現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室診斷在血液病學(xué)中的應(yīng)用及地位課件

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室診斷在血液病學(xué)中的應(yīng)用及地位課件第1頁/共63頁現(xiàn)狀臨床血液學(xué)和血液檢驗(yàn)是多縫交叉、實(shí)踐性強(qiáng)、發(fā)展迅速的學(xué)科。

隨著國內(nèi)外研究的不斷深入，使得血液病學(xué)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，如白血病亞型的研究，已深入到基因染色體甚至更微觀的領(lǐng)域。

臨床醫(yī)師無法通過肉眼判斷分型，治療方案，預(yù)后等重要問題。因此，檢驗(yàn)科室的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果就顯得尤為重要。第2頁/共63頁第3頁/共63頁診斷進(jìn)展過程

普通血細(xì)胞骨髓細(xì)胞涂片骨髓活檢細(xì)胞化學(xué)染色免疫學(xué)分子生物學(xué)流式細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞遺傳學(xué)第4頁/共63頁骨髓活檢能彌補(bǔ)骨髓穿刺的不足了解骨髓細(xì)胞的成分及原始細(xì)胞分布狀況能觀察細(xì)胞形態(tài)，便于做出病理診斷對再生障礙性貧血、骨髓異常增生癥的診斷具有重要意義另外對骨髓壞死、骨髓脂肪變也具診斷意義。第5頁/共63頁實(shí)驗(yàn)室檢查的意義現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室檢查闡明本質(zhì)及基礎(chǔ)分類治療推動(dòng)靶向性治療和個(gè)體化方案判斷預(yù)后第6頁/共63頁白血病分子檢測的臨床應(yīng)用

補(bǔ)充MIC檢查的不足

發(fā)現(xiàn)新的亞型監(jiān)測白血病的微小殘留病灶（MRD）為研究白血病的發(fā)病機(jī)制打下基礎(chǔ)第7頁/共63頁免疫學(xué)檢查：確定細(xì)胞系來源和分化

免疫學(xué)檢查：確定細(xì)胞系來源和分化

免疫表型兒童成人FABB-系早前-B-ALL普通-B-ALL前-B-ALL成熟-B-ALLT-系前T-ALLT-ALLCD19+HLA-DR+CD10-CD10+CD10+

CyIg

+CD10±

SIg

+CyCD3+，CD7+CD2-CD1a-sCD3CD2+CD5±CD8±CD4

±

885651531211176115110424717L1L2L1L2L1L3L1L2L1L2第8頁/共63頁P(yáng)CR方法檢測MRD常用的分子標(biāo)志第9頁/共63頁第10頁/共63頁第11頁/共63頁第12頁/共63頁AML1-ETOt(8;21)(q22;q22)6~8%原發(fā)性AML，在M2中的陽性率為20~40%，在M2b中陽性率為90%少見于M4和M1，極少見于MDS和骨髓增生綜合癥AML1-ETO+白血病細(xì)胞有一定程度的分化能力，能分化至較成熟的嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，且對化療反應(yīng)較敏感

AML1-ETO+患者對大劑量阿糖胞苷治療效果好，具有較高的緩解率，無病生存期長，預(yù)后較其他AML亞型（M3除外）好第13頁/共63頁AML1-ETO對初發(fā)患者進(jìn)行t(8;21)和AML1-ETO融合基因的檢測對其預(yù)后判斷及治療方案的制定相當(dāng)重要AML1-ETO定性結(jié)果不能用于評價(jià)患者M(jìn)RD情況RQ-PCR能實(shí)時(shí)反映體內(nèi)AML1-ETO水平。連續(xù)定量AML1-ETO轉(zhuǎn)錄本水平可判定有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者，以便及早治療干預(yù)以防血液學(xué)復(fù)發(fā)第14頁/共63頁第15頁/共63頁P(yáng)ML-RARαt(15;17)(q22;q21)，98%M3患者陽性繼t(15;17)之后，又先后發(fā)現(xiàn)4種M3特異的累及RARα的變異性染色體易位：t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)，dup(17)(q21.3;q23)，t(11;17)(q23;q21)

分別產(chǎn)生NPM-RARα，NuMA-RARα和PLZF-RARα，

STAT5b-RARα融合基因臨床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融合基因患者對ATRA治療不敏感，其余三種染色體易位患者經(jīng)ATRA治療可獲完全緩解

第16頁/共63頁第17頁/共63頁P(yáng)ML-RARαRT-PCR檢測PML-RARα是敏感且特異的APL診斷方法，還能用于治療后MRD監(jiān)測。PML-RARα陽性提示的分子復(fù)發(fā)常早于臨床復(fù)發(fā)3-6個(gè)月，為臨床采取進(jìn)一步治療措施提供了保障RQ-PCR能有效反映患者在發(fā)病、治療、緩解、復(fù)發(fā)整個(gè)過程的白血病細(xì)胞負(fù)荷，在MRD監(jiān)測中比RT-PCR具有更高價(jià)值

第18頁/共63頁第19頁/共63頁FLT3基因突變Fms-relatedtyrosinekinase3FLT3為III型受體酪氨酸激酶家族（還包括c-FMS，PDGFRβ和c-KIT）成員之一，該類受體因在造血過程中造血細(xì)胞的增殖和存活中發(fā)揮重要調(diào)控作用據(jù)報(bào)道，F(xiàn)LT3-ITD和D835突變在AML中陽性率分別為24%(385/1585)和7%(30/429)，總陽性率超過30%，使其成為AML中最普遍發(fā)生突變的靶基因許多臨床研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3突變還與臨床預(yù)后密切相關(guān)，尤對60歲以下的AML患者，F(xiàn)LT3突變患者預(yù)后較差，且可獨(dú)立于核型之外第20頁/共63頁CBFβ-MYH11inv(16)(p13;q22)及t(16;16)(p13;q22)主要見于M4Eo，10%不伴異常嗜酸細(xì)胞M4，少見于M2CBFβ-MYH11融合蛋白通過干擾核心結(jié)合因子（corebindingfactor,CBF）的轉(zhuǎn)錄激活作用而致病具有CBFβ-MYH11的患者對化療敏感，預(yù)后較好，故提高檢測率尤具臨床意義

第21頁/共63頁第22頁/共63頁DEK-CANt(6;9)(p23;q34)主要見于M2或M4，也見于M1，MDS-RAEB伴DEK-CAN的患者年齡一般較輕，且預(yù)后較差此類患者進(jìn)行分子監(jiān)測有助于判斷患者預(yù)后，調(diào)整治療方案

第23頁/共63頁WT-1基因高表達(dá)Wilmstumor1是無特異分子異常的急性白血病患者理想的MRD檢測指標(biāo)伴此基因高表達(dá)者預(yù)后差，且表達(dá)程度與預(yù)后相關(guān)第24頁/共63頁BCR-ABLt(9;22)(q34;q11)15~30%成人ALL及3~5%兒童ALL9號(hào)染色體的斷裂點(diǎn)與CML相同，但22號(hào)染色體斷裂點(diǎn)具有異質(zhì)性

此融合蛋白p190刺激細(xì)胞增殖的能力比p210要強(qiáng)。在轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中觀察到p190誘發(fā)的白血病具有起病早、發(fā)展快和惡性程度高的特點(diǎn)BCR-ABL+ALL患者預(yù)后差，5年存活率<20%，因此這些患者在緩解后需進(jìn)行骨髓移植治療

第25頁/共63頁BCR-ABL第26頁/共63頁BCR-ABL巢式RT-PCR檢測BCR-ABL融合基因用于CML移植患者移植后MRD監(jiān)測。可在患者血液學(xué)復(fù)發(fā)前的6~24個(gè)月骨髓檢測就呈陽性。RQ-PCR還能動(dòng)態(tài)觀察患者治療后BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本水平變化情況，反映療效。第27頁/共63頁第28頁/共63頁MLL相關(guān)融合基因累及MLL基因的分子異常見于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，還可見于治療相關(guān)白血病，尤接受topoisomeraseII抑制劑治療的患者M(jìn)LL基因涉及五十余種染色體易位，產(chǎn)生不同的融合蛋白，且每種融合蛋白都與特定的白血病表型相關(guān)。最常見的有：

t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因ALLt(9;11)(p22;q23)MLL-AF9融合基因AMLt(11;19)(p13;q23)MLL-ENL融合基因AML及ALL第29頁/共63頁血液病臨床分子標(biāo)志物檢測

(NHLALL)淋巴系統(tǒng)白血病Acutelymphoblasticleukemia(急性淋巴細(xì)胞白血病)Lymphoproliferativedisorders（淋巴性增生性疾?。㎝alignantlymphomas(惡性淋巴瘤)第30頁/共63頁檢測意義幫助診斷&鑒別診斷&早期治療預(yù)后提供有價(jià)值的基因組信息，指導(dǎo)臨床管理和治療方案的選擇第31頁/共63頁1.幫助診斷&鑒別診斷以及早期治療

檢測癌基因MYC8q24的易位是診斷Burkitt’s淋巴瘤的分子標(biāo)準(zhǔn)。

Burkitt’s

淋巴瘤是非常惡性的淋巴瘤需要盡早治療，但是通過常規(guī)病理學(xué)手段很難與其它淋巴瘤進(jìn)行鑒別診斷。第32頁/共63頁促進(jìn)診斷&鑒別診斷以及早期治療淋巴組織良、惡性疾病鑒別診斷淋巴瘤與淋巴組織增生性疾病相鑒別：分子標(biāo)記——IgH（FISH、PCR)I級(jí)濾泡性淋巴瘤（follicularlymphoma,FL）與濾泡增生為主要病理改變的淋巴結(jié)反應(yīng)性增生相鑒別：

分子標(biāo)記——t（14;18）（FISH、PCR）免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)第33頁/共63頁鑒別診斷淋巴瘤不同類型鑒別診斷套細(xì)胞淋巴瘤（mantlecelllymphoma,MCL）的母細(xì)胞亞型與其它大細(xì)胞性B細(xì)胞淋巴瘤，尤其是CD5陽性的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuselargeB-celllymphoma,DLBCL）相鑒別:分子標(biāo)記——t（11;14）（FISH、PCR）小細(xì)胞性B細(xì)胞淋巴瘤不同類型相鑒別,如FL，黏膜相關(guān)淋巴組織（mucosaassociatedlymphoidtissue,MALT）淋巴瘤與MCL:分子標(biāo)記——t（14;18），t（11;18），t（11;14）（FISH、PCR）第34頁/共63頁淋巴瘤同一類型不同亞型鑒別診斷DLBCL基因表達(dá)圖譜分為3個(gè)亞型：生發(fā)中心B細(xì)胞樣型（germinalcenterB-cell-like,GCB-DLBCL）：5年生存率59%，12q12拷貝數(shù)增加（FISH）活化B細(xì)胞樣型（activatedB-cell-like,ABC-DLBCL）：5年生存率30%，3號(hào)染色體三體/3q、18q21-22拷貝數(shù)增加/6q21-22缺失（FISH）原發(fā)縱隔型（primarymediastinal,PMBCL）：5年生存率64%，9p21-pter和2p14-16拷貝數(shù)增加（FISH）皮膚FL鑒別診斷：原發(fā)性皮膚FL：預(yù)后較好,罕見t（14;18）(FISH,PCR)全身系統(tǒng)性FL皮膚表現(xiàn)：預(yù)后較差,多見t（14;18）(FISH,PCR)MALT2個(gè)分子細(xì)胞遺傳學(xué)亞型：t（11;18）陰性：不易向高級(jí)別轉(zhuǎn)化、臨床分期較早、對幽門螺旋桿菌（Hp）根除治療效果較好(FISH,PCR)t（11;18）陽性：臨床分期較晚、侵襲性增強(qiáng)、對Hp根除治療效果不佳(FISH,PCR)第35頁/共63頁第36頁/共63頁第37頁/共63頁第38頁/共63頁第39頁/共63頁第40頁/共63頁第41頁/共63頁染色體和基因改變

染色體異常

受累基因常見白血病類型

t(8;21)(q22;q22)t(15;17)(q22;q21)t(11;17)(23;21)

inv(16)(p13;q22)t(16;16)(p13;q22)t(variable;11q23)t(8;14)(q24;q43)t(9;22)(q34;q11)AML1-ETOPML-RARαPLZF-RARαCBFβ-MYH11CBFβ-MYH11MLL

M2M3M3M4EOM4EOM4/M5or其他

L3CML,ALL,AML第42頁/共63頁微小殘留病Minimalresidualdisease(MRD)---微小殘留病

指白血病誘導(dǎo)化療完全緩解后或者骨髓移植后殘留在體內(nèi)少

量白血病細(xì)胞的狀態(tài),可能是導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的根源

白血病細(xì)胞負(fù)荷

初次診斷---1012

形態(tài)學(xué)緩解---1010以下

分子學(xué)緩解---約106-107第43頁/共63頁檢測MRD的意義根據(jù)細(xì)胞負(fù)荷調(diào)整緩解后化療方案更早發(fā)現(xiàn)藥物耐藥性更早預(yù)測白血病復(fù)發(fā)評價(jià)骨髓移植凈化效果為實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)第44頁/共63頁MRD主要檢測方法一、染色體核型分析二、熒光原位雜交---FISH三、流式細(xì)胞儀---FCM四、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)---PCR五、其他：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，免疫熒光等第45頁/共63頁染色體核型分析常用染色體顯帶技術(shù)檢測出染色體畸變,但其成功率依賴于標(biāo)本中分裂象細(xì)胞的數(shù)量多少，從而使得檢測結(jié)果各不相同，且敏感度較低，約1：20

第46頁/共63頁FISHfluorescenceinsituhybridization

用熒光素標(biāo)記染色體特異性探針和特異性基因的DNA探針，通過與間期細(xì)胞核DNA或中期染色體DNA原位雜交識(shí)別染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常，可以進(jìn)行定性、定位和相對定量分析。優(yōu)點(diǎn)：FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn),不但能顯示中期分裂相,還能顯示于間期核.

第47頁/共63頁InterphaseandmetaphaseFISHdemonstratingavariantofthePhiladelphiachromosome.Thegenesthatarerearrangedare:BCR(greenonchromosome22)/ABL(orangeonchromosome9)

ThePh’translocationappearsasdualfusion(yellow)signals.第48頁/共63頁RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)利用染色體易位形成的腫瘤特異融合基因或基因重排作為分子靶，在引物作用下，通過聚合酶鏈反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)將特異性序列擴(kuò)增百萬倍，然后用凝膠電泳顯示出來優(yōu)點(diǎn)：特異性、靈敏度大大提高（可達(dá)10-5—10-6）第49頁/共63頁QRT-PCR---熒光實(shí)時(shí)定量PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具目前real-timeQ-PCR實(shí)驗(yàn)成本比較高，且各實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)不一，從而也限制了其廣泛的應(yīng)用。第50頁/共63頁第51頁/共63頁MRD檢測在AML中的應(yīng)用評價(jià)AML治療預(yù)后因素誘導(dǎo)治療后白血病細(xì)胞負(fù)荷減少程度及達(dá)到CR時(shí)間被認(rèn)為是提示預(yù)后的獨(dú)立因素MRD檢測目的：預(yù)示分子學(xué)復(fù)發(fā)，盡早解救治療第52頁/共63頁鞏固治療結(jié)束后MRD檢測及其意義方法的標(biāo)準(zhǔn)化：在有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，用低敏感（10-4）RT-PCR方法PML/RARα（+）定義：指在完成鞏固治療后，間隔4周的二次骨髓標(biāo)本，在兩個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)方案鞏固治療：MCR可達(dá)90%-99%MDR檢測結(jié)果決定后續(xù)治療選擇第53頁/共63頁維持治療期間和以后的MRD監(jiān)測MRD監(jiān)測適合于高危組患者，低危組患者似乎不需要監(jiān)測目前推薦：高危組患者鞏固治療后1年內(nèi)每1-2個(gè)月檢測1次，第2、3年每3個(gè)月1次目前常用非定量RT-PCR，Q-RT-PCR的臨床應(yīng)用價(jià)值有待確定，但認(rèn)為動(dòng)態(tài)監(jiān)測融合基因定量變化可為評估預(yù)后提供有益信息，便于調(diào)整治療方案鞏固治療后RT-PCR持續(xù)陰性與長期生存密切相關(guān)一旦轉(zhuǎn)為陽性提示即將血液學(xué)復(fù)發(fā)，需及時(shí)治療第54頁/共63頁22號(hào)染色體9號(hào)染色體BCRABL113或