藥物分析第十六章抗生素類藥物的分析

藥物分析第十六章抗生素類藥物的分析1第1頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二Contents概述1β-內(nèi)酰胺類2氨基糖苷類3四環(huán)素類4高分子雜質(zhì)檢查52第2頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)概述在低微濃度下即可對某些生物（病原微生物）的生命活動有特異抑制作用的化學(xué)物質(zhì)的總稱定義3第3頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二4第4頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二抗生素藥物的分類5第5頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二6第6頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二7第7頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二抗菌藥物的主要作用部位喹諾酮類林可霉素類氨基糖苷類酮康唑環(huán)絲氨酸利福平紅霉素制霉菌素桿菌肽甲氧芐胺嘧啶四環(huán)素類兩性霉素B萬古霉素磺胺藥氯霉素多粘菌素類β-內(nèi)酰胺類核酸合成細胞蛋白合成細胞膜滲透性細胞壁8第8頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二細菌的耐藥機制9第9頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二細菌的耐藥機制產(chǎn)生鈍化酶使抗菌藥物失效藥物作用靶位的結(jié)構(gòu)和數(shù)量改變——抗菌藥不易與細菌結(jié)合主動外排機制——藥物被泵出菌體外10第10頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二產(chǎn)品穩(wěn)定性差分子結(jié)構(gòu)大多不穩(wěn)定，降解后療效下降、失效或增加毒副作用發(fā)酵過程不易控制易受污染生產(chǎn)工藝復(fù)雜發(fā)酵液中雜質(zhì)

無機鹽、脂肪、各種蛋白質(zhì)、各種降解產(chǎn)物、色素、熱原、毒性物質(zhì)

抗生素質(zhì)量的復(fù)雜性11第11頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二

鑒別：理化方法(主要方法)、微生物法官能團的顯色反應(yīng)，如：β-內(nèi)酰胺環(huán)的羥肟酸鐵反應(yīng)；鏈霉素的麥芽酚反應(yīng)、坂口反應(yīng)；光譜法：紅外光譜及紫外吸收光譜的鑒別。色譜法：HPLC和TLC法，采用標準品對照品對照法；生物學(xué)法：比較抑菌能力，現(xiàn)已少用。抗生素質(zhì)量分析12第12頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二

檢查：影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項目：結(jié)晶性、酸堿度、水分或者干燥失重等控制有機和無機雜質(zhì)的項目：溶液澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘渣、重金屬等；與臨床安全性有關(guān)的檢查項目：異常毒性、熱源或細菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、無菌等13第13頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二

效價：每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。由單位（u）或微克（μg）表示。各種抗生素的效價基準是人們?yōu)榱松a(chǎn)科研方便而規(guī)定的。

1mg青霉素鈉定為1670單位；1mg慶大霉素定為590單位。相應(yīng)的鹽可以通過分子量與標準鹽類進行換算。抗生素活性表示方法14第14頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二含量/效價測定：

微生物法：與臨床療效吻合,靈敏度高，結(jié)果直觀，適用范圍廣；但操作復(fù)雜費時，誤差大

理化方法：準確度與專屬性較高,且操作簡便；但與臨床療效有偏差15第15頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類6-aminopenicillanicacid簡稱6-APA青霉素類7-aminocephalosporanicacid,簡稱7-ACA頭孢菌素類氫化噻唑環(huán)氫化噻嗪環(huán)＊＊＊＊16第16頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類青霉素(芐青霉素)(penicillins)氨芐西林阿莫西林17第17頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類頭孢氨芐頭孢拉定頭孢羥氨芐頭孢噻吩鈉18第18頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類1.酸性（羧基）

pKa2.5-2.8，酸性較強。堿金屬鹽水溶性好，有機堿鹽難溶于水。2.手性C（旋光性）﹡﹡﹡﹡﹡19第19頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類3.UV青霉素類：苯環(huán)取代基頭孢菌素類：母核有共軛結(jié)構(gòu)260nm20第20頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二4.β–內(nèi)酰胺環(huán)(四元環(huán)張力+酰胺鍵)第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定某些氧化劑、金屬離子、溫度21第21頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類(一)色譜法HPLC(tR)TLC(Rf)(二)光譜法IRUVNMR22第22頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類23第23頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類(三)呈色反應(yīng)1）羥肟酸鐵反應(yīng)——β–內(nèi)酰胺環(huán)β–內(nèi)酰胺類NH2OH·HClNaOH羥肟酸

Fe3+H+顯色（紅、棕、褐）2）類似肽鍵（-CONH-）a.茚三酮反應(yīng)——α-氨基24第24頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類b.雙縮脲反應(yīng)——β–內(nèi)酰胺類堿性酒石酸銅紫色25第25頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類3）其他呈色反應(yīng)（偶合）青霉素鉀和青霉素鈉呈紅棕色(四)各種鹽的反應(yīng)焰色反應(yīng)——K+、Na+26第26頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類(聚合物、有關(guān)物質(zhì)、異構(gòu)體等)1.聚合物頭孢他啶中聚合物測定—分子排阻色譜凝膠色譜分子篩機制主成分自身對照法面積歸一化法限量法自身對照外標法

萄聚糖凝膠立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖27第27頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類2.有關(guān)物質(zhì)與異構(gòu)體頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查

取本品適量，精密稱定，加流動相制成約含0.25mg/ml的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動相制成2.5g/ml的溶液，作為對照溶液。取對照溶液20l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10%，再取供試品溶液和對照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的3.5倍，供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，其中E異構(gòu)體峰面積不得大于對照溶液主峰面積之和(1.0%)，△3-異構(gòu)體峰面積不得大于1.5倍(1.5%)，其余單個雜質(zhì)峰面積的和不得大于3倍(3.0%)。(供試品溶液中任何小于對照品溶液主峰面積之和0.05倍的峰可忽略不計)28第28頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二青霉素鈉(鉀)的吸光度檢查：本品加水制成每1mL含有1.80mg的溶液，照UV-Vis法，在280nm波長處測定吸光度，不得大于0.10；在264nm波長處有最大吸收，吸光度應(yīng)為0.80-0.88.該法264nm處吸收值用來控制青霉素鈉(鉀)的含量，280nm處吸收值用來控制雜質(zhì)的含量。3.UV第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類29第29頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類4.有機溶劑：用GC法或者HPLC法5.結(jié)晶性第一法(偏光顯微鏡法)第二法(X射線粉末衍射法)30第30頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二碘量法汞量法酸堿滴定法羥肟酸比色法

HPLC法第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類31第31頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二阿莫西林克拉維酸鉀片色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉7.8g，加水900ml溶解，用磷酸或10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.4±0.1，加水稀釋至1000ml)-甲醇(95:5)為流動相；流速為0.7ml/min；檢測波長為220nm。阿莫西林峰與克拉維酸峰的分離度應(yīng)大于3.5

測定法

取本品10片，置1000ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿莫西林對照品與克拉維酸對照品各適量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉維酸0.25mg的混合溶液，同法測定。按外標法以峰面積分別計算供試品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類32第32頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)氨基糖苷類堿性環(huán)己多元醇+氨基糖→苷鏈霉素(Streptomycin)33第33頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二巴龍霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脫氧鏈霉胺巴龍胺D－核糖巴龍霉糖巴龍二糖胺第三節(jié)氨基糖苷類34第34頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二慶大霉素(Gentamycin)35第35頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二1）溶解度（氨基、羥基）：水溶性2）堿性（氨基）：臨床應(yīng)用其硫酸鹽；溶于水，但不溶于有機溶劑；3）旋光性（糖）：多個手性碳4）穩(wěn)定性（苷）：強酸、堿條件均可水解；臨床使用時對pH值有很高的要求；5）紫外吸收光譜第三節(jié)氨基糖苷類36第36頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二1.茚三酮反應(yīng)——羥基胺類,α-氨基酸△第三節(jié)氨基糖苷類37第37頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二2.Molisch試驗——五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)紅紫色羥甲基糠醛(含六碳糖結(jié)構(gòu)氨基糖苷類酸性水解產(chǎn)物)a.α-萘酚b.萘酮藍紫色第三節(jié)氨基糖苷類38第38頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二3.N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)（Elson-Morgan反應(yīng)）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紅色第三節(jié)氨基糖苷類39第39頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二4.麥芽酚反應(yīng)——鏈霉糖特有反應(yīng)H+第三節(jié)氨基糖苷類40第40頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二紫紅麥芽酚41第41頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二5.坂口反應(yīng)——鏈霉胍特有反應(yīng)（或α-萘酚）42第42頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二坂口反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)第三節(jié)氨基糖苷類43第43頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二6.硫酸鹽反應(yīng)7.色譜法：TLC和HPLC法8.光譜法：IR、UV第三節(jié)氨基糖苷類44第44頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二1.鏈霉素中鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）的檢查來源：發(fā)酵中產(chǎn)生方法：TLC中的對照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的檢查(TLC)3.慶大霉素C組分的測定第三節(jié)氨基糖苷類45第45頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二微生物檢定法平行反應(yīng)，檢測同等量下供試品和對照品對微生物的抑制作用；管碟法：利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，比較標準品和供試品對菌群產(chǎn)生的抑菌圈大??；濁度法：通過抗生素在液體培養(yǎng)基中對細菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品和供試品抑菌程度，測定供試品效價；--該法優(yōu)點：靈敏度高、量少、直觀；與臨床要求一直；使用范圍廣；是效價測定的最基本方法；目前分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多組分抗生素，首選該法測效價。--該法缺陷：操作步驟多，時間長，誤差大。第三節(jié)氨基糖苷類46第46頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二HPLC法有紫外吸收—紫外、熒光檢測器無紫外吸收—衍生化；電化學(xué)檢測器或蒸發(fā)光散射法第三節(jié)氨基糖苷類47第47頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二第四節(jié)四環(huán)素類ABCD123456789101112四個并苯或萘并萘48第48頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二1）兩性：

-OH→酸性N(CH3)2→堿性

Ca2+、Mg2+生成不溶性鹽；Fe3+形成紅色配合物；Al3+形成黃色配合物；pH3~7.5多價陽離子與酚二酮→熒光

與酸、堿均可成鹽；臨床多用鹽酸鹽；強酸或強堿中溶解度↑

2）旋光性3）與金屬離子絡(luò)合(酚羥基、烯醇基)第四節(jié)四環(huán)素類49第49頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二4）UV和熒光鹽酸土霉素經(jīng)酸或堿降解，呈綠色熒光，加熱轉(zhuǎn)為藍色；鹽酸金霉素經(jīng)堿降解，呈藍色熒光；鹽酸四環(huán)素經(jīng)堿降解，呈黃色熒光?？蓞^(qū)別不同四環(huán)素類抗生素50第50頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二弱酸性（pH2-6）A環(huán)C-4異構(gòu)化差向四環(huán)素酸性（pH<2）C環(huán)脫水脫水四環(huán)素堿性C環(huán)開環(huán)，形成內(nèi)酯異四環(huán)素5）不穩(wěn)定性A.差向異構(gòu)化藍色熒光淡黃→黑第四節(jié)四環(huán)素類51第51頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二AApH2.0~6.0（氫鍵，土霉素、多西環(huán)素不易差向異構(gòu)化）第四節(jié)四環(huán)素類52第52頁，共59頁，2023年，2月20日，星期二B.酸性脫水降解λmax=445nmλmax=