核酸分析的學(xué)習(xí)教案

核酸分析的學(xué)習(xí)教案第1頁/共65頁2

與DNA相比，RNA的結(jié)構(gòu)較為簡單，它主要是以單鏈形式存在，有時(shí)也能形成局部的雙鏈發(fā)夾式結(jié)構(gòu)。它的一般功能是翻譯，轉(zhuǎn)錄DNA分子所含的信息，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。

核酸在生物的生長、發(fā)育和繁殖等正常生命活動(dòng)中起著非常重要的作用。此外，核酸與生命的異?，F(xiàn)象(如：腫瘤)的發(fā)生和遺傳性疾病等緊密關(guān)聯(lián)。因此，核酸是現(xiàn)代生物學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)重要的研究領(lǐng)域之一。第2頁/共65頁34.1.脫氧核糖核酸及核糖核酸的結(jié)構(gòu)核酸是由大量的核苷酸單體以聚合方式組成的極長的線狀聚合物。不同核酸的核苷酸數(shù)目可以從80(轉(zhuǎn)移核糖核酸，tRNA)個(gè)堿基對(duì)大到108個(gè)堿基對(duì)。表示雙鏈和單鏈核酸大小的單位分別為堿基對(duì)(bp，basepare)和堿基(b，base)，kbp和Mbp分別代表1000和1000000個(gè)堿基對(duì)，而1kb則代表l000個(gè)堿基。例如，噬菌體染色體的大小為4MbP，分子量大約為3×lo9，長度為1.5mm。DNA比RNA大得多，如人細(xì)胞核最小的DNA分子中堿基對(duì)數(shù)目為4.5Mbp，最大的RNA分子僅含50kb，二者相差約1000倍。第3頁/共65頁44.1.1堿基、核苷及核苷酸核苷酸是核苷的磷酸酯，它們是脫氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)的組成單元。RNA的組成單元是核糖核苷酸，而DNA的組成單元是2’—脫氧核糖核苷酸。核酸中的五種主要堿基的結(jié)構(gòu)第4頁/共65頁5由堿基和核糖結(jié)合所形成的-糖苷類化合物稱為核苷。第5頁/共65頁64.1.2DNA的結(jié)構(gòu)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA由兩條互補(bǔ)的單鏈DNA組成，每條單鏈都是脫氧核苷酸間以磷酸二酯鍵連接起來的，為了書寫的方便，因常在描述DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)可用一些簡單的方式來表示。第6頁/共65頁7如左圖DNA片段，可表示為5’-dpApGpCpTpG-3’，或d(pAGCTG)，式中的d代表脫氧核糖，p代表磷酸，當(dāng)p寫在堿基英文字母縮寫右邊時(shí)為C－3位OH基被酯化，寫在左邊時(shí)為C－5位OH基被酯化。一般為了更為方便起見，就簡單地寫為AGCTG，其方向規(guī)定為5’～3’方向。第7頁/共65頁8DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)指DNA分子的空間結(jié)構(gòu)，即三維空間的結(jié)構(gòu)。1953年，Watson和Crick首先提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型第8頁/共65頁9DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型及堿基配對(duì)的示意圖第9頁/共65頁10DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指雙螺旋鏈的扭曲，包括多重螺旋、分子內(nèi)單鏈形成的環(huán)等等。其中超螺旋是最常見的結(jié)構(gòu)。一些病毒DNA是單股螺旋．而絕大多數(shù)天然DNA是雙股螺旋。不論是單股還是雙股螺旋都可能形成閉環(huán)而失去自由的3’和5’末端。閉環(huán)分子大多數(shù)都會(huì)扭轉(zhuǎn)成為三維螺旋結(jié)構(gòu)，也就是DNA分子的三維結(jié)構(gòu)，一般稱作超螺旋(SupercoilorSuperhelix)第10頁/共65頁11電鏡下觀察到的噬菌體PM2的超螺旋結(jié)構(gòu)(a)圖為松弛環(huán)DNA，(b)圖為超螺旋DNA第11頁/共65頁124.2核酸的定量及結(jié)構(gòu)分析

核酸是最重要的一類生物大分子，它與自然界中的各種生命活動(dòng)都有著非常密切的關(guān)系。其含量的變化或結(jié)構(gòu)的微小變化都可能導(dǎo)致意想不到的后果，如各種與基因相關(guān)的疾病的發(fā)生?？梢哉f，該酸化學(xué)是現(xiàn)代分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容。而所有這些研究工作都離不開核酸的分析問題，有時(shí)需要簡單的定量，有時(shí)需要研究核酸結(jié)構(gòu)的各種變化，等等。因此，核酸分析化學(xué)實(shí)際上是打開與核酸相關(guān)的各種難題的一把金鑰匙，各種方法的研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。第12頁/共65頁134.2.1免疫化學(xué)法原理有些構(gòu)型的DNA(如左手螺旋DNA，Z-DNA)經(jīng)化學(xué)修飾可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高特異性的抗體，所產(chǎn)生的抗體可以用作分析這些核酸的免疫化學(xué)試劑。免疫化學(xué)方法尤其適合于DNA結(jié)構(gòu)及DNA化學(xué)修飾的分析，如DNA與致癌物所形成的加成物的分析?？笵NA抗體對(duì)于高特異性確定各種堿基及構(gòu)型，檢測不同構(gòu)型DNA間的轉(zhuǎn)化，及在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境下DNA的化學(xué)修飾都是非常有用的。第13頁/共65頁14抗體制備在實(shí)驗(yàn)中可采用兩種免疫原來誘導(dǎo)單克隆或多克隆抗體。第一種免疫原是DNA與帶正電荷的載體蛋白間所形成的非共價(jià)絡(luò)合物，甲基化的牛血清白蛋白是常用的載體之一；另一種類型的免疫原是通過不同的方式將核酸組分(核苷酸、核苷或堿基)與載體蛋白共價(jià)連接而獲得。除了實(shí)驗(yàn)免疫之外，動(dòng)物或人的自身免疫疾病所產(chǎn)生的血清也可作為核酸抗體的一種來源。第14頁/共65頁15分析方法用于檢測抗體與DNA復(fù)合物的方法包括凝膠免疫擴(kuò)散法，沉淀法，絮凝法，絡(luò)合物的電鏡分析法，酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)．放射免疫分析法(RIA)和凝膠位移分析法等。第15頁/共65頁164.2.2光譜法光譜方法可以分為下述三大類：

(1)電子光譜：包括紫外(uv)及可見吸收光譜，熒光光譜，圓二色光譜(CD)及線圓二色(LD)光譜；

(2)振動(dòng)光譜：包括紅外(IR)光譜，拉曼光譜及振動(dòng)圓二色(VCD)光譜；

(3)核磁共振(NMR)光譜。第16頁/共65頁17

產(chǎn)生上述三類光譜的來源不同，因而各類方法的靈敏度也就有很大的差別。一般來說，電子光譜的靈敏度比振動(dòng)光譜或NMR光譜高1－2個(gè)數(shù)量級(jí)。也就是說．在使用振動(dòng)光譜或NMR光譜時(shí)所需要的樣品的濃度要比電子光譜時(shí)高1—2個(gè)數(shù)量級(jí)。另一方面，電子光譜不像振動(dòng)光譜那樣具有很強(qiáng)的特征性，當(dāng)使用電子光譜時(shí)一般只利用了一種類型的生色基，如核酸堿基或其它類型的吸收配基．面振動(dòng)光譜可以提供核酸堿基及糖—磷酸酯骨架的各種類型化學(xué)鍵的吸收。NMR光譜的分辨率也很高，特別是1HNMR和13CNMR，31PNMR光譜可以提供有關(guān)糖—磷酸酯骨架的特殊信息。振動(dòng)光譜及NMR技術(shù)可以提供更多的有關(guān)核酸分子狀態(tài)及核酸分子不同部位變化的信息。第17頁/共65頁18紫外吸收光譜1.定量分析

20世紀(jì)60年代就發(fā)現(xiàn)了核苷酸、多聚核苷酸及核酸的紫外吸收。所有聚合態(tài)的核酸都在260nm處有一個(gè)寬的最大吸收帶，230nm處的吸收最小，在200nM以下的短波長區(qū)有另一最大吸收。吸光度比A260/A280和A260/A230是核酸質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)。純核酸樣品的A260/A280比值應(yīng)該大于1.8；如果此值比較小則表示有蛋白質(zhì)雜質(zhì)的存在，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)通常對(duì)280nm處的吸收有很大的貢獻(xiàn)。而比值A(chǔ)260/A230應(yīng)該為2或更高．此值低表示有蛋白質(zhì)(肽鍵在此范圍內(nèi)有吸收)或其它雜質(zhì)。另外，樣品的懸濁性或乳光也會(huì)使這些比值產(chǎn)生比較大的偏差。第18頁/共65頁192．吸收熔點(diǎn)曲線當(dāng)含有雙螺旋DNA或RNA的水溶液的溫度緩慢升高到某一溫度時(shí)，由于解旋作用的發(fā)生，溶液的吸光度(一般在260nm)會(huì)迅速增大。這一轉(zhuǎn)化過程突躍的中點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的溫度稱之為熔化溫度Tm，與晶體的熔點(diǎn)對(duì)應(yīng)。對(duì)鏈長較短的寡聚核苷酸，Tm或這種轉(zhuǎn)化曲線的陡度隨鏈的加長而增加，但Tm值在給定的條件下是固定值。DNA的Tm值與其所含的堿基(G＋C)或(A＋T)的相對(duì)含量之間的關(guān)系可用下述經(jīng)驗(yàn)公式來表示：第19頁/共65頁20一些DNA的變性溫度曲線曲線a、b和c所代表的DNA中％（G＋C）分別為38％、52％和66％第20頁/共65頁21圓二色(CD)光譜圓二色光譜是檢測DNA構(gòu)型變化的非常靈敏的技術(shù)。核酸的CD可用隨波長的變化來表示，＝L—R，L和R分別為用左手和右手圓極化光時(shí)的摩爾吸光系數(shù)。與核苷酸單體的CD相比，雙螺旋核酸(DNA或雙鏈RNA)具有強(qiáng)得多的CD吸收帶。近紫外區(qū)CD譜常被看成是不同類型雙螺旋DNA的特征，持別適合于檢測核酸雙螺旋由右手B到左手Z型的轉(zhuǎn)化。第21頁/共65頁22Poly(dG-dC).poly(dG-dC)在22C下以B(----)，A(－－－)和Z型(－)存在時(shí)的CD譜(b)Poly(rG-rC).poly(rG-rC)在以A型(----)(22C)和Z型(－)(46C)存在時(shí)的CD譜第22頁/共65頁23

有許多化合物(如藥物及染料)在可見或近UV區(qū)具有吸收，但由于不含手性中心而不具有CD信號(hào)，而當(dāng)它們與DNA和RNA的螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合時(shí)便會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)的CD吸收帶。這些吸收帶有時(shí)在DNA的吸收帶之外(通常大于300nm)，在這種情況下，值的大小可以用來指示藥物與DNA和RNA的相互作用。比較有意義的例子是藥物紡錘菌素(Netropsin)、遠(yuǎn)霉素(Distamycin)和DAPI〔4，6—二脒基—2—苯基吲哚)與DNA小溝區(qū)的相互作用。第23頁/共65頁24拉曼光譜現(xiàn)代激光拉曼光譜是研究核酸構(gòu)型的強(qiáng)有力的工具。核酸拉曼光譜的范圍大約為600~1800cm-1。從原理上講，拉曼光譜可以顯示類似于IR光譜的化學(xué)鍵的振動(dòng)態(tài)。自20世紀(jì)80年代初期以來，振動(dòng)拉曼光譜也被用于DNA構(gòu)型變化的研究。通常采用對(duì)應(yīng)于核酸堿基電子吸收(250～280nm)帶的激發(fā)光激發(fā)。因此，只能觀測到有關(guān)堿基構(gòu)型變化的信息。振動(dòng)拉曼光譜與常規(guī)拉曼光譜相比其優(yōu)點(diǎn)是樣品濃度可以低20～100倍，有時(shí)DNA構(gòu)型發(fā)生變化時(shí)所引起的譜帶強(qiáng)度的變化更大，檢測比較容易。第24頁/共65頁25核磁共振光譜

NMR是目前用于DNA結(jié)構(gòu)(構(gòu)型)研究的特殊技術(shù)。31PNMR光譜已經(jīng)被成功地用于推測磷酸二酯鍵的構(gòu)型。研究表明，核苷酸之間磷酸酯的化學(xué)位移對(duì)O3‘－P和P－O5’寡聚核苷酸骨架的扭轉(zhuǎn)角非常敏感。第25頁/共65頁26

在核酸研究中光譜方法是應(yīng)用最為廣泛的物理方法，UV光譜以其簡單(測定260nm處的吸光度)而成為核酸研究實(shí)驗(yàn)室中用于測定DNA和RNA濃度的常規(guī)分析方法。其它光譜方法都需要特殊的儀器，這些儀器只有在專業(yè)性比較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)室里才有。要獲得隱藏在DNA、RNA及寡聚核苷酸等樣品光譜數(shù)據(jù)后面的所有信息則需要特殊的訓(xùn)練和經(jīng)驗(yàn)。CD，IR，拉曼，甚至NMR譜也可以用作定量及不同DNA構(gòu)型比較的分析工具?？梢愿櫂?gòu)型的轉(zhuǎn)化或配體的結(jié)合。有時(shí)根據(jù)轉(zhuǎn)化和結(jié)合對(duì)溫度的依賴性可以獲得有關(guān)過程的熱、動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。第26頁/共65頁27NMR可用于合成的寡聚核苷酸或它們與蛋白質(zhì)或配體所形成的絡(luò)合物的研究，由此可以提供大量而重要的結(jié)構(gòu)信息，特別是與計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算結(jié)合使用時(shí)更是如此，所得結(jié)果可以與x射線晶體衍射所得的結(jié)果比較。第27頁/共65頁284.3小分子與核酸相互作用的研究

在核酸化學(xué)研究中，小分子一般是指分子量不大于1000的一類有機(jī)化合物、絡(luò)合物等，藥物是這類化合物中典型的一類。這類小分子化合物一般屬于癌化學(xué)治療試劑、核酸的裂解試劑、核酸染色及結(jié)構(gòu)探針。因此，對(duì)它們的研究一直非?；钴S。第28頁/共65頁29小分子與核酸相互作用研究受到重視的主要原因是：(1)研究結(jié)果表明，絕大多數(shù)抗癌藥物在生物體內(nèi)的靶目標(biāo)都是DNA，它們通過與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，干擾DNA的復(fù)制和RNA的合成，使腫瘤細(xì)胞遭受致命損傷，因而藥物與DNA作用的研究是藥物作用機(jī)理研究的關(guān)鍵所在。這一領(lǐng)域的研究對(duì)于有效地設(shè)計(jì)和指導(dǎo)新藥物的合成具有重要的意義。

(2)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域中的人工核酸內(nèi)切酶是由小分子DNA裂解試劑和DNA識(shí)別結(jié)合系統(tǒng)組成的。由于這種內(nèi)切酶能夠在人們預(yù)先設(shè)計(jì)好的任何位點(diǎn)斷裂DNA．這就使其成為遺傳工程技術(shù)中非常有用的工具。

(3)用作核酸探針的小分子可與某種特異的靶核酸分子發(fā)生明顯的相互作用，從而可對(duì)核酸進(jìn)行定量檢測、序列和結(jié)構(gòu)識(shí)別。第29頁/共65頁30

所以，小分子與核酸相互作用的研究，對(duì)于了解核酸的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于控制和改善基因表達(dá)，對(duì)于闡明藥物的作用機(jī)理以及對(duì)于一些疾病的診斷、治療均有著很重要的價(jià)值。第30頁/共65頁314.3.1小分子與核酸的相互作用模式小分子與核酸的相互作用可分為三種基本形式，即共價(jià)相互作用、可逆相互作用及嵌入作用。第31頁/共65頁32共價(jià)作用小分子與核酸的共價(jià)相互作用主要是同核酸各種堿基的反應(yīng)，如親核反應(yīng)、親電反應(yīng)、加成反應(yīng)等。目前臨床上使用的烷化劑類抗癌藥物，它們可以使DNA的堿基烷基化，從而干擾DNA的復(fù)制和RNA的合成，因而表現(xiàn)為具有抗癌活性。目前最暢銷的順鉑類抗癌藥物具有極強(qiáng)的抗癌活性，這主要是由于發(fā)生鳥嘌呤N一7位親電反應(yīng)，形成了鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)物，結(jié)果大大干擾了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。第32頁/共65頁33

有許多致癌物在代謝過程中會(huì)轉(zhuǎn)化為烷基化試劑而使DNA的堿基產(chǎn)生烷基化。在芳香族含氮化合物中最危險(xiǎn)的一類是芳環(huán)羥氨類衍生物，它們?cè)诎钡纳镅趸蚝衔锏拇x還原過程中產(chǎn)生。偶氮類化合物的活化通過第一步還原和第二步氧化實(shí)現(xiàn)。在這些致癌物的活化過程中細(xì)胞色素C-P450(CytC-P450)常常起著非常重要的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低于1g／g的黃曲霉素可以引發(fā)小鼠的肝和肺產(chǎn)生腫瘤。第33頁/共65頁34黃曲霉素的代謝環(huán)氧化物與DNA中烏嘌呤的結(jié)合第34頁/共65頁35可逆作用核酸與小分子間的非共價(jià)可逆相互作用有三種基本形式，它們是靜電作用、與核酸溝區(qū)間的作用及嵌入作用。小分子與核酸的可逆相互作用的三種基本形式第35頁/共65頁361．靜電相互作用(ElectrostaticInteraction)

核酸是高度電荷化的聚合電解質(zhì)，其帶負(fù)電荷的磷酸骨架可以同陽離子發(fā)生靜電作用，這種作用對(duì)于核酸構(gòu)型的穩(wěn)定化是非常重要的。2．與核酸溝區(qū)的相互作用(Groove-binding)

在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，存在著大溝區(qū)和小溝區(qū)．它們?cè)陔妶龇矫?、氫鍵性質(zhì)、空間效應(yīng)及水化作用方面都有很大的不同。許多蛋白質(zhì)分子及寡聚核苷酸分子主要與大溝區(qū)發(fā)生作用、而小分子因其分子體積小，主要同小溝區(qū)作用。3.嵌入作用(Interaction)

一些平面的、帶正電荷的芳香族小分子，或者具有其他特殊結(jié)構(gòu)的分子，可以嵌入到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對(duì)之間，這種作用稱為嵌入作用第36頁/共65頁374.3.2小分子藥物與核酸的相互作用不少藥物實(shí)際上都是金屬絡(luò)合物，因此，研究核酸與金屬絡(luò)合物的相互作用不僅可以揭示藥物的作用機(jī)制，而且可以指導(dǎo)更有效地進(jìn)行新藥的設(shè)計(jì)和合成。

某些具有手性的金屬絡(luò)合物和有機(jī)分子能通過氫鍵、靜電引力和范德華力擠壓或插入到雙鏈DNA分子的大、小溝中與之結(jié)合；而某些具有平面結(jié)構(gòu)的分子能插入到堿基對(duì)之間，與DNA形成更復(fù)雜的絡(luò)合物。這樣形成的絡(luò)合物在醫(yī)學(xué)研究和基因表達(dá)方面具有重要的意義。第37頁/共65頁3820世紀(jì)80年代以來，人們發(fā)現(xiàn)某些金屬的絡(luò)合物，如Fe-EDTA，Cu—鄰二氮菲(Cu—Phen)和Fe—卟啉等能產(chǎn)生羥基自由基或金屬氧化型衍生物，后者進(jìn)攻核糖和脫氧核糖的C1或C4位，經(jīng)分子重排導(dǎo)致核酸分子中磷酸二酯鍵的斷裂而使核酸大分子降解。由于這種作用與核酸酶的作用相似，這些金屬絡(luò)合物被認(rèn)為具有核酸酶活性。由于金屬絡(luò)合物的核酸酶活性的發(fā)現(xiàn)，為化學(xué)研究及其與生物學(xué)的結(jié)合和應(yīng)用開拓了新的領(lǐng)域。例如，序列專一性的人工核酸酶(Sequence－SpecificArtificialNuclease)的研究就是目前化學(xué)和生物學(xué)交叉研究領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn)。第38頁/共65頁39

所謂序列專一性的人工核酸酶，也稱為人工核酸內(nèi)切酶(ArtificialEndonuclease)，指的是末端與金屬絡(luò)合物共價(jià)鍵合的寡聚核苷酸片段。它能與單鏈的靶DNA按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行分子雜交而形成雙鏈區(qū)。當(dāng)有氧化還原劑存在時(shí)，與之連接的金屬絡(luò)合物通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生自由基，后者進(jìn)攻相鄰的核糖和脫氧核糖．使之發(fā)生磷酸二酯鍵的斷裂，而從靶DNA剪切出與之互補(bǔ)的序列。由于金屬絡(luò)合物和寡聚核苷酸都可以人為地設(shè)計(jì)合成，對(duì)于任何一個(gè)靶DNA，都能設(shè)計(jì)合成出相應(yīng)的寡聚核苷酸的金屬絡(luò)合物，從而使其在預(yù)期的位點(diǎn)發(fā)生斷裂。因此。這方而的研究在基因表達(dá)的人工調(diào)控中應(yīng)用具有很大潛力。第39頁/共65頁40寡聚脫氧核苷酸—EDTA—Fe(II)定位斷裂DNA的原理第40頁/共65頁414.3.3核酸小分子探針的研究

在生物化學(xué)相關(guān)的研究領(lǐng)域，小分子探針指那些可以探測生物大分子各種信息的一類小分子化合物，這類化合物可以與生物分子發(fā)生特異性相互作用，并使小分子化合物的物理化學(xué)性質(zhì)、光譜性質(zhì)或電化學(xué)性質(zhì)等發(fā)生變化，根據(jù)這些性質(zhì)的變化可獲得生物分子的各種信息。這類小分子化合物因此被稱之為探針。第41頁/共65頁42

核酸探針的研究涉及核酸的一級(jí)、二級(jí)及堿基的結(jié)構(gòu)。利用適當(dāng)?shù)奶结樑c核酸進(jìn)行各種選擇性反應(yīng)以探測核酸本身所不能給出或不能靈敏給出的結(jié)構(gòu)或量的信息。常用的核酸小分子探針，按其物理化學(xué)性質(zhì)來分，可以分為有機(jī)染料探針、金屬離子及其絡(luò)合物探針。第42頁/共65頁43有機(jī)染料探針這類探針基本上屬于熒光探針。核酸及其堿基在常溫下的熒光量子產(chǎn)率非常低，利用具有熒光的有機(jī)染料與DNA作用時(shí)熒光性質(zhì)的變化可以獲得有關(guān)DNA結(jié)構(gòu)及定量的信息。第43頁/共65頁44

目前，在生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中，溴乙錠(Ethidiumbromide，EB)一直作為電泳分析的熒光檢測試劑而被廣泛使用。它與DNA和RNA及雙鏈寡聚核苷酸絡(luò)合，并使EB的熒光增強(qiáng)，通常激發(fā)和發(fā)射分別在530,620nm。這種方法對(duì)DNA的最低檢出限為10ng/ml。EB與核酸中雙鏈區(qū)的結(jié)合是特異的。利用它與各種構(gòu)型核酸的結(jié)合比率的不同及所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的變化，可以把各種構(gòu)型的核酸區(qū)分開來。第44頁/共65頁45例如，它能鑒別天然核酸和變性核酸，區(qū)分線狀DNA、環(huán)狀DNA和超螺旋DNA。另外，EB也可以結(jié)合到RNA上，所以測定DNA時(shí)，需要用RNA酶破壞掉RNA。除此之外，EB還用于鑒定血液中的細(xì)菌，檢測DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成及測定聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量等。第45頁/共65頁46第46頁/共65頁47

另一種有機(jī)染料類探針為雙苯并咪唑染料(Hochest)。它是DNA小溝區(qū)結(jié)合的熒光探針，相對(duì)于EB而言它是非毒性的和水溶性的。它與DNA作用后使自身的熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。該染料的熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為355和460nm。富含A：T堿基的DNA對(duì)該染料的熒光增強(qiáng)最為顯著。它用于瓊脂糖凝膠電泳中DNA的檢測，RNA不產(chǎn)生干擾。第47頁/共65頁48金屬離子及其絡(luò)合物探針一些過渡金屬絡(luò)合物可作為DNA構(gòu)型的選擇性探針。它基于絡(luò)合物與DNA局部的構(gòu)型、形狀和對(duì)稱性匹配作用所產(chǎn)生的選擇性，即所謂構(gòu)型選擇性。這類金屬絡(luò)合物為手性分子，可識(shí)別不同構(gòu)型的DNA。這些絡(luò)合物可以作為DNA二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的探針，以探測DNA構(gòu)型的細(xì)微變化，而這些變化的部位往往是蛋白質(zhì)結(jié)合之處。第48頁/共65頁494.4DNA序列的測定DNA序列分析是揭開遺傳密碼的關(guān)鍵，也是基因研究的基礎(chǔ)。繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以后，人們進(jìn)行了一系列DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)分析方法的探索。由于凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展及第二類限制性核酸內(nèi)切酶的出現(xiàn)，DNA序列分析技術(shù)在70年代后期有了突破性進(jìn)展。Sanger的末端終止法和MaxamGilbert的化學(xué)測序法相繼間世，并以其簡單、快速及準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)成為目前被采用的主要測序方法。為此．Sanger和MaxamGilbeert分享了1979年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。DNA測序方法經(jīng)過不斷地改進(jìn)，在測序的對(duì)象和范圍方面都有了很大的擴(kuò)充。但它距一些大的測序項(xiàng)目，如人的基因組項(xiàng)目的研究的要求來說還有很大的差距。第49頁/共65頁504.4.1人類基因組項(xiàng)目

人的基因組項(xiàng)目(HumanGenomeProject)是美國于1990年提出的．該項(xiàng)目規(guī)定在15年內(nèi)投資30億美元．完成人的基因組的全部DNA測序、定位及遺傳學(xué)研究。在這一系統(tǒng)工程中DNA序列分析是整個(gè)項(xiàng)目的重點(diǎn)和控制步驟，在該項(xiàng)目的第一個(gè)5年計(jì)劃的第三年(1993)，美國重新制定了新的5年計(jì)劃(1994-1998)．強(qiáng)調(diào)經(jīng)費(fèi)每年必須達(dá)到2億美元，并明確規(guī)定其中1億美元用于發(fā)展DNA序列分析技術(shù)。第50頁/共65頁51

人是復(fù)雜的高等生物，人的基因組約含大約8萬個(gè)基因，比所有典型生物的基因組都要復(fù)雜。如人的最小和最大染色體的堿基對(duì)數(shù)目分別為50和250Mb，整個(gè)人的基因組的堿基總數(shù)約為3000Mb；而整個(gè)酵母和水稻的基因組堿基對(duì)數(shù)目分別只有15和46Mb，比人的最小的染色體的堿基對(duì)數(shù)目還要小。第51頁/共65頁52DNA序列分析的方法可以按其發(fā)展及特點(diǎn)分為：

(1)目前所廣泛采用的方法，它包括經(jīng)典的板凝膠電泳放射性自顯影法和基于板凝膠電泳激光熒光的自動(dòng)化序列分析法；

(2)毛細(xì)管和陣列毛細(xì)管凝膠電泳激光熒光法及超薄層板凝膠電泳激光熒光法，這類方法也是基于聚丙烯酰胺凝膠的分析方法，但這些方法的主要目的是提高測序速度，以滿足大型測序項(xiàng)目的要求；

第52頁/共65頁53(3)不使用凝膠電泳分離的直接測序技術(shù)，如質(zhì)譜法、原子探針法(隧道掃描顯微鏡和原子力顯微鏡)、雜交法和流動(dòng)單分子熒光檢測法。這類方法目前還處于探索階段，它的成功將成為DNA測序方面的一場巨大的變革，大大減輕測序的工作量，提高測序的速度。第53頁/共65頁54DNA測序的基本步驟

1)通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽渑c待測序DNA模板互補(bǔ)的所有可能的帶標(biāo)記的單鏈寡聚核苷酸片段；2)將得到的單鏈寡聚核苷酸片段混合物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。對(duì)電泳分離的要求是能夠分辨出一個(gè)脫氧核苷酸的差異，而可以測得的寡聚核苷酸長度，往往受限于電泳分離技術(shù)的分離度。3)從電泳圖譜直接讀出待測DNA的序列并進(jìn)行核實(shí)。第54頁/共65頁554.4.2特異性化學(xué)裂解法快速測定定DNA序列首先需要制備一個(gè)單一末端以32P標(biāo)記的DNA片斷，通常用多核苷酸激酶將32P引進(jìn)5’-OH末端，然后選擇性地將此標(biāo)記的DNA片段在四個(gè)核苷酸之一處斷開。例如，若標(biāo)記的序列是：5’-32P-GCTAGTAC-3’，則對(duì)每種堿基分別進(jìn)行特異性切割所得到的放射性片段為：在A處切割：5’-32P-GCT；5’-32P-GCTAGT在G處切割：5’-32P-GCTA在C處切割：5’-32P-G；5’-32P-GCTAGTA在T處切割：5’-32P-GC；5’-32P-GCTAG第55頁/共65頁565‘－P－GCTAGTAC－3’片段在四種核苷酸堿基處分別特異性斷裂后電泳分離，放射自顯影的示意圖第56頁/共65頁57

目前DNA測序中應(yīng)用最為廣泛的獲得與待測序DNA模板互補(bǔ)的所有可能的單鏈寡聚核苷酸片段的技術(shù)是Sanger雙脫氧法和Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法。第57頁/共65頁584.2.1.2DNA測序策略

人類基因組計(jì)劃涉及DNA的大規(guī)模測序，它是一項(xiàng)龐大的工程。根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)水平，一套測序反應(yīng)中可測到的可靠序列信息有限，因此人類還無法對(duì)基因組這樣的復(fù)雜DNA大分子直接進(jìn)行測序，而只能采取化整為零的測序基本策略，即將基因組DNA分割成一定大小的片段，然后分別對(duì)這些片段進(jìn)行測序。目前DNA大片段測序的通用策略主要有鳥槍測序法和定向法。第58頁/共65頁594.2.1.3DNA測序的分離方法凝膠電泳技術(shù)毛細(xì)管電泳技術(shù)

芯片毛細(xì)管電泳技術(shù)

第59頁/共65頁604.2.2DNA傳感技術(shù)DNA傳感技術(shù)或者基因傳感技術(shù)是一種建立在DNA特異性雜交基礎(chǔ)之上的DNA檢測技術(shù)，它是將核酸作為分子識(shí)別及檢測層并與各種換能器相結(jié)合而產(chǎn)生的一種可以在分子水平上進(jìn)行快速檢測、監(jiān)控的微量生物分析技術(shù)，在DNA測序、遺傳性疾病診斷、環(huán)境監(jiān)控分析、基因指紋圖譜的建立及法醫(yī)鑒定等方面都有著極大的應(yīng)用價(jià)值和意義。第60頁/共65頁61

基因傳感器的工作原理是：將DNA探針（捕獲探針）固定在載體表面，在適當(dāng)?shù)臏囟取H值和離子強(qiáng)度下與互補(bǔ)的靶序列(Target-sequence)選擇性地結(jié)合形成表