紫外-可見分光光度法

紫外-可見分光光度法2023/4/16第1頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二分光光度法：是基于被測物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立的分析方法。應(yīng)用對象：一般是能吸收UV-ViS的分子或某些特定離子本章重點：（1）光的波粒二象性（2）紫外可見分光光度法基本原理和概念（3）定性定量方法2023/4/16第2頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二一、光的波粒二象性波動性粒子性

E

光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光電效應(yīng)E：光子的能量（J,焦耳）

：光子的頻率（Hz,赫茲）

：光子的波長（cm）c：光速（2.99791010cm.s-1）h：Plank常數(shù)（6.625610-34J.s焦耳.秒）2023/4/16第3頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二二、電磁波譜和各種光

射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可

見

光紫外可見光譜區(qū)為200~800nm其中紫外為200~400nm、可見為400~800nm在此區(qū)域主要是某些分子產(chǎn)生的吸收2023/4/16第4頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二單色光、復(fù)合光、光的互補單色光復(fù)合光光的互補單一波長的光由不同波長的光組合而成的光若兩種不同顏色的單色光按一定的強度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補。藍黃紫紅綠紫黃綠綠藍橙紅藍綠2023/4/16第5頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二三、物質(zhì)對光的吸收1、物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光吸收池黑色無色透明互補色2023/4/16第6頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2、物質(zhì)的吸收原理與光的關(guān)系光作用于物質(zhì)時，物質(zhì)吸收了相應(yīng)波長的光，而顯示出特征的顏色，這一過程與物質(zhì)的性質(zhì)及光的性質(zhì)有關(guān)。物質(zhì)對光的吸收具有選擇性（量子化）物質(zhì)對光的吸收滿足Plank條件h

S2S1S0S3E2E0E1E3h

h

h

2023/4/16第7頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二物質(zhì)的電子結(jié)構(gòu)不同，所能吸收光的波長也不同，這就構(gòu)成了物質(zhì)對光的選擇吸收基礎(chǔ)。原子吸收是銳線光譜、分子吸收是帶狀光譜例：A物質(zhì)B物質(zhì)同理，得：1ev=1.610-19J.

2023/4/16第8頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二3、物質(zhì)吸收光譜（曲線）的類型測量某物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度，以波長（）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制吸光度隨波長的變化可得一曲線，此曲線即為吸收光譜。表示某物質(zhì)吸收光譜的位置用λmax，表示物質(zhì)吸收光譜的強弱用ε（吸光系數(shù)）250300350400nm1234λ2023/4/16第9頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二吸收光譜

AbsorptionSpectrum原子內(nèi)電子躍遷S2S1S0S3h

E2E0E1E3S2S1S0A

h

h

分子內(nèi)電子躍遷帶狀光譜銳線光譜

A對光吸收程度對光吸收程度2023/4/16第10頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二吸收曲線的討論：①同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長λmax②不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似（如右圖），且λmax值不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。③吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。2023/4/16第11頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二④不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。⑤在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。2023/4/16第12頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二1、有機化合物價電子類型有機化合物中存在三種價電子：σ電子、π電子、n電子它們對應(yīng)有σ、σ*、π、π

*及n軌道。如甲醛分子分子軌道理論：成鍵軌道—反鍵軌道。當(dāng)外層價電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。主要有四種躍遷，所需能量ΔΕ大小順序為：n→π＊<π→π＊<n→σ＊<σ→σ＊

COHnpsH四、電子躍遷類型2023/4/16第13頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2、電子躍遷類型

（1）σ→σ＊躍遷

所需能量最大；σ電子只有吸收遠紫外光的能量才能發(fā)生躍遷；飽和烷烴的分子吸收光譜屬于該類躍遷，出現(xiàn)在遠紫外區(qū)；吸收波長λ<200nm。例：甲烷的λmax為125nm,乙烷λmax為135nm。只能被真空紫外分光光度計檢測到；作為溶劑使用；2023/4/16第14頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二（2）n→π＊躍遷

所需能量最?。籲電子只有吸收近紫外光的能量才能發(fā)生躍遷；含有雜原子不飽官能團的分子吸收光譜屬于該類躍遷，出現(xiàn)在近紫外區(qū)；吸收波長λ>200nm。吸收強度較弱，又是檢測不到。例：丙酮中羰基能產(chǎn)生該類躍遷，其λmax為279nmε為10-30。

2023/4/16第15頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二（3）n→σ＊躍遷

所需能量較大。吸收波長多為150～250nm，大部分在遠紫外區(qū)，而在近紫外區(qū)的仍不易觀察到。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現(xiàn)n→σ*躍遷。如下表所示2023/4/16第16頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二（4）π→π＊躍遷（最重要的躍遷）

所需能量較小，吸收波長處于遠紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)，εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，屬于強吸收。

a.不飽和烴π→π*躍遷乙烯π→π*躍遷的λmax為165nm，εmax為1×104L·mol-1·cm－1,強吸收。b.共軛烯烴中的→*

(HOMOLVMO)

max

165nm217nm

?

?

?

2023/4/16第17頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二共軛烯烴中→*躍遷所需能量降低，因此，對應(yīng)波長增大，同時也屬于強吸收帶如

max=217nm，εmax

為21000紫外光譜電子躍遷類型：n—π*躍遷

π—π*躍遷飽和化合物無紫外吸收電子躍遷類型與分子結(jié)構(gòu)及存在基團有密切聯(lián)系根據(jù)分子結(jié)構(gòu)→推測可能產(chǎn)生的電子躍遷類型；根據(jù)吸收譜帶波長和電子躍遷類型→推測分子中可能存在的基團（分子結(jié)構(gòu)鑒定）2023/4/16第18頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二1、吸收光譜：以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標所描繪的曲線。

2、吸收峰：曲線上吸光度最大的地方，對應(yīng)的波長為max

五、常用概念和術(shù)語3、生色團：最有用的紫外-可見光譜是由π→π＊和n→π＊躍遷產(chǎn)生的。這兩種躍遷均要求有機物分子中含有不飽和基團。這類含有π鍵的不飽和基團稱為生色團。簡單的生色團由雙鍵或叁鍵體系組成，如乙烯基、羰基、亞硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—CN等。2023/4/16第19頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二4、助色團：

有一些含有n電子的基團(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當(dāng)它們與生色團相連時，就會發(fā)生n—π共軛作用，增強生色團的生色能力(吸收波長向長波方向移動，且吸收強度增加)，這樣的基團稱為助色團。5、紅移與藍移

有機化合物的吸收光譜常常因引入取代基或改變?nèi)軇┦棺畲笪詹ㄩLλmax和吸收強度發(fā)生變化:

λmax向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為藍移(或紫移)。吸收強度即摩爾吸光系數(shù)ε增大或減小的現(xiàn)象分別稱為增色效應(yīng)或減色效應(yīng)。2023/4/16第20頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2023/4/16第21頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二六、吸收帶與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

電子躍遷類型與分子結(jié)構(gòu)及其存在的基團有密切的聯(lián)系，因此，可以根據(jù)分子結(jié)構(gòu)來預(yù)測可能產(chǎn)生的電子躍遷，或者根據(jù)吸收譜帶來推測分子的結(jié)構(gòu)。

例如：飽和烴只有σ→σ＊躍遷；烯烴有σ→σ＊躍遷也有π→π＊躍遷；醛、酮同時存在σ→σ＊、n→σ＊

、n→π＊

、π→π＊四種躍遷而產(chǎn)生相應(yīng)的吸收帶。1、R吸收帶（特殊基團帶）：由n→π＊

電子躍遷而產(chǎn)生的吸收帶，是雜原子的不飽和基團這類生色團的特征。處于~300nm，是弱吸收，有時被掩蓋。6、強帶和弱帶：在紫外可見光區(qū)內(nèi)，凡是εmax

值大于104的吸收峰為強帶；小于102的吸收峰為弱帶。2023/4/16第22頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2、K吸收帶（共軛作用）

由于非環(huán)狀共軛雙鍵中的π→π＊躍遷而產(chǎn)生的吸收帶。該吸收帶屬于強吸收帶。

3、B吸收帶（芳香族特征帶）由于苯分子的振動和轉(zhuǎn)動能級躍遷產(chǎn)生的吸收帶。在230nm~270nm出現(xiàn)，屬于較弱的吸收帶，在蒸汽時出現(xiàn)精細結(jié)構(gòu)（很多小鋸齒峰），在極性溶液中精細結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)寬峰。

4、E吸收帶（芳香族特征帶）

由苯環(huán)中環(huán)狀共軛系統(tǒng)的π→π＊躍遷而產(chǎn)生的吸收帶2023/4/16第23頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二該吸收帶特點是產(chǎn)生兩個緊相鄰的E1（在180nm處）、E2（在200nm處）帶，該吸收帶均屬于強吸收帶。2023/4/16第24頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二第十一章

紫外可見分光光度法一、朗伯-比爾定律二、偏離吸收定律因素第二節(jié)

溶液吸收定律2023/4/16第25頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二一、朗伯-比爾定律1、透光率

（透射比）Transmittance透光率定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光

I0透射光

It2023/4/16第26頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2、吸收定律的推導(dǎo)（簡化）Lambert–BeerLawI0db

bItI

I-dI

dI∝

NIN：薄層中的吸光粒子數(shù)N=N0cdSdb

N0：阿伏加德羅常數(shù)

dS：捕獲面積，薄層中被光照射的面積。c：吸光溶液的濃度N=k’

cdb

故

dI∝

NI=Ik’cdbdI=-Ik

cdb,dI/I=-k

cdb積分得或得2023/4/16第27頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二3、吸光度與透光率

T：

透光率A：

吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%2023/4/16第28頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二4、吸光系數(shù)

Absorptivityb

：吸光液層的厚度，光程，

cmc：吸光物質(zhì)的濃度，

g/L,mol/LK：比例常數(shù)

入射光波長物質(zhì)的性質(zhì)溫度取值與濃度的單位相關(guān)c：mol/L

K

摩爾吸光系數(shù)，

L·mol–1·cm-1

c：g/L

K

a

質(zhì)量吸光系數(shù)，

L·g–1·cm-1

c：g/100mL

K

比吸光系數(shù)

相互關(guān)系溶劑2023/4/16第29頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二5、吸光度的加合性多組分體系中，如果各組分之間無相互作用，其吸光度具有加合性，即二、吸收定律偏離的因素

標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標準曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學(xué)性因素。2023/4/16第30頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二（1）物理性因素

難以獲得真正的純單色光。朗—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對朗伯—比耳定律的正或負偏離。

非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起對朗伯—比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。2023/4/16第31頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二非單色光作為入射光引起的偏離

假設(shè)由波長為λ1和λ2的兩單色光組成的入射光通過濃度為c的溶液，則：

A

1＝lg（Ｉo1/Ｉt1）＝ε1bc

A

2＝lg(Ｉo2/Ｉt2）＝ε2bc故：式中：Ｉo1、Ｉo2分別為λ1、λ2的入射光強度；Ｉt1、Ｉt2分別為λ1、λ2的透射光強度；

ε1、ε2分別為λ1、λ2的摩爾吸光系數(shù)；因?qū)嶋H上只能測總吸光度A總，并不能分別測得A1和A2，故2023/4/16第32頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二

A總＝lg（Ｉo總/Ｉt總)＝lg(Io1+Ｉo2)/(Ｉt1+Ｉt2）

＝lg(Io1+Ｉo2)/(Ｉo110-ε1bc

+Ｉo210-ε2bc

）令：ε1-ε2＝；設(shè)：Ｉo1＝Ｉo2A總＝lg(2Io1)/Ｉt1(1＋10-εbc

）

＝A1+lg2-lg(1＋10-εbc

)討論:因?qū)嶋H上只能測總吸光度A總，并不能分別測得A1和A2，故2023/4/16第33頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二討論:

A總=A1+lg2-lg(1＋10－εbc

)

(1)=0；即：

1=

2=

則：

A總＝lg（Ｉo/Ｉt）＝bc(2)≠0若<0；即

2<

1；－bc>0,lg(1＋10

bc)值隨c值增大而增大，則標準曲線偏離直線向c軸彎曲，即負偏離；反之，則向A軸彎曲，即正偏離。2023/4/16第34頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二討論:

A總

=A1+lg2-lg(1＋10－εbc

)

(3)｜｜很小時，即ε1≈ε2：

可近似認為是單色光。在低濃度范圍內(nèi)，不發(fā)生偏離。若濃度較高，即使｜｜很小，A總≠Ａ1，且隨著c值增大，A總與A1的差異愈大，在圖上則表現(xiàn)為A—c曲線上部(高濃度區(qū))彎曲愈嚴重。故朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。

(4)為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇比較好的單色器。此外還應(yīng)將入射波長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波長且吸收曲線較平坦處。2023/4/16第35頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二(2)化學(xué)性因素

朗—比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合。當(dāng)溶液濃度c>10－2mol/L時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。故：朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時。使吸光質(zhì)點的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：

CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O溶液中CrO42-、Cr2O72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故此時溶液pH對測定有重要影響。2023/4/16第36頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二第十章

紫外可見分光光度法一、基本組成二、分光光度計的類型三、儀器測量誤差四、實驗技術(shù)及分析條件第三節(jié)

紫外—可見分光光度計2023/4/16第37頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二一、紫外-可見分光光度計組成0.575光源單色器吸收池檢測器顯示I0It參比樣品入射光

I0透射光

It請注意與定義比較未考慮吸收池和溶劑對光子的作用2023/4/16第38頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二（1）光源在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射出連續(xù)光譜，要求：具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命?？梢姽鈪^(qū)：鎢燈作光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。（2）單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并從中選出需要的波長①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；2023/4/16第39頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。進入檢測器（3）樣品室樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池（為什么？）。2023/4/16第40頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二（4）檢測器利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。（5）結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)將信號放大并顯示出來，由檢流計、數(shù)字顯示、微機等儀器組成。二、類型（1）單波長單光束分光光度計（2）單波長雙光束分光光度計2023/4/16第41頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二（1）單波長單光束分光光度計0.575光源單色器吸收池檢測器顯示2023/4/16第42頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二（2）單波長雙光束分光光度計比值光源單色器吸收池檢測器顯示光束分裂器2023/4/16第43頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2023/4/16第44頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2023/4/16第45頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2023/4/16第46頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2023/4/16第47頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二三、儀器測量誤差根據(jù)誤差傳遞公式，可以推導(dǎo)出濃度測量的相對誤差為T=0.368=36.8%A=0.434為了減少測量誤差，控制溶液的吸光度

A=0.2~0.7T=70~10%0.3682023/4/16第48頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二四、實驗條件選擇

1.儀器測量條件任何分光光度計都有一定的測量誤差，這是由于光源不穩(wěn)定、實驗條件的偶然變動、讀數(shù)不準確等因素造成的。這些因素對于試樣的測定結(jié)果影響較大，特別是當(dāng)試樣濃度較大或較小時。因此，要選擇適宜的吸光度范圍，以使測量結(jié)果的誤差盡量減小。通常將待測溶液的投射比（T）選在10%~70%或吸光度（A）在0.2~0.7即可。（如何實現(xiàn)？）2023/4/16第49頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2、測量波長的選擇無干擾，選擇max

有干擾，選擇要根據(jù)干擾而定A

A

待測溶液吸光度的選擇控制A=0.2~0.7T=70%~10%方法選擇

C（濃度）選擇

b（液層厚度）2023/4/16第50頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二3、參比液的選擇原則：扣除非待測組分的吸收以顯色反應(yīng)為例進行討論M+R=M-R

max

試液

顯色劑

溶劑

吸光物質(zhì)

參比液組成無吸收無吸收光學(xué)透明溶劑基質(zhì)吸收無吸收吸收

不加顯色劑的試液無吸收吸收

吸收

顯色劑基質(zhì)吸收

吸收

吸收

吸收

顯色劑

+試液

+待測組分的掩蔽劑若欲測

M-R的吸收max

A（樣）

=A（待測吸光物質(zhì)）

+A（干擾）+A（池）A（參比）

=A（干擾）+A（池）2023/4/16第51頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二4、顯色反應(yīng)有機物質(zhì)官能團強吸收直接測定UV-VIS官能團弱吸收衍生化反應(yīng)UV-VIS顯色反應(yīng)無機物質(zhì)通常通過顯色反應(yīng)生成吸光系數(shù)大的有色物質(zhì)進行測定，以提高靈敏度332+桔紅色

max

鄰二氮菲2023/4/16第52頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二（1）顯色劑選擇：a.顯色反應(yīng)靈敏度高，有較強的吸光能力；b.反應(yīng)生成物組成恒定、穩(wěn)定性好；c.對照性好，顯色劑與有色配合物的λmax差別在60nm以上。（2）顯色劑用量：通過實驗確定。2023/4/16第53頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二第十章

紫外可見分光光度法一、定性、定量分析方法二、分光光度法應(yīng)用三、有機物結(jié)構(gòu)確定第四節(jié)紫外吸收光譜的應(yīng)用2023/4/16第54頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二一、定性分析與定量分析法定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)物質(zhì)對光的選擇吸收ABA

在一定的實驗條件下，物質(zhì)對光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比。A

C增大2023/4/16第55頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二1、定性方法定性主要的依據(jù)→吸收光譜所具有的以下特征吸收光譜的形狀吸收峰的數(shù)目吸收峰的位置（波長）吸收峰的強度相應(yīng)的吸光系數(shù)2023/4/16第56頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2、定量方法類型<1>、單組分的定量吸光系數(shù)法（單色光很純）：在給定實驗條件下由A=cb計算例如：維生素B12樣品2.50mg用水溶解成100ml后，盛于1cm吸收池中，在361nm測得A值為0.507，求吸光系數(shù)和含量。已知吸光系數(shù)(比吸光系數(shù)）的標示量為E=207解：E=A/(cb)=0.507/0.0025=202.8g/100ml2023/4/16第57頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二樣品中B12=E(樣)/E(標)=202.8/207=98.0%

標準曲線法（單色光不純）:依據(jù)A=kc測定時，配制一系列濃度不同的標準溶液，在同一條件下分別測定A，然后以A為縱坐標，濃度為橫坐標繪制A-c曲線（標準曲線如右圖）。根據(jù)樣品溶液測得A值，從曲線上求得樣品的濃度。該法對儀器要求不高，適合大批量樣品分析Aci2023/4/16第58頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二

蘆丁含量測定0.710mg/25mL2023/4/16第59頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二

對照法：在相同條件下，在線形范圍內(nèi)配制樣品溶液和標準溶液，在選定波長處，分別測定吸光度。由朗伯-比爾定律求算。A樣品=樣品c樣品b，A標=標c標b因同種物質(zhì)，同臺儀器，相同厚度吸收池及同一波長，故樣=標，所以C樣=（A樣/A標）C標例如：維生素B12注射液含量測定：精密吸取B12注射液2.50ml，加水稀釋至10.00ml搖勻。另配制B12標準液：精密稱取B12標準品25.0mg，加水溶解并稀釋至1000ml，搖勻。在361nm處，用1cm吸收池分別測得樣品和標準溶液的A值為0.508和0.518，求B12注射液的濃度。2023/4/16第60頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二解：c樣品=98.1μg/ml<2>、多組分定量多組分的定量依據(jù)：A總=Aa+Ab+Ac+…在混合組分測定中，遇到各組分吸收光譜雙向重疊，相互干擾時，可根據(jù)測定目的、要求和光譜重疊的不同情況采用下列方法：三種情況：兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）兩組分在各自λmax下不重疊→分別按單組分定量2023/4/16第61頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二

兩組分吸收光譜部分重疊λ1→測A1→b組分不干擾→可按單組分定量測Ca（如下圖）λ2→測A2→a組分干擾→不能按單組分定量測Ca（如下圖）2023/4/16第62頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2023/4/16第63頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二兩組分吸收光譜完全重疊——混合樣品測定a.解線性方程組法b.等吸收雙波長消去法c.系數(shù)倍率法2023/4/16第64頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二a.解線性方程組法步驟：2023/4/16第65頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二b.等吸收雙波長法步驟：

消除a的影響測b2023/4/16第66頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二消去b的影響測a

注：須滿足兩個基本條件選定的兩個波長下干擾組分具有等吸收點選定的兩個波長下待測物的吸光度差值應(yīng)足夠大2023/4/16第67頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二c.系數(shù)倍率法前提：干擾組分b不成峰形無等吸收點2023/4/16第68頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二步驟：b曲線上任找一點→λ1

另一點為→λ2優(yōu)點：同時將待測組分和干擾組分放大信號K倍，提高了待測組分測定靈敏度abλ1

λ22023/4/16第69頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二二、紫外可見分光光度法應(yīng)用實例1、氫鍵強度測定:氫鍵的形成能使羰基的n→π＊躍遷吸收帶發(fā)生紫移，例如丙酮在非極性溶劑己烷中n→π＊躍遷的吸收波長為279nm，而在極性溶劑水中n→π＊躍遷的吸收波長為264.5nm，兩者躍遷的能量差正好是丙酮在水中形成氫鍵的強度。氫鍵的強度用EH表示。EH=EP-En=NAhc[（1/λp）-(1/λn)]p--代表在極性溶劑中；n--代表在非極性溶劑中NA--代表阿伏伽德羅常數(shù)；h--代表普朗克常數(shù)；c-光速上述丙酮在水中的氫鍵為EH=23.6KJ/mol2023/4/16第70頁，共77頁，2023年，2月20日，星期二2、配合物的組成及穩(wěn)定常數(shù)的測定（1）摩爾比法測配合比（飽和法）M+nR=MRn

若M和R均不干擾MRn

吸收CM固定

CR從

0開始增大，得到一系列CR/CM值不同溶液，在同一波長下測定溶液的A，然后作A對CR/CM圖R=0,