人類體細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與核型分析

/實(shí)驗(yàn)一人類體細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與核型分析ＭｅｔaｐhaseCｈroｍoｓoｍeＰrepａratｉoｎａｎdAｎaｌyｓisｏfKaryｏtyｐｅ【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴煜と祟愅庵苎馨图?xì)胞的培養(yǎng)方法及染色體標(biāo)本的制備方法。熟悉人類染色體Ｇ顯帶標(biāo)本制備與分析。【實(shí)驗(yàn)原理】染色體是在顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu).因此，必須獲得染色體標(biāo)本才能進(jìn)行檢查分析,通常情況下,都是利用外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行核型分析.正常情況下,人體外周血淋巴細(xì)胞不再分裂，但植物血凝素（ＰHA）可刺激血中的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，使其恢復(fù)增殖能力。因此，可采取少量外周靜脈血,做短期培養(yǎng)，培養(yǎng)至７２小時(shí)細(xì)胞進(jìn)入增殖旺盛期，此時(shí)加入秋水仙素抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細(xì)胞，經(jīng)低滲、固定、制片、染色后鏡下觀察進(jìn)行核型分析。上述制備的染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶消化、Ｇiemsa染色后，可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋——帶，表明每條染色體的特征?！緦?shí)驗(yàn)用品】1．采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、離心機(jī)、刻度離心管、乳頭吸管、試管架、量筒、試劑瓶、載玻片、吹風(fēng)機(jī)、托盤(pán)天平、顯微鏡、鏡油、二甲苯、擦鏡紙、鑷子、燒杯、記號(hào)筆、玻片架、火柴、10ml注射器。２．RPMI1６40液體培養(yǎng)基、小牛血清、肝素（５00Ｕ/ml)、植物血凝素(PHA)、秋水仙素（10ｍg／ml）、KＣl低滲液（0.0７5mol／Ｌ）、甲醇、冰乙酸、Ｇｉemsa原液、磷酸緩沖液（PH6。８）。3．2。5％胰酶溶液（Ｈaｎks液配制)、０．4％酚紅、Ｇiemsａ染色液、１N鹽酸、1N氫氧化鈉。【實(shí)驗(yàn)步驟】一。外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與分析１。采血及接種培養(yǎng)1．１在酒精燈火焰上,用滅菌注射器（一次性注射器)抽取肝素０。２ｍｌ，使肝素濕潤(rùn)至管壁。1.2常規(guī)消毒后,采集外周靜脈血５ml,轉(zhuǎn)動(dòng)注射器使血液與肝素混勻.1。３在超凈工作臺(tái)中,預(yù)先將RＰＭI1640液體培養(yǎng)基（5ｍｌ，含植物血凝素６０mｇ/mｌ、１0%小牛血清）加入消毒好的小培養(yǎng)瓶中，再滴加25滴全血（6號(hào)針頭），水平搖動(dòng)混勻。１.4置3７℃１。5終止培養(yǎng)前2~4小時(shí),加入秋水仙素,使終濃度達(dá)到0．２μｇ/ml。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使秋水仙素混勻.繼續(xù)培養(yǎng)至7２小時(shí)。２．制片2。1收集細(xì)胞時(shí)，去掉瓶塞,用乳頭吸管吸取培養(yǎng)液，充分混勻培養(yǎng)物,再將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中.2.210０0rｐｍ離心8分鐘(注意先配平）。２.3棄上清液，加入37℃預(yù)溫的0。075moｌ/ＬKCl溶液8mｌ,用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)混勻后，置37２.４加入１ml新配制的固定劑（甲醇:冰乙酸＝3：1),用吸管小心吹打、混勻，１０00ｒpm離心8分鐘。2.5棄上清液,加入８ｍｌ固定劑，吹打細(xì)胞團(tuán)制成細(xì)胞懸液后，室溫下固定２0分鐘。2。61000ｒｐｍ離心8分鐘。2.７棄上清液,重復(fù)固定一次。２。８棄上清液，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的多少適當(dāng)加入數(shù)滴新配制的固定劑，吹打細(xì)胞制成懸液。2。9吸取少量細(xì)胞懸液,滴2～３滴于冰水浸泡過(guò)的載玻片上,吹散,氣干。2．1０將標(biāo)本置Giｅmｓa染液中，染色8分鐘，水洗去浮色，氣干。２.11顯微鏡下觀察染色體標(biāo)本分裂相的多少及分散情況。二.人外周血淋巴細(xì)胞染色體G顯帶標(biāo)本制備與分析1．Ｇ顯帶染色體標(biāo)本制備1.1常規(guī)制片后，將標(biāo)本置７0℃1.２取2。5%胰酶溶液5mｌ，加入染色缸中,加入４5ｍl生理鹽水,用１NHCl或１NNaOH及酚紅調(diào)節(jié)胰酶溶液成紫紅色（ＰH6。８～7。2)，置3７OＣ預(yù)溫.１．3將玻片標(biāo)本放入胰酶溶液中處理２5～45秒鐘，不斷輕輕搖動(dòng)玻片，使胰酶作用均勻.隨著處理標(biāo)本數(shù)量增加，胰酶逐漸消耗，胰酶作用時(shí)間逐漸延長(zhǎng).1．4取出染色體玻片標(biāo)本，置于３７℃1。５將玻片標(biāo)本放入３7℃１。6自來(lái)水沖洗，氣干。1．7顯微鏡觀察。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】一.常規(guī)染色體核型分析1.根據(jù)染色體的形態(tài)、大小及著絲粒的位置,將染色體分為七組.A組染色體:包括１～3號(hào)染色體。長(zhǎng)度最長(zhǎng)，１號(hào)和3號(hào)染色體為中央著絲粒，2號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體。B組染色體:包括4~5號(hào)染色體，長(zhǎng)度次于Ａ組;亞中央著絲粒染色體,短臂較短。C組染色體:包括6~1２號(hào)和X染色體，中等長(zhǎng)度，亞中央著絲粒染色體.Ｄ組染色體:包括1３～15號(hào)染色體，具有近端著絲粒和隨體。E組染色體:包括16～１８號(hào)染色體，16號(hào)染色體著絲粒在3/8處,１7號(hào)和18號(hào)染色體著絲粒約在１/４處。F組染色體：包括19號(hào)和２0號(hào)染色體，中央著絲粒.G組染色體:包括21號(hào)、22號(hào)和Ｙ染色體,是染色體組中最小的，為近端著絲粒的染色體。2１號(hào)和2２號(hào)染色體具有隨體。2。繪圖:繪出在顯微鏡下觀察到的染色體。二。G顯帶染色體標(biāo)本分析Ｇ帶顯示的正常人顯帶核型特征（見(jiàn)附圖1．1、1.2、１.３)A組染色體：包括1~３號(hào)染色體。長(zhǎng)度最長(zhǎng)，1號(hào)和3號(hào)染色體為中央著絲粒，２號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體。１號(hào)染色體短臂：在320條帶左右的分裂相上,近側(cè)段有兩條深帶,第2條深帶稍寬；在處理好的標(biāo)本上,遠(yuǎn)側(cè)段可顯出３４條淺染的深帶.此臂分為３個(gè)區(qū)，近側(cè)的第１深帶為２區(qū)1帶，第２深帶為3區(qū)1帶.長(zhǎng)臂：副縊痕緊貼著絲粒，染色深淺不一,其遠(yuǎn)側(cè)為一寬的淺帶，近中段與遠(yuǎn)側(cè)段各有兩條深帶，中段兩條深帶稍靠近，其中第2條染色較濃。此臂分為四個(gè)區(qū),副縊痕遠(yuǎn)側(cè)的淺帶為2區(qū)1帶,中段第２深帶為3區(qū)１帶，遠(yuǎn)側(cè)段第１深帶為4區(qū)1帶。２號(hào)染色體短臂可見(jiàn)四條深帶，中段的兩條深帶較靠近。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段兩條深帶之間的淺帶為２區(qū)１帶.長(zhǎng)臂：有7條深帶,第3和第4深帶有時(shí)融合。此臂分為3個(gè)區(qū).第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶,第4和第５深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶.3號(hào)染色體著絲粒區(qū)濃染短臂：在近側(cè)段可見(jiàn)一條較寬的深帶，遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)兩條深帶，其中遠(yuǎn)側(cè)的一條較窄，且著色較淺，這是區(qū)別3號(hào)染色體短臂的重要特征。近側(cè)段的深帶可分為兩條深帶。此臂分2個(gè)區(qū),中段淺帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：一般在近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條較寬的深帶。在顯帶好的標(biāo)本上，近側(cè)段的深帶可分為兩條深帶，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶可分為三條深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。B組染色體：包括4～５號(hào)染色體,長(zhǎng)度次于A組;亞中央著絲粒染色體，短臂較短。4號(hào)染色體短臂：可見(jiàn)兩條深帶，近側(cè)深帶染色較淺，短臂只有一個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)均勻分布的四條深帶，在顯帶較好的標(biāo)本上,遠(yuǎn)側(cè)段的兩條深帶可各自再分為兩條較寬的深帶。此臂分為3個(gè)區(qū),近側(cè)段第1和第２深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶,遠(yuǎn)側(cè)段的兩條深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶。5號(hào)染色體短臂:可見(jiàn)兩條深帶，其中遠(yuǎn)側(cè)的深帶寬而且色濃，短臂只有一個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)段有兩條深帶，染色較淺，有時(shí)不明顯;中段可見(jiàn)三條深帶，染色較深，有時(shí)融合成一條寬的深帶;遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)二條深帶，近末端的一條著色較濃。此臂可分為３個(gè)區(qū)，中段第2深帶為２區(qū)1帶，中段深帶與遠(yuǎn)側(cè)段深帶之間的寬闊的淺帶為3區(qū)１帶.C組染色體:包括6～１2號(hào)和X染色體，中等長(zhǎng)度，亞中央著絲粒染色體。6號(hào)染色體短臂：中段有一條明顯而寬闊的淺帶，其中近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條深帶，近側(cè)深帶緊貼著絲粒;在顯帶較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶又可分為兩條深帶.此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的明顯而寬闊的淺帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)五條深帶，其中近側(cè)的一條緊貼著絲粒,遠(yuǎn)側(cè)段末端的一條深帶著色較淺。此臂分為2個(gè)區(qū),第2和第3深帶之間的淺帶為２區(qū)１帶.7號(hào)染色體著絲粒濃染。短臂：有三條深帶,中段深帶著色較淡,有時(shí)不明顯;遠(yuǎn)側(cè)深帶著色濃寬,狀如”瓶蓋”.此臂分為2個(gè)區(qū)，遠(yuǎn)側(cè)段的淺帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂:有三條明顯的深帶，遠(yuǎn)側(cè)近末端的一條深帶著色較淡，第2和第3深帶稍接近。此臂分為3個(gè)區(qū),近側(cè)第1深帶為2區(qū)二帶,中段的第2深帶為3區(qū)1帶。8號(hào)染色體短臂：有兩條深帶，中段有一條較明顯的淺帶，這是與10號(hào)染色體相區(qū)分的主要特征.此臂分為2個(gè)區(qū),中段的淺帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)三條分界不明顯的深帶,遠(yuǎn)側(cè)段的深帶著色較濃.此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶.９號(hào)染色體著絲粒濃染。短臂：近側(cè)段和中段各有一條帶，在顯帶較好的標(biāo)本上，中段可見(jiàn)兩條窄的深帶，此臂分為２個(gè)區(qū)，中段的深帶為2區(qū)１帶.長(zhǎng)臂:可見(jiàn)明顯的兩條深帶,副縊痕一般不著色,在有些標(biāo)本上顯現(xiàn)出特有狹長(zhǎng)的頸部區(qū).此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)的一條深帶為2區(qū)１帶,遠(yuǎn)出的一條深帶為３區(qū)二帶.1０號(hào)染色體著絲粒濃染。短臂：近出段和中段各有一條深帶,在有些標(biāo)本的中段可見(jiàn)兩條深帶，但與８號(hào)染色體短行比較,其深帶的分界不夠清晰.此臀只有一個(gè)區(qū).長(zhǎng)臂：可見(jiàn)明顯的三條帶，近側(cè)的深帶較明顯，遠(yuǎn)側(cè)的兩條深帶較靠近，這是與8號(hào)染色體相鑒別的主要特征。此管分為2個(gè)區(qū),近側(cè)段的一條深帶為2區(qū)1帶。１1號(hào)染色體短臂：近中段可見(jiàn)兩條靠的很近的較窄的深帶．在顯帶較差的標(biāo)本上,只能看見(jiàn)一條寬帶.此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)有一條深帶，緊貼著絲粒。遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)一條明顯的較寬的深帶，這條深帶與近側(cè)的深帶之間是一條寬闊的淺帶，這是與12號(hào)染色體相鑒別的一個(gè)明顯特征;在顯帶較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶可分為兩條較窄的深帶，兩深帶之間有一條很窄的淺帶，一般極難辨認(rèn)，但它是一個(gè)分區(qū)的界標(biāo)，在有些標(biāo)本上近末端處還可見(jiàn)一條窄的淡色的深帶。此臂分為２個(gè)區(qū)，上述遠(yuǎn)側(cè)兩條深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。12號(hào)染色體短臂：中段可見(jiàn)一條深帶.此臂只有1個(gè)區(qū).長(zhǎng)臂：近側(cè)有一條深帶,緊貼著絲粒；中段有一條寬的深帶，這條深帶與近側(cè)深帶之間有一條明顯的淺帶,但與11號(hào)染色體相比較這條淺帶較窄，這是鑒別11號(hào)與12號(hào)染色體的一個(gè)主要特征；在顯帶好的標(biāo)本上，中段較寬的深帶可分為三條深帶,其正中的一條著色較濃;在有些標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的近端還可見(jiàn)1~2條染色較淡的深帶.此行分為2個(gè)區(qū)，中段正中的深帶為２區(qū)1帶.X染色體其長(zhǎng)度介于７號(hào)和8號(hào)染色體之間。短臂：中段有一條明顯的深帶，如竹節(jié)狀。在有些標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段還可見(jiàn)一條窄的、著色淡的深帶.此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂:可見(jiàn)4～5條深帶，近中部的一條深帶最明顯。此臂分為2個(gè)區(qū)，近中段的深帶2區(qū)1帶.D組染色體：包括１３～15號(hào)染色體，具有近端著絲粒和隨體。1３號(hào)染色體著絲粒濃染。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)4條深帶，第1和第4帶較窄,染色較淡。第２和第3深帶較寬,染色較濃,此臂分為3個(gè)區(qū),第2深帶為2區(qū)１帶,第3深帶為３區(qū)1帶。14號(hào)染色體著絲粒濃染。長(zhǎng)臂:近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有一條明顯的深帶，在處理好的標(biāo)本上，中段尚可見(jiàn)一條較淺的深帶.此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)深帶為2區(qū)１帶，遠(yuǎn)側(cè)深帶為3區(qū)1帶。１5號(hào)染色體著絲粒濃染。長(zhǎng)臂:中段有一條明顯的深帶，染色較濃，有的標(biāo)本上，近側(cè)段可見(jiàn)l～2條淡染的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段深帶為2區(qū)１帶。Ｅ組染色體：包括16~18號(hào)染色體，16號(hào)染色體著絲粒在3/8處，1７號(hào)和18號(hào)染色體著絲粒約在1/4處.16號(hào)染色體短臂:中段有一條深帶，較好的標(biāo)本上可見(jiàn)兩條深帶。此臂只有1個(gè)區(qū).長(zhǎng)臂:中段和遠(yuǎn)側(cè)各有一條深帶,有時(shí)遠(yuǎn)側(cè)段的一條不明顯,副縊痕著色濃。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段深帶為2區(qū)１帶。１7號(hào)染色體短臂：有一條深帶，緊貼著絲粒.此臂只有1個(gè)區(qū).長(zhǎng)臂:遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)一條深帶，這條帶與著絲粒之間為一明顯而寬的淺帶.此臂分為2個(gè)區(qū)，這條明顯而寬的淺帶為2區(qū)1帶。18號(hào)染色體短臂：有一條窄的深帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有一條明顯的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，兩深帶之間的淺帶為２區(qū)１帶。F組染色體:包括19號(hào)和20號(hào)染色體，中央著絲粒。19號(hào)染色體著絲粒及周圍為深帶，其余為淺帶。短臂和長(zhǎng)臂均只有1個(gè)區(qū).2０號(hào)染色體著絲粒區(qū)濃染。短臂:有一條明顯的深帶。此臂只有１個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂:在中段和遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)1—2條染色較淺的深帶，有時(shí)全為淺帶。此管只有1個(gè)區(qū)。Ｇ組染色體:包括２１號(hào)、２２號(hào)和Y染色體,是染色體組中最小的,具近端著絲粒的染色體.２１號(hào)和22號(hào)染色體具有隨體.２１號(hào)染色體著絲粒區(qū)著色淺。與２２號(hào)染色體相比較，其長(zhǎng)度比22號(hào)短。其長(zhǎng)臂近側(cè)有一明顯而寬的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，其深帶為２區(qū)１帶。22號(hào)染色體著絲粒區(qū)染色濃。與21號(hào)染色體相比較，其長(zhǎng)度比21號(hào)長(zhǎng);在長(zhǎng)臂上可見(jiàn)兩條深帶,近側(cè)的一條著色較濃而且緊貼著絲粒，近中段的一條著色淺,在有的標(biāo)本上不顯現(xiàn).此臂只有１個(gè)區(qū).Y染色體長(zhǎng)度變化較大，有時(shí)整個(gè)長(zhǎng)臂被染色成深帶。在染色較好的標(biāo)本上，可見(jiàn)兩條深帶.此臂只有1個(gè)區(qū)。圖１.1G顯帶染色體核型圖1.２G顯帶染色體核型分析ＳHAＰE\＊MERGＥFORMAT圖１。3正常男性G顯帶染色體模式圖【注意的問(wèn)題】1.采血時(shí)不要加入太多的肝素,因?yàn)楦嗡睾窟^(guò)多時(shí)往往抑制淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。2。培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液逐漸變黃色,說(shuō)明pH發(fā)生了較大變化，將不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，此時(shí)可加入適量滅菌的1．4%NaHＣO3溶液調(diào)整,或再加入2~3ml培養(yǎng)液的辦法來(lái)校正.３.培養(yǎng)失敗的原因,一般有下述幾種：①培養(yǎng)瓶及器材洗滌不符合要求；②配制溶液的雙蒸水不符合要求；③PHA和培養(yǎng)液的質(zhì)量有問(wèn)題,或培養(yǎng)液pＨ不符合要求;④無(wú)菌操作不符合要求，發(fā)生污染；⑤淋巴細(xì)胞對(duì)PＨＡ反應(yīng)降低，致分裂相太少。4．標(biāo)本質(zhì)量不佳的原因：①秋水仙素的處理不當(dāng),如秋水仙素的濃度不夠或處理時(shí)間不足，結(jié)果分裂相太少;如濃度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則使染色體過(guò)于縮短，難于進(jìn)行分析；②低滲處理不當(dāng)，低滲處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞膜往往過(guò)早破裂，染色體丟失；如果低滲處理不夠，則染色體分散不佳,難以進(jìn)行計(jì)數(shù)分析；③離心速度不合適，收集細(xì)胞時(shí)離心的速度太低易丟失細(xì)胞，如果低滲后離心速度過(guò)高，往往使分裂相過(guò)早破裂,完整的分裂相減少;④標(biāo)本固定不充分，如固定液不新鮮,或甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，結(jié)果染色體模糊，或殘留胞漿痕跡，使背景不清；⑤玻片去污不徹底,冷凍不夠,使細(xì)胞懸液不能均勻附著以致細(xì)胞大量丟失,或染色體分散不佳。5。制備Ｇ顯帶染色體標(biāo)本時(shí),要嚴(yán)格控制胰酶消化時(shí)間，時(shí)間不足顯不出帶紋，時(shí)間過(guò)長(zhǎng),使染色體不規(guī)則或形成空泡狀。附錄一、試劑及配制：RＰMI１640培養(yǎng)液ＲＰMI164０10.4g肝素80ｍｇPHA182mg胎牛血清100ml抗菌素8萬(wàn)單位NａＨCＯ32ｇ雙蒸水定容至１00０ml。抽濾除菌，分裝，—20低滲液(0.075MolKＣl)KCl2．794g三蒸水50０ｍｌ固定液甲醇(AR）：冰醋酸（AR)=3：1現(xiàn)用現(xiàn)配。Giｅmsａ染液貯存液Ｇiemｓa5g純甘油(AR）330ml甲醇（ＡR)33mｌ先將Gｉemsa粉劑溶于少量的甘油中，在研缽中充分研磨至無(wú)顆粒粘糊狀，再將全部甘油加入，然后移至燒杯中,在55~60OC溫箱中放置2小時(shí),冷卻后加入甲醇，充分?jǐn)嚢杈鶆?在室溫放置２～3周后過(guò)濾除去絮狀物,儲(chǔ)存在棕色瓶中，一般放置3周后使用效果更好。使用液磷酸緩沖液甲、乙各2。5ml，加４５ml雙蒸水，加Giemｓａ原液2.5mｌ。2.5％胰蛋白酶原液胰蛋白酶粉劑2.5g生理鹽水1０0ｍl秋水仙素（1０mg/ｍｌ，使用液1０0μg/mｌ）秋水仙素1g生理鹽水１00ml抽濾，4OＣ棕色瓶保存.肝素（２５０0U/ｍｌ,使用濃度５０U/ml)肝素鈉31２。5mg生理鹽水100ml高壓滅菌。Haｎｋs液（ｇ/L)NａＣl8．00ＫCl0．40CaＣl20.14MgSO4?7H２Ｏ０．２0Ｎa2HPO40。０６KH2ＰO40.０６ＮaHCO30.35葡萄糖1。00酚紅０。0２二、記錄和檢查回報(bào)表表1染色體病病例檢查分析記錄送檢材料:檢查目的：送檢時(shí)間：送檢材料:檢查目的：送檢時(shí)間：編號(hào):送檢者:院科醫(yī)生患者姓名:性別:年齡：臨床檢查摘要于臨床初步診斷:家系資料:?表２染色體檢查記錄(記錄內(nèi)容：顯微鏡號(hào)、標(biāo)本號(hào)、座標(biāo)、核型與異常特點(diǎn))１234567891０11１21３14１516１7１81920２1２223２425262728２930３１323３3435373７３83940414243444５46474８4850５15２5３5４55565７５859606１６２６3６４656667686９70７1７２7374757677787９8081８283848586８７888９909192939４9５96979899100表3染色體畸變分析記錄玻片號(hào)性別號(hào)座標(biāo)核型畸變?nèi)旧w特點(diǎn)照片編號(hào)討論：分析結(jié)果：分析者：年月日表4核型分析１2３45AB6789１０1112X C1314151617１8DE１９202１２２YFG表５核型分析檢查回報(bào)單姓名性別年齡送檢材料送檢目的時(shí)間編號(hào)送檢者院科醫(yī)生臨床初步診斷細(xì)胞遺傳學(xué)檢查結(jié)果（１)X染色質(zhì)檢查Ｙ染色質(zhì)檢查（2）核型分析(3）皮膚文理特征(4）家系分析診斷檢查者簽字年月日?實(shí)驗(yàn)二X和Ｙ染色質(zhì)標(biāo)本的制作與觀察XandＹChｒｏmatinPreparatioｎandObservaｔｉon【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴煜染色質(zhì)和Y染色質(zhì)的形態(tài)特征及其檢查方法【實(shí)驗(yàn)原理】正常女性核型為４6,XX。在間期細(xì)胞核中緊貼核膜內(nèi)緣有一個(gè)染色較深的橢圓形小體，即X染色質(zhì)，這是女性細(xì)胞中一條X染色體隨機(jī)Lyoｎ化失活形成的。這種失活保證了雌雄兩性細(xì)胞中都只有一條有活性的染色體，使兩性X連鎖基因產(chǎn)物的量保持在相同水平上。稱為X染色體的劑量補(bǔ)償（參考Lｙｏn假說(shuō)）。正常男性核型為46，XY。在男性間期細(xì)胞核中，可見(jiàn)位于細(xì)胞核邊緣或核中央處有一極小的黃色熒光亮點(diǎn),就是Ｙ染色質(zhì)（Y小體)，大小約０．25～0．3μm.是Y染色體長(zhǎng)臂特異性著色而形成。人的性別是由X和Y染色體決定的。需要對(duì)人的性別進(jìn)行鑒定時(shí)，除進(jìn)行染色體核型分析和臨床生殖器官的檢查外,還可以通過(guò)細(xì)胞學(xué)方法，如檢查期間體細(xì)胞（口腔上皮，皮膚，羊水和血細(xì)胞等）的核內(nèi)染色質(zhì)—-X和Y染色質(zhì)來(lái)鑒定?！緦?shí)驗(yàn)用品】顯微鏡、熒光顯微鏡、乙醇(無(wú)水乙醇，95％,7０％、50％)，甲醇,冰醋酸，硫堇，１％結(jié)晶紫，１mol/LHCl。二甲苯、香柏油、擦鏡紙、蓋玻片、載片、１5ｍl刻度離心管、牙簽、吸水紙、小鑷子、碘酒、酒精棉球、采血針、3％醋酸溶液、pH6~6.5緩沖液、0。5％鹽酸阿的平染液。（注：硫堇染液（工作液）,①干液（硫堇）：硫堇１g或２g溶于１００mL5０％乙醇中,溶解后過(guò)濾備用；②醋酸鈉緩沖液：醋酸鈉·３H2Ｏ9。7ｇ,巴比妥鈉14。7ｇ，溶于500ｍL蒸餾水中；③0。1mol/L鹽酸；按①：②：③=４０：２８：32比例配成混合液，調(diào)pH5。7±0。2，即得硫堇工作液。)

【實(shí)驗(yàn)步驟】一、X染色質(zhì)的制備和觀察(一）取材１。讓受檢者用水漱洗口腔數(shù)次，以盡量除去口腔內(nèi)細(xì)菌或其它雜物。2。用牙簽鈍頭部或木質(zhì)器具刮取口內(nèi)側(cè)面的口腔粘膜上皮,棄去第一次刮到的細(xì)胞。3。同一部位連續(xù)刮取數(shù)次,將刮取物涮入裝有生理鹽水的離心管內(nèi)。(二）標(biāo)本的制作1.將細(xì)胞懸液的離心管進(jìn)行離心(150０rｐm)１０分鐘,去上清液，留下細(xì)胞團(tuán).2．加入新配制的固定液（３份甲醇︰1份冰醋酸)８ｍL，混勻呈懸液.固定30分鐘.３．離心（同上）,去上清液,留下細(xì)胞團(tuán)。4.加入數(shù)滴(根據(jù)細(xì)胞多少而增減）固定液,充分混勻呈懸液。５。滴一滴懸液至預(yù)先置冰盒中的干凈載玻片上，晾干.每份樣本制片3—4張。（三)染色Kliｎger硫堇染色法1.將玻片標(biāo)本置入1moｌ／LHCｌ中,37℃條件下水解2０分鐘2。用蒸餾水充分沖洗、晾干。3.硫堇染液中染色約15分鐘。4.蒸餾水沖洗、晾干。硫堇染色的優(yōu)點(diǎn)是只有細(xì)胞核清晰著色,胞漿不著色，因此細(xì)胞核背景清晰,利于對(duì)位于核膜邊緣的X染色質(zhì)的辨認(rèn).結(jié)晶紫的染色法1．固定后的玻片標(biāo)本經(jīng)過(guò)70％、50％酒精及蒸餾水(更換兩次蒸餾水）各5分鐘.2.置入１％結(jié)晶紫溶液中染色5～8分鐘。大量制片時(shí)可用0.５％結(jié)晶紫染液，染色10~15分鐘左右。3．95％酒精中分化(快速地在酒精中沾５～8次）。４．繼續(xù)在無(wú)水乙醇中分化，間歇地用顯微鏡檢查,直至標(biāo)本中核結(jié)構(gòu)的微細(xì)部分都很清楚為止（一般約1分鐘）。5.置入二甲苯中.更換2次二甲苯,每次3分鐘,以使標(biāo)本透明.6.樹(shù)膠封片.(四)觀察1。先在低倍鏡（1０倍鏡）下觀察,可見(jiàn)視野中有許多單個(gè)或成堆的口腔上皮細(xì)胞。選擇清楚而分散的細(xì)胞，移至視野中央，再換高倍鏡仔細(xì)觀察.口腔上皮細(xì)胞為多邊形的扁平狀，細(xì)胞中央有一被染成深蘭色的圓形或橢圓形的細(xì)胞核。核周圍均質(zhì)部分為細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞的外表為一很難與細(xì)胞質(zhì)相區(qū)別的薄膜即細(xì)胞膜.2。40倍或油鏡下檢查1００個(gè)“可計(jì)數(shù)細(xì)胞”，并計(jì)數(shù)具有Ｘ染色質(zhì)的細(xì)胞數(shù)。二、Y染色質(zhì)的制片與觀察(一）制作標(biāo)本1.采血與涂片：男同學(xué)用碘酒,酒精棉球常規(guī)消毒食指或耳垂后，用采血針點(diǎn)刺食指或尖或耳垂，擠出2～3滴血于一干凈的底玻片中央，用牙簽將血滴涂成較厚的一層血膜，直徑約1。5cｍ，晾干。2.固定：加3％的醋酸溶液數(shù)滴于血膜上，靜置15分鐘，其間可換液一次,使紅細(xì)胞溶解。3.用pＨ6~６．５磷酸緩沖液沖洗血膜,晾干。4。染色：加0。5％鹽酸阿的平溶液數(shù)滴于血膜上，放置暗處?kù)o置染色1５分鐘。(若使用口服阿的平片劑，則用100mg溶于10ml雙蒸水中，染色時(shí)間為25分鐘）。5.再用磷酸緩沖液沖洗黃色溶液.6．加蓋玻片,在有緩沖液的情況下，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。（二)觀察Y染色質(zhì)先在低倍鏡下觀察,可見(jiàn)許多白細(xì)胞（多為淋巴細(xì)胞）核染成黃色.換高倍鏡，可見(jiàn)位于細(xì)胞核邊緣或核中央處有一極小的黃色熒光亮點(diǎn)，就是Y染色質(zhì)（Ｙ小體），大小約0．2５～0。３μm。最后可用油鏡再仔細(xì)觀察。Ｙ染色質(zhì)在男性白細(xì)胞的出現(xiàn)率可達(dá)60～７0%.注意需要計(jì)數(shù)的細(xì)胞必須是核膜完整無(wú)缺,核質(zhì)染色均勻,清晰可見(jiàn)，核周圍無(wú)細(xì)菌和其它污染物質(zhì)的干擾。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】觀察并計(jì)算Ｘ染色質(zhì)的陽(yáng)性率.X染色質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)是:１.位于核膜內(nèi)緣。2．核內(nèi)唯一的濃染、輪廓清楚的小體,直徑約為１～1．5μｍ，一般呈平凸形、圓形、扁平形或三角形。(注：配制的ｐH6～6。5的磷酸緩沖液要用黑紙或茶色瓶置于冰箱保存,有效期一個(gè)月。)?實(shí)驗(yàn)三姊妹染色單體交換實(shí)驗(yàn)SiｓtｅrChｒomoｓoｍｅEｘchａngｅ(SCＥ)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴煜ぶ苽洌覥Ｅ標(biāo)本的原理和基本程序?！緦?shí)驗(yàn)原理】姊妹染色單體交換（Sistercｈroｍａt(yī)ialexchange，SCＥ）是染色體同源座位上復(fù)制產(chǎn)物間的相互交換，是同一染色體的兩條單體之間發(fā)生的一類特殊的同源重組，主要在ＤNA合成期形成,可能與DNＡ雙鏈的斷裂與復(fù)制有關(guān),ＳＣE的發(fā)生的頻率可反映細(xì)胞在S期的受損程度。如果一個(gè)個(gè)體的ＳCＥ率明顯增高,可表明染色體受到環(huán)境中的一定因素的影響,或是受到遺傳缺陷的內(nèi)在制約因素所致。在細(xì)胞分裂時(shí),每條染色體均有兩條染色單體組成，每條染色單體有一條雙鏈DNＡ組成。5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5—ｂrｏmｏdeoxy—uｒidinｅ,BrｄU)是脫氧胸腺嘧啶核苷的類似物，在DNA鏈的復(fù)制過(guò)程中,可替代胸腺嘧啶。當(dāng)細(xì)胞生存環(huán)境中存在BrdＵ時(shí)，BrｄU取代脫氧胸苷摻入到復(fù)制的ＤＮA中。經(jīng)兩個(gè)復(fù)制周期后，兩條姊妹染色單體中一條DNＡ的雙鏈均有BｒdU摻入，而另一條DNA雙鏈中僅有一條鏈有BｒｄＵ摻入。利用特殊的分化染色技術(shù)對(duì)染色體標(biāo)本進(jìn)行處理,可使雙鏈均含有BrdU摻入的單體淺染，而只有一條鏈摻入BrｄU的單體深染。當(dāng)姊妹染色體間存在同源片段交換時(shí),可根據(jù)每條單體夾雜著深淺不一的著色片段加以區(qū)分。由于姐妹染色單體的ＤNＡ序列相同，SCE并不改變遺傳物質(zhì)組成，但SCＥ是由于染色體發(fā)生斷裂和重接而產(chǎn)生的,因此,SCE顯示方法通常用來(lái)檢測(cè)染色體斷裂頻率,用來(lái)研究藥物和環(huán)境因素的致畸效應(yīng)?！緦?shí)驗(yàn)用品】１。超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、冰箱、離心機(jī)、顯微鏡、采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、刻度離心管、膠塞、乳頭吸管、試管架、載玻片、托盤(pán)天平、干燥烤箱、染色缸、電吹風(fēng)、30W紫外燈。2.試劑:RPMI1640培養(yǎng)液、小牛血清、秋水仙素(100μg/mL）、5—溴尿嘧啶（ＢrdＵ,200μg/ｍＬ）、低滲液（0．07５moｌ/ＬKＣL溶液)、2×SSＣ、Gｉemｓa原液、甲醇、冰乙酸?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1．按半微量法采取外周靜脈血,接種培養(yǎng).2。37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，加ＢrdＵ溶液（終濃度為８μ3．用黑紙包裹培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。4。收獲前加入秋水仙素（終濃度為0。2μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。５。常規(guī)法制片。將玻片標(biāo)本室溫放置2～3天。6。分化染色前一天，將標(biāo)本置37℃7。在平皿中平行放置兩根牙簽,將玻片放在牙簽上,加適量2×ＳSC溶液(以不超過(guò)標(biāo)本為度)。在標(biāo)本上蓋一張比玻片稍大的擦鏡紙,使紙邊浸入2×SSC溶液中，并使2×ＳＳＣ溶液滲至玻片標(biāo)本上，保持標(biāo)本濕潤(rùn)。8．將平皿置５5℃水浴面上，用30Ｗ紫外燈垂直照射標(biāo)本30分鐘,照射距離1０ｃm9．照射后輕輕取掉擦鏡紙,立即用蒸餾水沖洗標(biāo)本.１０。Gieｍｓa染色5～１０分鐘；蒸餾水沖洗標(biāo)本，氣干。11.鏡檢，計(jì)數(shù)。每個(gè)末端交換記為1次ＳＣＥ,中部交換記為2次SCＥ?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】觀察30個(gè)細(xì)胞的分裂相，記錄每個(gè)細(xì)胞的ＳCE總數(shù)，計(jì)算SCE頻率。n個(gè)中期分裂相ＳCＥ之和SCE頻率=ｎ個(gè)細(xì)胞中國(guó)人正常SCE頻率為５.7±0．４。?實(shí)驗(yàn)四銀染核仁形成區(qū)與近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合ＡｇＮO3StaｉｎinｇNOＲanｄＳａt(yī)ellitｅＡｓsociationｏｆAｃrｏceｎtｒicChromosｏme【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴煜ゃy染的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】人類近端著絲粒染色體的副縊痕與核仁形成有關(guān)，故稱為核仁形成區(qū)(ＮOR）。當(dāng)位于此處的18S、28Ｓ核糖體RNＡ的基因（rDNA)具有轉(zhuǎn)錄活性時(shí)，應(yīng)用銀染技術(shù)可使NＯR特異性著色（褐黑色）。進(jìn)一步證明銀染物質(zhì)不是rDNＡ，亦不是rRNA,可能是核仁形成區(qū)特異的蛋白質(zhì),即和ｒRＮA轉(zhuǎn)錄相聯(lián)系的酸性蛋白。人類核糖體RＮA基因位于5對(duì)近端著絲點(diǎn)染色體短臂的次猛痕處,即人類的核仁形成區(qū)。在正常人中，不是所有核仁形成區(qū)均被銀染，其范圍大約4-1０。應(yīng)用銀染法可以覺(jué)察正常人體核糖體ＲNA基因的活動(dòng)。此外，人類近端著絲粒染色體的隨體間易發(fā)生聯(lián)合,應(yīng)用銀染技術(shù)可在發(fā)生聯(lián)合的染色體間清楚地看到銀染物質(zhì)相連.因此，應(yīng)用銀染核仁形成區(qū)（Ag-NOR）與近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合（Ａｇ—AA）技術(shù),可以分析有活性的rＲＮA基因的動(dòng)態(tài)變化。正常人Ag－NOR平均為5．8／細(xì)胞?！緦?shí)驗(yàn)用品】1．恒溫水浴箱、顯微鏡、平皿、牙簽、擦鏡紙、鑷子;２.預(yù)制染色體玻片標(biāo)本、0。1%甲酸、AgNＯ3(50%）。1:20Gｉemsa，5moｌ／LHＣl?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1．按半微量法采取外周靜脈血，接種培養(yǎng)。常規(guī)法制片。將染色體玻片標(biāo)本在室溫下放置2～3天。２．將標(biāo)本置入5moｌ/LHCl溶液中常溫處理5分鐘,蒸餾水沖洗２—3次，甩干。3.將５００mｇAｇNＯ3溶于1ｍl0.1％甲酸溶液中,混勻后立即滴4~５（5ml）滴至玻片標(biāo)本上.4.在平皿中平行放置兩根牙簽，將玻片標(biāo)本放在牙簽上。5。在標(biāo)本上蓋一張比玻片稍小的擦鏡紙,用鑷子掀動(dòng)紙片數(shù)次,使染液均勻分散在標(biāo)本上。6。將平皿置于６0℃水浴箱中處理3—５分鐘７。蒸餾水沖洗去擦鏡紙,以１:2０Giemsa染液復(fù)染3分鐘。水洗,氣干。8。鏡下觀察?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】１.Ag—NOR的計(jì)數(shù)：選擇銀染著色清晰的分裂相，計(jì)數(shù)6個(gè)Ｄ組(1３、１4、和15號(hào)染色體）和4個(gè)G組(2１和22號(hào)染色體)近端著絲粒染色體,不論單側(cè)或雙側(cè)的銀染點(diǎn)都計(jì)數(shù)為一個(gè)有銀染的染色體。2.Ag-AA計(jì)數(shù)：凡近端著絲粒染色體之間有銀染物質(zhì)相連的,均計(jì)數(shù)為Ａg—ＡA。涉及2條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，記為1個(gè)Ag—AＡ;涉及3條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，如未形成閉環(huán)的,記為２個(gè)Ag—AA；３條染色體聯(lián)合形成閉環(huán)時(shí)，記為3個(gè)Ag—AA;依此類推。N個(gè)核型中含NOＲ染色體數(shù)之和NOR均值=Ｎ個(gè)核型（注：避免ＡgNＯ3溶液污染皮膚，否則將其染成褐黑色，很難洗掉.）實(shí)驗(yàn)五核酸提取TheＥxtｒaｃｔｉｏnoｆＮucｌeicAｃid【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?。掌握核酸提取的基本原理和基本方法２。掌握檢測(cè)核酸濃度及純度的原理及方法【實(shí)驗(yàn)原理】DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此DNA的提取也應(yīng)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成ＤNＡ提取方面的工作，那就根本談不上進(jìn)行分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)。在ＤNA提取過(guò)程中應(yīng)做到：１、根據(jù)不同研究需要，保證結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性；2、盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RＮＡ等）；３、保證提取樣品中不含對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。核酸的提取關(guān)鍵是去除蛋白質(zhì)，通常情況下,先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后,再用有機(jī)溶劑抽提,在單價(jià)陽(yáng)離子存在下,核酸在乙醇中形成沉淀.作DＮA或RNA定量時(shí)，應(yīng)在2６０nm和２80ｎm兩個(gè)波長(zhǎng)下讀數(shù)。在２60ｎm的讀數(shù)用于計(jì)算樣品中的核酸濃度,ＯD值為1相當(dāng)于大約5０μg/ml雙鏈ＤＮA，４0μｇ/ml單鏈DNA或RＮA及大約２0μg/mｌ單鏈寡核苷酸。根據(jù)在26０nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計(jì)核酸的純度。DNA及RNA純品的OD2６0／OD280值分別是1.8和2。０，如果樣品中污染有蛋白或酚,其OＤ260／OD28０將明顯低于此值,此時(shí)無(wú)法對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行精確定量.【實(shí)驗(yàn)用品】１.臺(tái)式離心機(jī)；電熱恒溫水浴箱；冰箱；紫外分光光度計(jì);一次性塑料手套.2.微量加樣器(1000μl,200μl,２0μl);Tip頭（10０0μl，200μl，2０μl)。Ｔip頭盒(1０00μl，200μl，20μl）；Eｐpendｏｒfｆ管（2ml,1．5mｌ,0。5ｍl）,Epｐendｏrff管架。３.DNA提取的相關(guān)試劑:蛋白酶Ｋ(10mg／ｍｌ),-20℃保存。ＴE(pH８.0）:１0mmol/LTrｉs。Cl（ｐH8．０），1mmol/LＥDTA（pＨ８。0）,1５磅3）１0%SDS：1０ｇSDS溶于90mｌ水中，加熱68℃4)3MＮaＡc:8００ml水中溶解408．1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5。2,加水定容至１Ｌ，高壓滅菌，室溫保存。5）飽和氯化鈉，7０％乙醇,氯仿6)飽和酚【實(shí)驗(yàn)步驟】飽和氯化鈉抽提法提取外周血DNA1.取0．5ml抗凝全血，加入0.8mlＴE（pＨ８。0)混勻;2．室溫離心，100０0rpm，1分鐘;３．棄上清，加入0.4ｍｌTE（pH8.0)，混勻，懸浮細(xì)胞;4．加入１０mｇ／ml蛋白酶Ｋ5μl（終濃度１0０μｇ／ｍｌ)，10％SＤＳ２5μl（終濃度0.5％）,混勻；５．37℃水浴消化過(guò)夜,或5０6．加入1/3體積的飽和氯化鈉，充分混勻，4℃7。10０00rpｍ離心10分鐘，取上清于另一新管中;8。加入等體積氯仿,混勻，10000rｐｍ離心1０分鐘;9．取上清于另一新管中，加入1/20體積的3ＭNaAc（pＨ5。2）混勻；10.加入２倍體積無(wú)水乙醇輕輕混合，1000０rpm離心1分鐘;11．棄上清，加入70%乙醇0。5ml,充分洗滌;１2．10000ｒpm離心1分鐘,棄上清，自然干燥DＮA約５分鐘;1３．加入２00－25０μｌTE，-2０℃14。檢測(cè)濃度及純度。酚氯仿抽提法提取外周血DＮA１。外周血反復(fù)凍溶破壞紅細(xì)胞,取0.5ml外周血,加入0.5mlＰBS混勻后,10000rpｍ離心10分鐘；2．棄上清，加入18０μｌTＥ（pH8．0)，2０μl1０%SDＳ,１0mg/mｌ蛋白酶K5μl(終濃度１0０μg/ml）混勻;３．３7℃水浴消化過(guò)夜,或５０４．加入等體積的飽和酚并充分混勻，１0０００rpｍ離心10分鐘；5．吸取上清液于另一新管中，重復(fù)上一步驟一次；6．吸取上清液于另一新管中，加入等體積的酚氯仿并充分混勻，10０0０rpｍ離心10分鐘;７.吸取上清液于另一新管中，加入1/20體積的3MＮaAc（ｐH５。2）混勻后,加入2倍體積無(wú)水乙醇并輕輕混合，可見(jiàn)絮狀乳白色ＤＮA團(tuán)塊，１0００0rpｍ離心１0分鐘；８.棄上清，加入7０％乙醇0。５ｍl,充分洗滌；9.10000rpm離心1分鐘，棄上清，自然涼干后加入TＥ液，—２010。檢測(cè)濃度及純度組織總RNA的提取1。將組織用錫箔紙包裹后于液氮中凍10miｎ，擊碎后回收入2ｍl無(wú)菌Eppenｄｏrff管中。按50－1００mg組織樣品加1mlＴRIZOL試劑進(jìn)行組織勻漿，樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIＺOL試劑體積的１0%;２．將組織勻漿液在１5－30℃放置5min，促使核蛋白復(fù)合物完全解離,按1mlTＲＩZOL，加入0.2ｍl氯仿，劇烈震蕩１5s，15-30℃放置2-3min，在2－８℃，離心轉(zhuǎn)速不超過(guò)3。在上清液中按１mlＴRIZOL試劑（最初勻漿體積)加入0.5ml異丙醇混勻,15—30℃放置１0miｎ，在2—8℃4.棄上清,７0％乙醇洗滌RNA沉淀(1mlＴＲIZOＬ試劑至少加入1ｍｌ70％乙醇)，振蕩混勻，在２－8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過(guò)7５00ｇ，離心5min5．室溫或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中（55℃６。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)ＲNA濃度和純度；７.1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分離總RＮA，每孔上樣２5μg，６５V，2．５h,以檢測(cè)ＲNA的質(zhì)量?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果分析】1.計(jì)算已提取的DNA的濃度和純度【思考題】1．DNＡ提取還有哪些方法?２.RNＡ提取中關(guān)鍵問(wèn)題是什么？實(shí)驗(yàn)六DＮA重組技術(shù)RecombｉnａｎtDNA【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．掌握ＤNＡ重組技術(shù)的基本原理和基本方法2．熟悉質(zhì)粒DＮA的小量制備及酶切鑒定方法【實(shí)驗(yàn)原理】1．DNA重組技術(shù)重組DNA（ＲecombinantDNA）技術(shù)是遺傳工程的核心技術(shù)，也是人類在基因和ＤNA分子水平進(jìn)行操作的技術(shù)。它包括以下幾個(gè)步驟：重組DNA分子的構(gòu)建：即將目的基因（ＤNA或cDNＡ片段）與載體DＮＡ重組，應(yīng)用TA克隆方法，將ＰCR擴(kuò)增產(chǎn)物快速克隆至質(zhì)粒載體中.該方法利用了PCR過(guò)程中使用的熱穩(wěn)定聚合酶(Taq酶)在所復(fù)制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸（A)，從而產(chǎn)生一Ａ—粘性末端的性質(zhì)，設(shè)計(jì)一種線性載體，使之含有一T-粘性末端,可直接插入ＰCR產(chǎn)物，在DNA連接酶作用下,目的DNＡ和載體DNA連接形成重組DNA分子.將重組DＮA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。克隆選擇增殖：將轉(zhuǎn)化后的液體涂布于瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA(TA克隆載體分子）含有相應(yīng)抗生素的抗性基因，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成集落.挑取菌落,置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),得到大量含重組DNA的細(xì)菌。收獲擴(kuò)增后的培養(yǎng)細(xì)胞，提取重組DNA分子(質(zhì)粒)，并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。圖2。1ＴA克隆原理示意圖圖2。2克隆選擇增殖原理示意圖２．質(zhì)粒DNA的小量制備常見(jiàn)的質(zhì)粒DＮＡ提取方法有簡(jiǎn)易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。本實(shí)驗(yàn)采用的是堿裂解法，堿裂解法的原理：在PH12。0~12．６堿性環(huán)境中,線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性,而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒(CC）DNA仍為自然狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下,染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分染色體DＮA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DＮA仍為可溶狀態(tài).通過(guò)離心，將可去除大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中,再用乙醇沉淀回收質(zhì)粒DＮＡ.3．質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物體內(nèi),根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能特性分為:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切點(diǎn)不固定，Ⅲ型其切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外，只有Ⅱ型其特異性切點(diǎn)位置可以控制和預(yù)測(cè)，可以產(chǎn)生固定的ＤNA片段,基因工程中所用的限制酶均為Ⅱ型限制酶。這類酶的特點(diǎn)是具有能夠識(shí)別雙鏈DNA分子上的特異性核苷酸序列的能力，能在這個(gè)特異性核苷酸序列內(nèi)切斷DＮA雙鏈,形成一定長(zhǎng)度和順序的DNA片段。選擇合適的限制酶對(duì)重組的環(huán)狀質(zhì)粒進(jìn)行酶切,將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用已知相對(duì)分子量的線狀ＤNA（ＤNA分子量標(biāo)志）及未經(jīng)酶切的重組環(huán)狀質(zhì)粒為對(duì)照，可以對(duì)重組環(huán)狀質(zhì)粒中的目的ＤNA分子進(jìn)行初步鑒定.【實(shí)驗(yàn)用品】1．ＰCR擴(kuò)增儀；恒溫振蕩培養(yǎng)箱;超凈工作臺(tái)；細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱；臺(tái)式高速離心機(jī)；電熱恒溫水浴箱；冰箱；電泳儀；電泳槽，樣品槽模板(梳子)；紫外燈;保鮮膜；一次性塑料手套;凝膠自動(dòng)成像儀.2.三角燒瓶（50０ｍl，2５０ml，１00mｌ），培養(yǎng)皿，玻璃試管，試管塞,玻璃棒，酒精燈,鑷子，脫脂棉，紗布，乙醇,容器盒。3．微量加樣器（10００μｌ，20０μl，20μl）;Tip頭（1００0μl,200μl，２0μｌ）。Tｉp頭盒(１０0０μｌ,200μl,20μl）；Ｅppeｎdorff管（２ｍl，1。5ml，0。5mｌ)，Eppendoｒff管架.Parafilm，透明膠帶.4。DNA重組相關(guān)試劑:1）TａｑDNA聚合酶,緩沖液，dNTP，特異性引物，靶DNA;凝膠回收試劑盒；TA克隆載體:pMD１8—T;感受態(tài)細(xì)菌；氨芐青霉素(1０0ｍg/ｍl）。LＢ培養(yǎng)基：胰蛋白胨1０g,酵母提取物5g，氯化鈉１0g,10NNaOH調(diào)ｐH至7.０定容至1L。15磅高壓消毒，4℃３）LB瓊脂培養(yǎng)基:15ｇ瓊脂粉溶于1０00mlＬB培養(yǎng)基，15磅５．質(zhì)粒提取試劑：溶液Ⅰ(10×):0.5M葡萄糖；0．25MＴris—Cｌ（pH8。0);0．1MEDTA,1０磅高壓消毒，4溶液Ⅱ:0。2ＮNaＯH；1％SＤS室溫貯存,即用即配。溶液Ⅲ：3ＭNaOＡc（pH4．8）10磅RNA酶A：10mg/mｌTE緩沖液:１０mMTｒｉs－Cl（pH7.6),1mMEDTA（pH8。0）６．質(zhì)粒DＮA的限制性內(nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑:限制性內(nèi)切酶HiｎｄⅢ、XbaｌⅠ及酶反應(yīng)所需緩沖液;瓊脂糖；溴化乙啶貯存液（１0mg/ｍl）；6×載樣緩沖液。Tｒｉs-乙酸(TAE)貯存液:50×：２4２克Tｒｉｓ堿，57。1ｍl冰乙酸,１00ml0。5mol/LEDＴＡ(ｐH８。0）加水至１Ｌ【實(shí)驗(yàn)步驟】1.PCR產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段。2.目的DNＡ片段連接至T／Ａ克隆載體即重組DNA分子的構(gòu)建反應(yīng)體系及條件如下：ＰMＤ18－TVｅctｏｒ（5０ng／μl）１μl目的ＤNA（５ng/μl）4μｌ連接液Ⅰ5μl10μｌ1６℃圖2。３pＭD１８-T載體3．轉(zhuǎn)化3.1將感受態(tài)細(xì)胞置冰中融解.3。2將60μl感受態(tài)細(xì)胞移至無(wú)菌試管內(nèi)。3.３加入用于轉(zhuǎn)化的DＮＡ10μl（〈10ng),輕彈管底混勻。３．4冰中放置30分鐘。3.542℃３。6冰中放置２～3分鐘。3．７加入37℃預(yù)溫好的LB培養(yǎng)基94０μｌ３．8３7℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(160~225ｒｐm4.篩選及增菌4。1取適量涂布瓊脂平板。4．２３7℃4．3挑取菌落,放在2～５mlLB液體培養(yǎng)基中（含５0μg／mlAmp）過(guò)夜培養(yǎng)(240ｒpｍ）。4．4收集細(xì)菌，提取質(zhì)粒。5．質(zhì)粒ＤNＡ提取5．12mｌ菌液以1２000ｒpm離心１分鐘.5.2棄上清，沉淀物溶于10０μｌ溶液Ⅰ(1×)中，劇烈振蕩，室溫5分鐘。5．3加新配制的溶液Ⅱ20０μl，充分混合后冰浴5分鐘。５.4加溶液Ⅲ1５0μl，混勻冰浴5分鐘。5。５12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。5。６加9０0μl(２倍體積)的乙醇,震蕩混合,室溫放置2分鐘，沉淀雙鏈DNＡ。5.712000rｐｍ離心５分鐘。5。８小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡.５。9用１ml70%乙醇洗滌沉淀的雙鏈ＤNＡ，按“步驟5.８”所述方法去掉上清,在空氣中使沉淀的DNＡ干燥5。１0用50μl含胰RNA酶(20μｇ/mｌ)的ＴＥ重新溶解核酸，振蕩,貯存于－2０6。質(zhì)粒DＮA的限制性內(nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定６。1質(zhì)粒ＤNA的限制性內(nèi)切酶酶切將清潔、干燥、滅菌的Eｐｐenｄｏrff管（0．５ml)編號(hào),用微量加樣器按表1所示將各種試劑分別加入每個(gè)管內(nèi)。表1質(zhì)粒ＤNA的限制性內(nèi)切酶酶切加樣表編號(hào)試劑1（實(shí)驗(yàn)組）2(對(duì)照組）酶反應(yīng)所需緩沖液2μl2μl０.1%BSA１μl1μｌ限制性酶HindⅢ１μl限制性酶XｂalⅠ1μl質(zhì)粒DNA８μl8μｌ無(wú)菌去離子水7μｌ9μl總體積2０μl20μl加樣后，小心混勻，置于37℃水浴消化過(guò)夜，然后６5℃20分鐘終止酶解反應(yīng).各酶切樣品于6。２瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定質(zhì)粒ＤＮA酶切片段6.取有機(jī)玻璃內(nèi)槽,洗凈晾干。取透明膠帶將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（注意,將透明膠帶緊貼于有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊上，不要留空隙)。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置，在距離底板0。５～１．0mｌ的位置放入梳子。6.稱取0．6克瓊脂糖，置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入５0ml1×ＴＡＥ,瓶口用保鮮膜封蓋,在微波爐中加熱直至瓊脂糖全部溶解,得到1.２％瓊脂糖凝膠液，待其冷卻至６5℃左右，加入2．5μl溴化乙啶貯存液（10mg/ｍl),使溴化乙啶終濃度為0．5μg/ｍl。小心混勻并倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽中，控制灌膠速度，使膠液緩慢展開(kāi),避免產(chǎn)生氣泡,直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層.室溫下靜置1小時(shí)左右,待膠凝固完全后,輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開(kāi)的樣品槽。將凝膠放入電泳槽中，加入恰好沒(méi)過(guò)膠面1mｍ6。取適量的酶切樣品,加入6×載樣緩沖液適量（終濃度為1×）,用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)。６．加完樣品后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳,ＤNA帶負(fù)電荷,由負(fù)極向正極移動(dòng)。電場(chǎng)強(qiáng)度不高于5Ｖ/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距離膠板下沿１～2cm處,停止電泳.6。取出凝膠,在波長(zhǎng)為2５4nm的紫外燈下觀察凝膠.DＮＡ存在處顯示出紅色的熒光條帶。在紫外燈下觀察時(shí)，應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或采用有機(jī)玻璃防護(hù)罩，避免眼睛遭受強(qiáng)紫外光損傷.以上步驟也可以用凝膠自動(dòng)成像儀處理?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果分析】１.記錄DNA重組的方法.2。觀察分析經(jīng)酶切質(zhì)粒ＤＮA(實(shí)驗(yàn)組）和未經(jīng)酶切質(zhì)粒DＮA（對(duì)照組)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果.【思考題】為什么PCR產(chǎn)物需經(jīng)純化后再與載體連接?重組DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，為何３7℃?實(shí)驗(yàn)七PCR-RFＬP分析技術(shù)PoｌyｍeraｓｅChainReacｔion–RestrictionFragｍｅｎｔLenｇtｈPolymorphiｓm【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．熟悉PCR—RFLＰ分析技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)步驟.2.掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法。3．了解PCＲ—RＦLP在遺傳病基因診斷中的作用?！緦?shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ＰCR)是模擬體內(nèi)ＤNA復(fù)制條件在體外酶促合成特異ＤNA片段的循環(huán)反應(yīng),可使目的ＤNA片段得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板ＤNA置于高溫（約９3℃－95℃)下使之變性解鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫（約50℃—70℃）下分別與目的ＤNA片段兩側(cè)的互補(bǔ)序列復(fù)性結(jié)合;引物在DNA聚合酶作用（約7０℃－75℃）下沿模板按５'聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)（PCR—RFLP)分析技術(shù)是在ＰCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。ＤNA堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，使酶切位點(diǎn)增加或者消失，利用這一酶切性質(zhì)的改變，PCR特異擴(kuò)增包含堿基置換的這段DNA,經(jīng)某一限制酶切割,再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來(lái)確定是否變異。應(yīng)用PＣＲ—RFLＰ，可檢測(cè)某一致病基因已知的點(diǎn)突變，進(jìn)行直接基因診斷,也可以此為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析進(jìn)行間接基因診斷。本實(shí)驗(yàn)以家族性甲型血友病患者及其相關(guān)成員外周血DNＡ為模板，PCR擴(kuò)增凝血因子FⅧ基因的58３bp特異片段產(chǎn)物，其中包含MspⅠRFLP多態(tài)位點(diǎn)，經(jīng)MspⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)等位片段的長(zhǎng)度(５８3ｂp或３６0bp+223bp），以此為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，判斷胎兒是否得到了帶有缺陷FⅧ基因的染色體，從而做出間接基因診斷?！緦?shí)驗(yàn)用品】１.DNA（50ng／μl)、引物Ⅰ和Ⅱ(２０μΜ）、TａqDNA聚合酶(5U／μｌ）10×ＰCR反應(yīng)緩沖液、ｄNTP(２．5ｍM）、滅菌蒸餾水、液體石蠟、限制性內(nèi)切酶MsｐⅠ（20U/μl)、1０×酶切緩沖液.２.2％的瓊脂糖凝膠、5×TAE、6×上樣緩沖液、DNAMarker、溴化乙啶貯存液（１０mg/mｌ）(EB）。3．PCＲ自動(dòng)熱循環(huán)儀、紫外透射儀、微量加樣器（20μl、２00μl)、槍頭（２0μl、20０μｌ）及離心管（１ml、0。5ml)、容器盒、恒溫水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、燒杯、保鮮膜、封口膜、浮漂、微波爐、２50ml三角燒瓶、透明膠帶、托盤(pán)天平、臺(tái)式高速離心機(jī).【實(shí)驗(yàn)步驟】一．PＣＲ反應(yīng)PＣR反應(yīng)體系２０μl,其成分如下：ddH２O12．5μl１0×PCR緩沖液2．5μｌdＮＴP（2.5mM）2.0μl引物1(20μM）０.5μl引物2（20μM)0．5μｌTaqE(5U/μｌ)0.15μl模板DＮA2.0μl２０μｌ按以上次序，將各物質(zhì)加入到一只無(wú)菌的０.5mｌ離心管中。輕輕混勻后,離心5秒鐘，加入一滴液體石蠟蓋于反應(yīng)混合液的表面，然后放入ＰＣＲ儀中進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。PCＲ反應(yīng)循環(huán)溫度：9４℃94℃變性３0秒；58℃復(fù)性３０秒;7２℃最后經(jīng)72℃反應(yīng)結(jié)束后置4℃二。PＣR產(chǎn)物的MspⅠ酶切反應(yīng)體系２0μl其成分如下:無(wú)菌水9μl１0×Ｂｕｆfer２μlBSA２μlＭｓpⅠ(10U／μl）1μlＰCR產(chǎn)物6μl２0μl置37℃水浴消化1小時(shí)，４℃瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)1。膠板的準(zhǔn)備取有機(jī)玻璃內(nèi)槽,洗凈晾干.取透明膠帶將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（注意,將透明膠帶緊貼于有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊上，不要留空隙)。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置，在距離底板0．５~1。0ml的位置放入梳子。2．２%的瓊脂糖凝膠的制備稱取1克瓊脂糖，置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入50ml１×TAE，瓶口用保鮮膜封蓋,在微波爐中加熱直至瓊脂糖全部溶解，得到２%瓊脂糖凝膠液，待其冷卻至65℃左右，加入2。5μl溴化乙啶貯存液（１0ｍg/ｍl)，使溴化乙啶終濃度為0．5μg/mｌ。小心混勻并倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽中，控制灌膠速度，使膠液緩慢展開(kāi),避免產(chǎn)生氣泡,3．將凝膠放入電泳槽中,加入恰好沒(méi)過(guò)膠面1mm深的足夠電泳緩沖液，預(yù)電泳10mｉｎ。4．每份限制酶切產(chǎn)物取1０μl,加2μl6×上樣緩沖液,混勻后加入到樣品孔中，以1０0V電泳５0分鐘。５。斷電后取出凝膠，放在紫外透射儀中觀察并記錄PCR-RＦLＰ結(jié)果?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】根據(jù)甲型血友病患者及其相關(guān)成員的親屬關(guān)系繪制遺傳系譜圖,觀察并記錄瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA片段長(zhǎng)度,繪制出家系各成員FⅧ基因ＭｓpⅠＲFＬＰ等位片段與系譜相關(guān)圖,進(jìn)行連鎖分析，判斷胎兒是否是甲型血友病患兒。家系系譜：電泳結(jié)果：附病例：現(xiàn)有一名女性已生過(guò)一個(gè)甲型血友病兒子和一個(gè)表型正常的女兒，追問(wèn)家族史其弟弟也是甲型血友病患者.該女性現(xiàn)妊娠４個(gè)月,要求作產(chǎn)前基因診斷。（注：胎兒性別產(chǎn)前基因診斷結(jié)果：SRY(+）,ZFX/ZFY(+／+）。）實(shí)驗(yàn)八PCＲ-SＳCPＰｏlymeｒaseＣhaｉｎＲｅactｉon-SingleStrandConformatiｏnＰｏlyｍorphism【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹浚?了解ＰＣＲ－SSCP技術(shù)的原理。2．了解并熟悉PＣR－ＳSCP技術(shù)的步驟?！緦?shí)驗(yàn)原理】PCＲ-ＳSＣＰ是198９年日本Orita等創(chuàng)建的篩查突變的新技術(shù).它是一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的點(diǎn)突變篩查手段。PCR－SSCP技術(shù)的基本原理是PＣＲ擴(kuò)增后的DNＡ片段經(jīng)變性成單鏈DNA,單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動(dòng)速率，相同長(zhǎng)度的DＮA單鏈其核苷酸順序僅有單個(gè)堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動(dòng)速率的不同,產(chǎn)生不同的泳動(dòng)帶。PCR擴(kuò)增后的DNＡ片段經(jīng)變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳，與正常比較出現(xiàn)泳動(dòng)帶的變位即可推測(cè)存在堿基置換。其堿基置換的性質(zhì)必須經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序才能確定。因此PＣＲ－SＳＣＰ檢測(cè)是測(cè)序之前突變篩查的常用手段.為了便于觀察分析結(jié)果，ＰCＲ擴(kuò)增體系中常加入-３2PｄNＴP標(biāo)記PCR產(chǎn)物，電泳后放射自顯影觀察泳動(dòng)帶的位置。目前也常用銀染法來(lái)染色聚丙烯酰胺凝膠上的ＤNA泳動(dòng)帶,此方法可避免同位素的污染及對(duì)操作者的輻射損傷，但其靈敏度不如用同位素標(biāo)記。單鏈DNA片段的立體構(gòu)象主要與堿基序列相關(guān),但也受到其他條件的影響。因此，PCR－ＳSＣＰ技術(shù)的關(guān)鍵在于電泳時(shí)的諸多條件，如凝膠的組成、電泳的溫度、離子濃度以及影響分子內(nèi)相互作用的其他溶質(zhì)等。PCR-SSCP的缺點(diǎn)是存在假陰性和假陽(yáng)性，一般對(duì)長(zhǎng)度不超過(guò)300bp的待測(cè)片段的檢出率為70～８0％.【實(shí)驗(yàn)用品】1．PCＲ擴(kuò)增儀；聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置；電泳儀；電泳槽。2．6％非變性聚丙烯酰胺凝膠（49:1）、１TBE、10％過(guò)硫酸銨、TＥMEＤ、甲酰胺上樣緩沖液、固定液、銀染液、顯色液、瓊脂糖3.微量加樣器(２００μl，２0μl）;Tip頭(200μl，20μl）.Ｔip頭盒（200μl，2０μl）；Eｐｐｅndorf管（0.５ml，0.２ml),Ｅｐｐendorf管架。4.ＰCR擴(kuò)增相關(guān)試劑。【實(shí)驗(yàn)步驟】１。PCＲ反應(yīng)(同前）PCＲ產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確認(rèn)。２.ＰCR反應(yīng)結(jié)束后,取５μl擴(kuò)增產(chǎn)物加１0μl甲酰胺上樣緩沖液混勻，９８℃３．非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳３．1制備50ml6%非變性聚丙烯酰胺凝膠,加TEMED25μl、１0％過(guò)硫酸銨250μl，混勻后灌膠,插入加樣梳子.待膠完全聚合后,拔出加樣梳子，安裝電泳裝置，加入1TBＥ電泳緩沖液，緩沖液應(yīng)高于加樣孔上緣,用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔。3。2取已變性的5μｌPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加到點(diǎn)樣孔中,以20０V/cm電泳4~5小時(shí).３。3拆下電泳裝置,取出聚丙烯酰胺凝膠，放到一個(gè)塑料盤(pán)內(nèi)，用蒸餾水沖洗1～2遍。３．4倒入固定液，固定８~10分鐘。３．5用蒸餾水沖洗1~２遍;倒入銀染液，銀染10~12分鐘。3。6用蒸餾水沖洗若干遍;倒入顯色液,顯色至出現(xiàn)清晰的銀染帶.3