(3.3)-培養(yǎng)基制備技術(shù)衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法與技能

培養(yǎng)基的制備技術(shù)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．掌握常用培養(yǎng)基制備的基本過程。2．熟悉常用培養(yǎng)基的種類及用途。3.熟悉高壓蒸汽滅菌器及使用方法。【器材和試劑】試劑：營養(yǎng)肉湯，營養(yǎng)瓊脂，瓊脂粉，蒸餾水等。器材：電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、電爐、三角燒瓶、量筒、試管、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、玻璃棒、超凈臺(tái)、試管架、稱量紙等?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.基礎(chǔ)培養(yǎng)基（包括液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、斜面及平板培養(yǎng)基）制備。2.高壓蒸汽滅菌器的使用。一、培養(yǎng)基的種類1.按用途分類基礎(chǔ)培養(yǎng)基：僅含細(xì)菌生長繁殖所需的最基本成分。營養(yǎng)培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加某些營養(yǎng)物質(zhì)。選擇培養(yǎng)基：除營養(yǎng)成分以外，還添加了某些抑制物質(zhì)。鑒別培養(yǎng)基：添加了某些特定的作用底物和指示劑。增菌培養(yǎng)基：一般均含有抑制劑。厭氧培養(yǎng)基：如庖肉培養(yǎng)基。2.按物理性狀分類液體培養(yǎng)基：不含凝固劑，用于增菌和接種純種細(xì)菌。半固體培養(yǎng)基：含0.5％～1％瓊脂。用于觀察細(xì)菌動(dòng)力、保存菌種。固體培養(yǎng)基：平板、斜面。含1.5％～2.5％瓊脂。平板：用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)。斜面：用于純培養(yǎng)、保存菌種。二、培養(yǎng)基制備的基本過程調(diào)配溶解矯正pH過濾澄清分裝滅菌檢定保存斜面擺放平板傾注（一）調(diào)配按照培養(yǎng)基配方正確稱取各種原料。用量筒量取所需蒸餾水量。注意事項(xiàng)稱量準(zhǔn)確。（二）溶解在三角燒瓶中先加入少量蒸餾水，再加入稱量好的各種原料，以防培養(yǎng)基干粉粘瓶底燒結(jié)。玻棒攪勻，加熱溶解，補(bǔ)足水量。注意事項(xiàng)容器的材質(zhì)：可選用玻璃、搪瓷，不可用鐵、銅容器。培養(yǎng)基中需加染料、膽鹽、指示劑等，應(yīng)在校正pH后加入。（三）矯正pH將培養(yǎng)基調(diào)至其規(guī)定的pH值。調(diào)整pH的方法可用pH試紙，也可用pH計(jì)。（四）過濾澄清調(diào)整pH后，于沸水中加熱5~10min后進(jìn)行。用濾紙或雙層紗布過濾。注意事項(xiàng)若培養(yǎng)基無明顯沉淀或渾濁，則無需過濾澄清。（五）分裝液體、半固體、斜面培養(yǎng)基：滅菌前分裝于試管，加塞。制備平板的培養(yǎng)基：分裝于三角燒瓶，加塞高壓。滅菌后冷卻50℃左右，無菌操作傾注滅菌平皿內(nèi)。注意事項(xiàng)注意分裝量。塞好硅膠塞的試管和三角燒瓶應(yīng)蓋上牛皮紙用繩捆扎，準(zhǔn)備滅菌。1、分裝包扎2、分裝量的要求液體培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的1/4～1/3，加塞后滅菌直立；半固體培養(yǎng)基分裝量為試管高度的1/4～1/3，加塞后滅菌趁熱直立凝固；斜面培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的1/4～1/3，加塞后滅菌，趁熱擺成斜面；制備平板的培養(yǎng)基分裝量不宜超過容器的2/3，以免滅菌時(shí)溢出。（六）培養(yǎng)基滅菌耐熱培養(yǎng)基：如普通營養(yǎng)瓊脂平板常用高壓蒸汽滅菌，條件為121.3℃，15-30min；不耐熱培養(yǎng)基：如糖類、明膠和牛乳等含糖培養(yǎng)基以110-115℃，10-15min；富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基用血清凝固器滅菌；對(duì)含高營養(yǎng)不耐熱培養(yǎng)基：如血清,細(xì)胞培養(yǎng)液等用濾過除菌。1、滅菌后斜面擺放斜面長度約為試管長度的1/2，且下端有1cm柱高；先將滅菌瓊脂融化后冷卻至50℃左右，以無菌操作傾注于滅菌平皿內(nèi)，水平旋轉(zhuǎn)平皿，待瓊脂凝固。注意：嚴(yán)格無菌操作。傾注溫度、傾注量。勿污皿蓋。2、瓊脂平板傾注（七）檢定無菌試驗(yàn)。效果試驗(yàn)。（八）保存一般置4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ嚬芤话阒绷⒎胖?，平板需倒置?023/4/1520三、高壓蒸汽滅菌器的使用

1.滅菌原理

蒸汽冷凝時(shí)釋放的大量潛熱使蛋白質(zhì)變性凝固或使細(xì)胞膜功能受損致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物漏出而被殺死，達(dá)到滅菌目的。103.4kPa下于121.3℃維持15~20min，可殺死包括細(xì)菌芽孢在內(nèi)的所有微生物。三、高壓蒸汽滅菌器的使用

2.使用方法檢查水位：滅菌器內(nèi)加入適量的水。將包扎好的待滅菌物品放入其中，注意布局合理。蓋好蓋子，接通電源，進(jìn)行加熱。排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣：可將排氣閥打開，待排出大氣后關(guān)閉排氣閥；或關(guān)閉排氣閥，待壓力上升到0.5kg/cm2時(shí)再打開排氣閥，待壓力回復(fù)到0時(shí)再關(guān)閉排氣閥。當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2時(shí)，此時(shí)滅菌器內(nèi)的溫度為121℃，維持30min。對(duì)熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力，延長時(shí)間。滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓力降至零時(shí)，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品。三、高壓蒸汽滅菌器的使用無菌包不宜過大，不宜過緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對(duì)流易滲透到包裹中央。消毒滅菌前，打開貯槽或盒的通氣孔，有利于蒸汽流通。而且排氣時(shí)使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒滅菌完畢，關(guān)閉貯槽或盒的通氣孔，以保持物品的無菌狀態(tài)。注意事項(xiàng)布類物品應(yīng)放在金屬類物品上，否則蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻礙蒸汽進(jìn)入包裹中央，嚴(yán)重影響滅菌效果。定期檢查滅菌效果。經(jīng)高壓蒸汽滅菌的無菌包、無菌容器有效期以1周為宜。注意事項(xiàng)【實(shí)驗(yàn)任務(wù)】1.基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備液體培養(yǎng)基（1支/人）半固體培養(yǎng)基（1支/人）固體培養(yǎng)基平板（2塊/人）斜面（1支/人）