組成，呈L型，含一個FMN和至少6個鐵硫蛋白，分子量接近1MD，以二聚體形式存在。作用：催化NADH的2個電子傳遞至輔酶Q，同時將4個質子由線粒體基質（M側）轉移至膜間隙（C側）。NADH→FMN→Fe-S→QNADH+5H+M+Q→NAD++QH2+4H+C第22頁/共82頁2、復合物II：琥珀酸脫氫酶組成：至少由4條肽鏈，含有一個FAD，2個鐵硫蛋白。作用：催化琥珀酸的低能量電子轉至輔酶Q，但不轉移質子。琥珀酸→FAD→Fe-S→Q。琥珀酸+Q→延胡索酸+QH2第23頁/共82頁3、復合物III：細胞色素c還原酶。組成：至少11條不同肽鏈，以二聚體形式存在，每個單體包含兩個細胞色素b（b562、b566）、一個鐵硫蛋白和一個細胞色素c1

。作用：催化電子從輔酶Q傳給細胞色素c，每轉移一對電子，同時將4個質子由線粒體基質泵至膜間隙。2還原態(tài)cytc1+QH2+2H+M→2氧化態(tài)cytc1+Q+4H+C第24頁/共82頁復合物Ⅲ的電子傳遞比較復雜，和“Q循環(huán)”有關第25頁/共82頁4、復合物IV：細胞色素c氧化酶組成：為二聚體，每個單體含至少13條肽鏈，分為三個亞單位。作用：將從細胞色素c接受的電子傳給氧，每轉移一對電子，在基質側消耗2個質子，同時轉移2個質子至膜間隙。cytc→CuA→hemea→a3-CuB→O24還原態(tài)cytc+8H+M+O2→4氧化態(tài)cytc+4H+C+2H2O第26頁/共82頁①由復合物I、III、IV組成，催化NADH的脫氫氧化。②由復合物II、III、IV組成，催化琥珀酸的脫氫氧化。對應于每個復合物Ⅰ，大約需要3個復合物Ⅲ，7個復合物Ⅳ，任何兩個復合物之間沒有穩(wěn)定的連接結構，而是由輔酶Q和細胞色素c這樣的可擴散性分子連接。（三）兩條主要的呼吸鏈第27頁/共82頁TransportofelectronsfromNADH第28頁/共82頁TransportofelectronsfromFADH2第29頁/共82頁兩條呼吸鏈魚藤酮、阿米妥抗霉素ACN—、CO第30頁/共82頁呼吸鏈組分及ATP酶在線粒體內膜上呈不對稱分布?？捎脕喚€粒體顆粒和冰凍蝕刻技術呼吸鏈組分的分布。用超聲波破碎線粒體，形成顆粒朝外的小膜泡，稱亞線粒體顆粒，具有正常的電子傳遞和磷酸化的功能。用細胞色素c的抗體能夠抑制完整線粒體的氧化磷酸化，但不能抑制亞線粒體顆粒的氧化磷酸化，為什么？第31頁/共82頁P.Mitchell（1961）提出“化學滲透假說”。認為：電子沿呼吸鏈傳遞時，所釋放的能量將質子從內膜基質側（M側）泵至膜間隙（C側），形成質子動力勢（△P）?！鱌=Ψ-(2.3RT/F)△pH其中：△pH=pH梯度，Ψ=電位梯度，T=絕對溫度，R=氣體常數(shù)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，當溫度為25℃時△P的值為220mV左右。（一）質子動力勢，proton-motiveforce第32頁/共82頁ChemiosmoticTheory第33頁/共82頁狀如蘑菇，屬F型質子泵。分為球形的F1（頭部）和嵌入膜中的F0（基部）。F1由5種多肽組成α3β3γδε復合體，具有三個ATP合成的催化位點（每個β亞基具有一個）。F0由三種多肽組成ab2c12復合體，嵌入內膜，12個c亞基組成一個環(huán)形結構，具有質子通道。（二）ATP合酶（ATPsynthetase）第34頁/共82頁ATP合酶第35頁/共82頁1979年代BoyerP提出構象耦聯(lián)假說。其要點如下：1．ATP酶利用質子動力勢，發(fā)生構象改變，改變與底物的親和力，催化ADP與Pi形成ATP。2．F1具有三個催化位點，但在特定的時間，三個催化位點的構象不同（L、T、O），與核苷酸的親和力不同。3．質子通過F0時，引起c亞基構成的環(huán)旋轉，從而帶動γ亞基旋轉，由于γ亞基的端部是高度不對稱的，它的旋轉引起β亞基3個催化位點構象的周期性變化（L、T、O），不斷將ADP和Pi加合在一起，形成ATP。第36頁/共82頁第37頁/共82頁支持構象耦聯(lián)假說的實驗：第38頁/共82頁ATPsynthaseasareversiblecouplingdevice第39頁/共82頁（三）氧化磷酸化抑制劑1．電子傳遞抑制劑抑制NADH→CoQ的電子傳遞。阿米妥、魚藤酮。抑制復合物III?？姑顾谹。抑制復合物IV。如：CO、CN、NaN3、H2S。電子傳遞抑制劑可用來研究呼吸鏈各組分的排列順序，當呼吸鏈某一特定部位被抑制后，底物一側均為還原狀態(tài)，氧一側均為氧化態(tài)，可用分光光度計檢測。第40頁/共82頁第41頁/共82頁2．磷酸化抑制劑與F0結合結合，阻斷H+通道。如：寡霉素。3．解偶聯(lián)劑（uncoupler）解偶聯(lián)蛋白(uncouplingproteins,UCPs)：位于動物棕色脂肪組織和肌肉線粒體，與維持體溫有關。質子載體：DNP、FCCP。質子通道：增溫素（thermogenin）。其它離子載體：如纈氨霉素。某些藥物：如過量的阿斯匹林。第42頁/共82頁四、線粒體的半自主性1963年M.&S.Nass發(fā)現(xiàn)線粒體DNA。線粒體類似于細菌的特征：①環(huán)形DNA；②70S核糖體；③RNA聚合酶被溴化乙錠抑制，不被放線菌素D所抑制；④tRNA和氨?；?tRNA合成酶不同于細胞質中的；⑤蛋白質合成的起始氨?；鵷RNA是N-甲酰甲硫氨酰tRNA；對細菌蛋白質合成抑制劑氯霉素敏感對細胞質蛋白合成抑制劑放線菌酮不敏感。第43頁/共82頁mtDNA的遺傳密碼與通用的遺傳密碼的區(qū)別：UGA不是終止信號，而是色氨酸的密碼。多肽內部的甲硫氨酸由AUG和AUA兩個密碼子編碼；起始甲硫氨酸由AUG,AUA,AUU和AUC四個密碼子編碼；AGA,AGG不是精氨酸的密碼子，而是終止密碼子，因而，在線粒體密碼系統(tǒng)中的4個終止密碼子（UAA，UAG，AGA，AGG）。第44頁/共82頁五、線粒體的增殖線粒體來源于已有的線粒體的分裂。間壁分離：分裂時先由內膜向中心皺褶，將線粒體分為兩個，常見于鼠肝和植物分生組織中。收縮后分離：通過中部縊縮分裂為兩個。出芽：見于酵母和蘚類植物，線粒體出現(xiàn)小芽，脫落后長大，發(fā)育為線粒體。第45頁/共82頁線粒體分裂狗心肌細胞線粒體新生鼠肝細胞線粒體213第46頁/共82頁第二節(jié)葉綠體綠色植物通過葉綠體（Chloroplast）完成能量轉換，利用光能同化二氧化碳和水，合成糖，同時產生氧。綠色植物年產干物質達1014公斤。光合作用是地球上有機體生存和發(fā)展的根本源泉。第47頁/共82頁第48頁/共82頁一、形態(tài)與結構象雙凸或平凸透鏡，長徑5~10um，短徑2~4um，厚2~3um。葉肉細胞一般含50~200個葉綠體，占細胞質的40%。由外被（chloroplastenvelope）、類囊體（thylakoid）和基質（stroma）3部分組成。含有3種不同的膜：外膜、內膜、類囊體膜，3種彼此分開的腔：膜間隙、基質和類囊體腔。第49頁/共82頁第50頁/共82頁Chloroplast第51頁/共82頁雙層膜組成，膜間為10~20nm的間隙。外膜的滲透性大。內膜對通過物質的選擇性很強，CO2、O2、Pi、H2O、等可以透過內膜，ADP、ATP、NADP+、葡萄糖等及焦磷酸不能透過內膜，需要特殊的轉運體（translator）才能通過內膜。（一）葉綠體外被第52頁/共82頁是膜圍成的扁平囊。主要成分是蛋白質和脂類（60：40），不飽含脂肪酸含量高（約87%），膜流動性高?；＃罕馄叫∧叶询B而成，每個葉綠體含40~60個。基質類囊體：連接基粒的沒有堆疊的類囊體。膜的內在蛋白主要有：細胞色素b6／f復合體、集光復合體（LHC）、質體醌（PQ）、質體藍素（PC）、鐵氧化還原蛋白（FD）、黃素蛋白、光系統(tǒng)I、II復合物等。（二）類囊體第53頁/共82頁是內膜與類囊體之間的空間。主要成分包括：碳同化相關的酶類：如RuBP羧化酶占基質可溶性蛋白總量的60%。葉綠體DNA、蛋白質合成體系：如，ctDNA、各類RNA、核糖體等。一些顆粒成分：如淀粉粒、質體小球和植物鐵蛋白等。（三）基質第54頁/共82頁二、光合磷酸化作用機理首先光能轉化成電能，經電子傳遞產生ATP以及NADPH形式的不穩(wěn)定化學能，最終轉化成穩(wěn)定的化學能儲存在糖類化合物中。分為光反應和暗反應，前者需要光，涉及水的光解和光合磷酸化。后者不需要光，涉及CO2的固定，分為C3和C4兩類。第55頁/共82頁（一）光合色素和電子傳遞鏈組分1．光合色素包括：葉綠素、類胡蘿卜素，比例約為3:1。葉綠素分為a、b，比例約為3:1。全部葉綠素和幾乎所有的類胡蘿卜素都包埋在類囊體膜中，與蛋白質以非共價鍵結合。-CHOinchlb第56頁/共82頁2．集光復合體（LHC）由大約200個葉綠素分子和一些肽鏈構成。全部葉綠素b和大部分葉綠素a都是天線色素。第57頁/共82頁3．光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）：P680至少包括12條多肽鏈。位于基粒于基質非接觸區(qū)域的類囊體膜上。包括一個集光復合體Ⅱ、一個反應中心和一個含錳原子的放氧復合體（oxygenevolvingcomplex）。4．細胞色素b6/f復合體(cytb6/fcomplex)可能以二聚體形成存在，每個單體含有四個不同的亞基。5．光系統(tǒng)Ⅰ（PSI）：P700包含多條肽鏈，位于基粒與基質接觸區(qū)和基質類囊體膜中。由集光復合體I和作用中心構成。第58頁/共82頁非循環(huán)式光合磷酸化第59頁/共82頁循環(huán)式光合磷酸化第60頁/共82頁兩個光系統(tǒng)的協(xié)調作用第61頁/共82頁（二）光合磷酸化一對電子從P680經P700傳至NADP+，在類囊體腔中增加4個H+。2個來源于H2O光解，2個由PQ從基質轉移而來，在基質中一個H+又被用于還原NADP+，所以類囊體腔內有較高的H+（pH≈5，基質pH≈8），形成質子動力勢。H+經ATP合酶，滲入基質、推動ADP和Pi結合形成ATP。ATP合酶，即CF1-F0偶聯(lián)因子，結構類似于線粒體ATP合酶。第62頁/共82頁Electrontransportinthethylakoidmembrane第63頁/共82頁第64頁/共82頁線粒體與葉綠體的相似性：①均由兩層膜包被，內外膜的性質、結構有顯著的差異。②均為半自主性細胞器，具有自身的DNA及轉譯體系。因此綠色植物細胞內存在3個遺傳系統(tǒng)。③葉綠體的ctDNA不足以編碼葉綠體所需的全部蛋白質，因此必須依靠于核基因來編碼其余的蛋白質。通過定向轉運進入葉綠體的各部分。三、葉綠體的半自主性第65頁/共82頁第66頁/共82頁四、葉綠體的增殖在個體發(fā)育中葉綠體由原質體發(fā)育而來。在有光條件下原質體的小泡數(shù)目增加并融合形成片層，發(fā)育為基粒，形成葉綠體。在黑暗生長時，原質體小泡融合速度減慢，并轉變?yōu)榕帕谐删W格的三維晶格結構，稱為原片層，這種質體稱為黃色體。在有光下仍可發(fā)育為葉綠體。幼小葉綠體能靠分裂而增殖。成熟葉綠體一般不再分裂或很少分裂。第67頁/共82頁第68頁/共82頁第69頁/共82頁第三節(jié)線粒體與葉綠體的

蛋白質定向轉運第70頁/共82頁一、線粒體蛋白質的轉運線粒體具有1000多種蛋白質，其自身合成的僅十余種，因此大量蛋白質是在細胞質中合成的。利用標記氨基酸培養(yǎng)細胞，用氯霉素和放線菌酮分別抑制線粒體和細胞質蛋白質合成，發(fā)現(xiàn)人的線粒體DNA編碼的多肽為細胞色素c氧化酶的3個亞基，F(xiàn)0的2個亞基，NADH脫氫酶的7個亞基和細胞色素b等13條多肽。第71頁/共82頁線粒體前體蛋白質在在運輸以前，以未折疊的形式存在，N端有一段信號序列稱為導肽或引肽，完成轉運后被信號肽酶（signalpeptidase）切除，就成為成熟蛋白，這種現(xiàn)象就叫做后轉譯（posttranslation）。信號肽的特點是：多位于肽鏈的N端，由大約20個氨基酸構成；形成一個兩性α螺旋，帶正電荷的氨基酸殘基和不帶電荷的疏水氨基酸殘基分別位于螺旋的兩側；對所牽引的蛋白質沒有特異性要求。第72頁/共82頁MitochondrialerImport第73頁/共82頁蛋白質的轉運涉及轉位因子（translocator）等多種蛋白。TOM復合體：負責通過外膜，進入膜間隙。TIM復合體：TIM23負責將蛋白質轉運到基質，或安裝在內膜上；TIM22負責將某