現(xiàn)代實驗室診斷在血液病學中的應用及地位課件

現(xiàn)代實驗室診斷在血液病學中的應用及地位課件第1頁/共63頁現(xiàn)狀臨床血液學和血液檢驗是多縫交叉、實踐性強、發(fā)展迅速的學科。

隨著國內外研究的不斷深入，使得血液病學有了突飛猛進的發(fā)展，如白血病亞型的研究，已深入到基因染色體甚至更微觀的領域。

臨床醫(yī)師無法通過肉眼判斷分型，治療方案，預后等重要問題。因此，檢驗科室的實驗室結果就顯得尤為重要。第2頁/共63頁第3頁/共63頁診斷進展過程

普通血細胞骨髓細胞涂片骨髓活檢細胞化學染色免疫學分子生物學流式細胞技術細胞遺傳學第4頁/共63頁骨髓活檢能彌補骨髓穿刺的不足了解骨髓細胞的成分及原始細胞分布狀況能觀察細胞形態(tài)，便于做出病理診斷對再生障礙性貧血、骨髓異常增生癥的診斷具有重要意義另外對骨髓壞死、骨髓脂肪變也具診斷意義。第5頁/共63頁實驗室檢查的意義現(xiàn)代實驗室檢查闡明本質及基礎分類治療推動靶向性治療和個體化方案判斷預后第6頁/共63頁白血病分子檢測的臨床應用

補充MIC檢查的不足

發(fā)現(xiàn)新的亞型監(jiān)測白血病的微小殘留病灶（MRD）為研究白血病的發(fā)病機制打下基礎第7頁/共63頁免疫學檢查：確定細胞系來源和分化

免疫學檢查：確定細胞系來源和分化

免疫表型兒童成人FABB-系早前-B-ALL普通-B-ALL前-B-ALL成熟-B-ALLT-系前T-ALLT-ALLCD19+HLA-DR+CD10-CD10+CD10+

CyIg

+CD10±

SIg

+CyCD3+，CD7+CD2-CD1a-sCD3CD2+CD5±CD8±CD4

±

885651531211176115110424717L1L2L1L2L1L3L1L2L1L2第8頁/共63頁PCR方法檢測MRD常用的分子標志第9頁/共63頁第10頁/共63頁第11頁/共63頁第12頁/共63頁AML1-ETOt(8;21)(q22;q22)6~8%原發(fā)性AML，在M2中的陽性率為20~40%，在M2b中陽性率為90%少見于M4和M1，極少見于MDS和骨髓增生綜合癥AML1-ETO+白血病細胞有一定程度的分化能力，能分化至較成熟的嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，且對化療反應較敏感

AML1-ETO+患者對大劑量阿糖胞苷治療效果好，具有較高的緩解率，無病生存期長，預后較其他AML亞型（M3除外）好第13頁/共63頁AML1-ETO對初發(fā)患者進行t(8;21)和AML1-ETO融合基因的檢測對其預后判斷及治療方案的制定相當重要AML1-ETO定性結果不能用于評價患者MRD情況RQ-PCR能實時反映體內AML1-ETO水平。連續(xù)定量AML1-ETO轉錄本水平可判定有高復發(fā)風險的患者，以便及早治療干預以防血液學復發(fā)第14頁/共63頁第15頁/共63頁PML-RARαt(15;17)(q22;q21)，98%M3患者陽性繼t(15;17)之后，又先后發(fā)現(xiàn)4種M3特異的累及RARα的變異性染色體易位：t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)，dup(17)(q21.3;q23)，t(11;17)(q23;q21)

分別產(chǎn)生NPM-RARα，NuMA-RARα和PLZF-RARα，

STAT5b-RARα融合基因臨床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融合基因患者對ATRA治療不敏感，其余三種染色體易位患者經(jīng)ATRA治療可獲完全緩解

第16頁/共63頁第17頁/共63頁PML-RARαRT-PCR檢測PML-RARα是敏感且特異的APL診斷方法，還能用于治療后MRD監(jiān)測。PML-RARα陽性提示的分子復發(fā)常早于臨床復發(fā)3-6個月，為臨床采取進一步治療措施提供了保障RQ-PCR能有效反映患者在發(fā)病、治療、緩解、復發(fā)整個過程的白血病細胞負荷，在MRD監(jiān)測中比RT-PCR具有更高價值

第18頁/共63頁第19頁/共63頁FLT3基因突變Fms-relatedtyrosinekinase3FLT3為III型受體酪氨酸激酶家族（還包括c-FMS，PDGFRβ和c-KIT）成員之一，該類受體因在造血過程中造血細胞的增殖和存活中發(fā)揮重要調控作用據(jù)報道，F(xiàn)LT3-ITD和D835突變在AML中陽性率分別為24%(385/1585)和7%(30/429)，總陽性率超過30%，使其成為AML中最普遍發(fā)生突變的靶基因許多臨床研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3突變還與臨床預后密切相關，尤對60歲以下的AML患者，F(xiàn)LT3突變患者預后較差，且可獨立于核型之外第20頁/共63頁CBFβ-MYH11inv(16)(p13;q22)及t(16;16)(p13;q22)主要見于M4Eo，10%不伴異常嗜酸細胞M4，少見于M2CBFβ-MYH11融合蛋白通過干擾核心結合因子（corebindingfactor,CBF）的轉錄激活作用而致病具有CBFβ-MYH11的患者對化療敏感，預后較好，故提高檢測率尤具臨床意義

第21頁/共63頁第22頁/共63頁DEK-CANt(6;9)(p23;q34)主要見于M2或M4，也見于M1，MDS-RAEB伴DEK-CAN的患者年齡一般較輕，且預后較差此類患者進行分子監(jiān)測有助于判斷患者預后，調整治療方案

第23頁/共63頁WT-1基因高表達Wilmstumor1是無特異分子異常的急性白血病患者理想的MRD檢測指標伴此基因高表達者預后差，且表達程度與預后相關第24頁/共63頁BCR-ABLt(9;22)(q34;q11)15~30%成人ALL及3~5%兒童ALL9號染色體的斷裂點與CML相同，但22號染色體斷裂點具有異質性

此融合蛋白p190刺激細胞增殖的能力比p210要強。在轉基因試驗中觀察到p190誘發(fā)的白血病具有起病早、發(fā)展快和惡性程度高的特點BCR-ABL+ALL患者預后差，5年存活率<20%，因此這些患者在緩解后需進行骨髓移植治療

第25頁/共63頁BCR-ABL第26頁/共63頁BCR-ABL巢式RT-PCR檢測BCR-ABL融合基因用于CML移植患者移植后MRD監(jiān)測?？稍诨颊哐簩W復發(fā)前的6~24個月骨髓檢測就呈陽性。RQ-PCR還能動態(tài)觀察患者治療后BCR-ABL轉錄本水平變化情況，反映療效。第27頁/共63頁第28頁/共63頁MLL相關融合基因累及MLL基因的分子異常見于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，還可見于治療相關白血病，尤接受topoisomeraseII抑制劑治療的患者MLL基因涉及五十余種染色體易位，產(chǎn)生不同的融合蛋白，且每種融合蛋白都與特定的白血病表型相關。最常見的有：

t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因ALLt(9;11)(p22;q23)MLL-AF9融合基因AMLt(11;19)(p13;q23)MLL-ENL融合基因AML及ALL第29頁/共63頁血液病臨床分子標志物檢測

(NHLALL)淋巴系統(tǒng)白血病Acutelymphoblasticleukemia(急性淋巴細胞白血病)Lymphoproliferativedisorders（淋巴性增生性疾?。㎝alignantlymphomas(惡性淋巴瘤)第30頁/共63頁檢測意義幫助診斷&鑒別診斷&早期治療預后提供有價值的基因組信息，指導臨床管理和治療方案的選擇第31頁/共63頁1.幫助診斷&鑒別診斷以及早期治療

檢測癌基因MYC8q24的易位是診斷Burkitt’s淋巴瘤的分子標準。

Burkitt’s

淋巴瘤是非常惡性的淋巴瘤需要盡早治療，但是通過常規(guī)病理學手段很難與其它淋巴瘤進行鑒別診斷。第32頁/共63頁促進診斷&鑒別診斷以及早期治療淋巴組織良、惡性疾病鑒別診斷淋巴瘤與淋巴組織增生性疾病相鑒別：分子標記——IgH（FISH、PCR)I級濾泡性淋巴瘤（follicularlymphoma,FL）與濾泡增生為主要病理改變的淋巴結反應性增生相鑒別：

分子標記——t（14;18）（FISH、PCR）免疫組化、流式細胞術第33頁/共63頁鑒別診斷淋巴瘤不同類型鑒別診斷套細胞淋巴瘤（mantlecelllymphoma,MCL）的母細胞亞型與其它大細胞性B細胞淋巴瘤，尤其是CD5陽性的彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuselargeB-celllymphoma,DLBCL）相鑒別:分子標記——t（11;14）（FISH、PCR）小細胞性B細胞淋巴瘤不同類型相鑒別,如FL，黏膜相關淋巴組織（mucosaassociatedlymphoidtissue,MALT）淋巴瘤與MCL:分子標記——t（14;18），t（11;18），t（11;14）（FISH、PCR）第34頁/共63頁淋巴瘤同一類型不同亞型鑒別診斷DLBCL基因表達圖譜分為3個亞型：生發(fā)中心B細胞樣型（germinalcenterB-cell-like,GCB-DLBCL）：5年生存率59%，12q12拷貝數(shù)增加（FISH）活化B細胞樣型（activatedB-cell-like,ABC-DLBCL）：5年生存率30%，3號染色體三體/3q、18q21-22拷貝數(shù)增加/6q21-22缺失（FISH）原發(fā)縱隔型（primarymediastinal,PMBCL）：5年生存率64%，9p21-pter和2p14-16拷貝數(shù)增加（FISH）皮膚FL鑒別診斷：原發(fā)性皮膚FL：預后較好,罕見t（14;18）(FISH,PCR)全身系統(tǒng)性FL皮膚表現(xiàn)：預后較差,多見t（14;18）(FISH,PCR)MALT2個分子細胞遺傳學亞型：t（11;18）陰性：不易向高級別轉化、臨床分期較早、對幽門螺旋桿菌（Hp）根除治療效果較好(FISH,PCR)t（11;18）陽性：臨床分期較晚、侵襲性增強、對Hp根除治療效果不佳(FISH,PCR)第35頁/共63頁第36頁/共63頁第37頁/共63頁第38頁/共63頁第39頁/共63頁第40頁/共63頁第41頁/共63頁染色體和基因改變

染色體異常

受累基因常見白血病類型

t(8;21)(q22;q22)t(15;17)(q22;q21)t(11;17)(23;21)

inv(16)(p13;q22)t(16;16)(p13;q22)t(variable;11q23)t(8;14)(q24;q43)t(9;22)(q34;q11)AML1-ETOPML-RARαPLZF-RARαCBFβ-MYH11CBFβ-MYH11MLL

M2M3M3M4EOM4EOM4/M5or其他

L3CML,ALL,AML第42頁/共63頁微小殘留病Minimalresidualdisease(MRD)---微小殘留病

指白血病誘導化療完全緩解后或者骨髓移植后殘留在體內少

量白血病細胞的狀態(tài),可能是導致白血病復發(fā)的根源

白血病細胞負荷

初次診斷---1012

形態(tài)學緩解---1010以下

分子學緩解---約106-107第43頁/共63頁檢測MRD的意義根據(jù)細胞負荷調整緩解后化療方案更早發(fā)現(xiàn)藥物耐藥性更早預測白血病復發(fā)評價骨髓移植凈化效果為實驗研究提供依據(jù)第44頁/共63頁MRD主要檢測方法一、染色體核型分析二、熒光原位雜交---FISH三、流式細胞儀---FCM四、聚合酶鏈反應技術---PCR五、其他：細胞培養(yǎng)技術，免疫熒光等第45頁/共63頁染色體核型分析常用染色體顯帶技術檢測出染色體畸變,但其成功率依賴于標本中分裂象細胞的數(shù)量多少，從而使得檢測結果各不相同，且敏感度較低，約1：20

第46頁/共63頁FISHfluorescenceinsituhybridization

用熒光素標記染色體特異性探針和特異性基因的DNA探針，通過與間期細胞核DNA或中期染色體DNA原位雜交識別染色體數(shù)目和結構的異常，可以進行定性、定位和相對定量分析。優(yōu)點：FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點,不但能顯示中期分裂相,還能顯示于間期核.

第47頁/共63頁InterphaseandmetaphaseFISHdemonstratingavariantofthePhiladelphiachromosome.Thegenesthatarerearrangedare:BCR(greenonchromosome22)/ABL(orangeonchromosome9)

ThePh’translocationappearsasdualfusion(yellow)signals.第48頁/共63頁RT-PCR逆轉錄聚合酶鏈反應技術利用染色體易位形成的腫瘤特異融合基因或基因重排作為分子靶，在引物作用下，通過聚合酶鏈反應，短時間內將特異性序列擴增百萬倍，然后用凝膠電泳顯示出來優(yōu)點：特異性、靈敏度大大提高（可達10-5—10-6）第49頁/共63頁QRT-PCR---熒光實時定量PCR在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點成為了分子生物學研究中的重要工具目前real-timeQ-PCR實驗成本比較高，且各實驗室標準不一，從而也限制了其廣泛的應用。第50頁/共63頁第51頁/共63頁MRD檢測在AML中的應用評價AML治療預后因素誘導治療后白血病細胞負荷減少程度及達到CR時間被認為是提示預后的獨立因素MRD檢測目的：預示分子學復發(fā)，盡早解救治療第52頁/共63頁鞏固治療結束后MRD檢測及其意義方法的標準化：在有經(jīng)驗的實驗室，用低敏感（10-4）RT-PCR方法PML/RARα（+）定義：指在完成鞏固治療后，間隔4周的二次骨髓標本，在兩個有經(jīng)驗的實驗室證實標準方案鞏固治療：MCR可達90%-99%MDR檢測結果決定后續(xù)治療選擇第53頁/共63頁維持治療期間和以后的MRD監(jiān)測MRD監(jiān)測適合于高危組患者，低危組患者似乎不需要監(jiān)測目前推薦：高危組患者鞏固治療后1年內每1-2個月檢測1次，第2、3年每3個月1次目前常用非定量RT-PCR，Q-RT-PCR的臨床應用價值有待確定，但認為動態(tài)監(jiān)測融合基因定量變化可為評估預后提供有益信息，便于調整治療方案鞏固治療后RT-PCR持續(xù)陰性與長期生存密切相關一旦轉為陽性提示即將血液學復發(fā)，需及時治療第54頁/共63頁22號染色體9號染色體BCRABL113或