造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植培訓(xùn)課件

造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植追溯干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)史1868年，德國生物學(xué)家ErnstHaeckel第一次利用“干細(xì)胞”一詞來描述受精卵（fertilizedeggorzygote）。1981年起，研究人員長期致力于小鼠胚胎干細(xì)胞研究工作。1998年，研究人員首次分離出小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell)。

2006年，日本首次誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成為多能干細(xì)胞，并命名為iPS（inducedpluripotentstemcell）

。2007年11月，美國和日本同時宣布將人體皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成了iPS。2造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植干細(xì)胞(stemcell,SC)研究

成為繼人類基因組大規(guī)模測序之后最具活力、最有影響和最有應(yīng)用前景的生命學(xué)科研究領(lǐng)域。

1999年,2000年連續(xù)兩年被美國《Science》雜志評為本年度十大科學(xué)成就之一。2001年被列入當(dāng)今六大熱門科技研究領(lǐng)域之一。2008年《CellStemCell》創(chuàng)刊僅2年,影響因子（impactfactor，IF)從0沖至16.826

23.563（2009年）25.943（2010年）。3造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，EC)

成體干細(xì)胞

(somaticstemcell)：

干細(xì)胞分類造血干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞……胚胎干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下的神經(jīng)（左）和肌肉（右）干細(xì)胞按發(fā)育狀態(tài)4造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植unipotent（單能）:somaticSC干細(xì)胞分類按分化潛能Totipoent(全能):ESpluripotent（多能）:somaticSC5造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植WherewefindsomaticSC?musclesskinsurfaceoftheeyebrainbreastintestines(gut)bonemarrowtesticlesThereareothertissuesandorganscontainingsomaticSCexceptforabovementioned.6造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植Somaticstemcells:Haematopoieticstemcells(HSCs)7造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcell，iPS

)

2006年日本首次通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將4個轉(zhuǎn)錄因子即Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouseembryonicfibroblast，MEF）獲得一種多能干細(xì)胞，并命名為iPS。

2007年11月，美國和日本同時宣布將人體皮膚細(xì)胞(skincell)改造成了iPS。8造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植adultcell‘geneticreprogramming’=addcertaingenestothecellinducediPSbehaveslikeanES

iPS:noneedforembryos!9造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

干細(xì)胞的端粒酶（telomerase）普通細(xì)胞受到端粒(telomere)的限制，在經(jīng)歷一定次數(shù)的分裂后就會死亡。細(xì)胞的DNA復(fù)制機(jī)器無法達(dá)到DNA鏈的最頂端，因此隨著每次細(xì)胞分裂端粒會逐漸縮短。而干細(xì)胞中包含一種端粒酶，能夠構(gòu)建端粒備份，使細(xì)胞獲得永生。10造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

干細(xì)胞的應(yīng)用“制造或再生”器官，為細(xì)胞治療、組織替代治療、器官移植等提供新的技術(shù)途徑。與基因工程技術(shù)相結(jié)合，利用基因定點缺失與突變等進(jìn)行更加有效的基因治療，為疾病、創(chuàng)傷、衰老和遺傳等因素所致的組織器官損傷或功能障礙的治療提供了新的思路。解決人類面臨的大多數(shù)醫(yī)學(xué)難題，如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤、老年性癡呆、帕金森病、嚴(yán)重?zé)齻?、脊髓損傷和遺傳性缺陷等疾病的治療。StemCells:Flexiblefriends.Nature2012,Mar1,483:S22–S26.DOI:doi:10.1038/483S22a我國建成世界最大人胚胎干細(xì)胞庫11造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

我國建成世界最大人胚胎干細(xì)胞庫

中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所所長盧光琇帶領(lǐng)科研團(tuán)隊，建成了目前世界上最大的具有不同組織，相容性抗原的人胚胎干細(xì)胞庫。建立的人胚胎干細(xì)胞系已達(dá)300多株，使保存的早期微量細(xì)胞的復(fù)蘇效率超過了95%，達(dá)到國際領(lǐng)先水平。并建立了世界上首個基因完全純合的人類孤雌干細(xì)胞系。

我國建成世界最大人胚胎干細(xì)胞庫12造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植替換那些因病“下崗”的細(xì)胞修復(fù)那些“過勞死”的組織起到“全能修理工”的作用目前,除造血干細(xì)胞移植被作為成熟技術(shù)應(yīng)用于臨床治療外，其他干細(xì)胞移植技術(shù)尚處在臨床研究階段。

干細(xì)胞移植13造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植造血干細(xì)胞作為干細(xì)胞研究

與應(yīng)用的突破口

造血細(xì)胞是細(xì)胞增殖分化的最佳模型。

造血干／祖細(xì)胞及各系血細(xì)胞的表面標(biāo)志較為清楚，可進(jìn)行定量分析，且可分選。

造血干細(xì)胞增殖及向各系分化的重要誘導(dǎo)因子、受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、微環(huán)境（niche）等因素較為清楚。

造血細(xì)胞發(fā)揮功能可相對游離，不需“生物支架”、神經(jīng)、血管、外科移植等復(fù)雜的“下游”工藝，便于直接應(yīng)用于臨床。14造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植TheNobelPrize,1990E.DonnallThomas

firstsuccsessfulHSCTintreatmentofacuteleukemiaThomasED,LochteHL,LuWC,FerrebeeJW.Intravenousinfusionofbonemarrowinpatientsreceivingradiationandchemotherapy.N.Engl.J.Med.1957;257:491.15造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植什么是造血干細(xì)胞移植？

(HeamatopoieticStemCellTransplantation，HSCT)

經(jīng)大劑量放化療或其他免疫抑制預(yù)處理，清除受體體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和異?？寺〖?xì)胞，阻斷發(fā)病機(jī)制，然后把自體或異體造血干細(xì)胞移植給受體，使受體重建正常造血和免疫功能，從而達(dá)到治療目的的一種治療手段。16造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植一、按細(xì)胞來源造血干細(xì)胞移植的分類骨髓干細(xì)胞移植（BMT）外周血造血干細(xì)胞移植(PBHSCT)臍帶血干細(xì)胞移植（UCBSCT)胎肝移植(FLCT)自體（autologous）異體造血干細(xì)胞移植異種（xenogeneie）二、按供體與宿主的關(guān)系同基因（syngeneic）:同卵雙生異基因(allogeneic）:有血緣（related）無血緣（un-related)

清髓性造血干細(xì)胞移植非清髓性造血干細(xì)胞移植三、按供受體間HLA相關(guān)性

(HumanLeukocyteAntigen)

HLA全相合HLA不全相合HLA不相合四、CD34＋細(xì)胞移植五、按預(yù)處理強(qiáng)度和目的17造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植1骨髓移植（bonemarrowtransplantation，BMT）

通過多點骨髓腔穿刺，抽吸含HSC的骨髓血混合液，是經(jīng)典的移植方法，效果可靠。但采髓需在全麻或硬膜外麻醉下進(jìn)行，通常需采集骨髓混合液600-1000ml，具體數(shù)值隨患者體重來定,但GVHD

(graftversushostdisease)

發(fā)生。包括自體BMT（autologousBMT，ABMT）

同基因BMT（syngeneicBMT，syn-BMT）異基因BMT（allogeneicBMT，allo-BMT）

18造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植2外周血干細(xì)胞移植(peripheralbloodstemcelltransplantation,PBSCT)

使用藥物和細(xì)胞因子動員,促使HSC從骨髓釋放到外周血，然后通過血細(xì)胞分離機(jī)從循環(huán)血中收集HSC。與BMT相比，具有采集方便、供者不需麻醉、移植后造血細(xì)胞恢復(fù)快，而GVHD發(fā)生率和嚴(yán)重程度并無明顯增加等優(yōu)點。包括自體PBSCT（autologousAPBSCT）

異體PBSCT(allogeneicPBSCT,allo-PBSCT)

19造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植3臍帶血干細(xì)胞移植(Umbilicalcordbloodstemcelltransplantation，UCBSCT)

胎兒臍帶血和胎盤中含有大量造血干細(xì)胞，且免疫原性不成熟，在同胞兄妹中HLA配型不完全相合者也能植活，不過無關(guān)供者臍血干細(xì)胞移植仍需要作HLA配型。與BMT及PBSCT相比，臍帶血干細(xì)胞具有異體排斥反應(yīng)小，免疫原性低，再生能力和速度是前者的

10到20倍，受病毒感染的風(fēng)險低等特點。

胎兒的臍帶結(jié)構(gòu)示意圖

臍帶血干細(xì)胞體外集落圖

20造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植什么是造血干細(xì)胞？

HeamatopoieticStemCell，HSC

紅色為CD34表型的造血干細(xì)胞，綠色為CD31表型的內(nèi)皮細(xì)胞，藍(lán)色為DAPI。胎盤絨毛膜顯微鏡圖像21造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植祖/定向干C幼稚C(早中晚)原始C成熟C自我復(fù)制、多向分化血細(xì)胞發(fā)生演變規(guī)律分化:強(qiáng)弱無胞體:大小胞核:大小，染色質(zhì)稀密，核仁有無胞質(zhì):少多，嗜堿性由強(qiáng)弱無，特殊產(chǎn)物無少多22造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植HSC,haematopoieticstemcell;CLP,commonlymphoidprogenitor;CMP,commonmyeloidprogenitor.Schematicviewofadulthaematopoiesis23造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

存在于造血組織中的一類原始的造血細(xì)胞自我更新(selfrenewing)

多向分化(multipotentdifferentiation)

各種血細(xì)胞與免疫細(xì)胞的起源細(xì)胞。能重建造血，同時重建免疫。造血干細(xì)胞（HSC）24造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植第一節(jié)造血干/祖細(xì)胞的生物學(xué)特性25造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植外周血造血干/祖細(xì)胞物理特性

正常外周血中HSC含量極少，約為骨髓的1%,

比中等大小圓型淋巴樣單核細(xì)胞略小。在人類尚無檢測真正造血干細(xì)胞的方法，一般LTC-IC或CFU-BI可代表干細(xì)胞的數(shù)量。CFU-GEMM代表多能造血祖細(xì)胞。外周血造血/祖細(xì)胞約占單個核細(xì)胞的0.01-0.1%。CFU:colonyformingunit集落形成單位LTC-IC:long-termcultureinitiatingcell長期培養(yǎng)起始細(xì)胞CFU-BI:colony-formingunit-blast原始集落形成單位CFU-GEMM：CFU-granulocyte/erythroid/macrophage/megakaryocyte

粒/紅/巨噬/巨核集落形成單位

26造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植CD34+

(最廣泛的HSC的表面標(biāo)志)AC133＋

（細(xì)胞表面糖蛋白）c-kit(CD117）+（SCFR,造血干細(xì)胞因子受體）Flt3(CD135）+KDR+

（Vascularendothelialgrowthfactorreecptor2，VEGFR2)CD38－CD33-Thy-1-（CD90low）（胸腺細(xì)胞表面抗原標(biāo)志）CD71－

HLA-DR－（與細(xì)胞增殖有關(guān)）MCD45RAlowLin－

(已分化為特定細(xì)胞的標(biāo)記)Rh123lowHO33342low外周血造血干/祖細(xì)胞表型特性

方法：利用各種抗CD抗原的單克隆抗體區(qū)分。27造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植外周血造血干/祖細(xì)胞功能特性以體外半固體培養(yǎng)中集落形成能力來測定

HSCLTC—ICHPP-CFCCFU-MBFU-ECFU-Meg淋巴祖細(xì)胞CFU-GMCFU-GCFU-MIXCFU:colonyformingunit集落形成單位LTC-IC:long-termcultureinitiatingcell長期培養(yǎng)起始細(xì)胞HPP-CFC:highproliferationpotentialcolonyfomingcell高增殖力集落形成單位CFU-MIX:混合集落形成細(xì)胞CFU-GM:粒單細(xì)胞集落形成細(xì)胞CFU-G:粒細(xì)胞集落形成細(xì)胞CFU-M:巨噬細(xì)胞集落形成細(xì)胞CFU-E:紅細(xì)胞爆式集落形成細(xì)胞CFU-Meg:巨核細(xì)胞系集落形成細(xì)胞早期祖細(xì)胞多向或雙向定向28造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植29造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植30造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植集落形成的關(guān)鍵是培養(yǎng)體系（細(xì)胞因子和血清等）CFU-GM和總CFC常用作評估外周血移植物質(zhì)量的指標(biāo)31造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植骨髓象分析遺傳學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)分析配型采集HSC預(yù)處理：TBI(totalbodyirradiation）回到層流病房

HSC輸注造血干細(xì)胞移殖流程32造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植第二節(jié)造血干細(xì)胞的動員、采集、處理造血功能恢復(fù)動員采集凍存預(yù)處理回輸33造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植一.外周血造血干/祖細(xì)胞動員動員的機(jī)制

“造血動員式”化療

化療動員的具體方案造血因子的使用化療與造血因子聯(lián)合

34造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植動員劑將造血干細(xì)胞動員到外周血。

化療藥物:反饋性造血增生。造血細(xì)胞因子:刺激造血細(xì)胞增殖及向髓外轉(zhuǎn)移。動員前:PBCD34+0.1-0.2%，動員后：1-2%（一）動員的機(jī)制35造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

具體方案大劑量單一化療藥物：

CTX(cytoxan,環(huán)磷酰胺)-4g-7g/m2VP16(etoposide，依托泊苷)-2g/m2

Melphalan（馬法蘭）-140mg/(m2,d1-2)聯(lián)合化療

CTX4g/m2,

VP16600mg/m2

（二）“造血動員式”化療36造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植（三）造血因子的使用GM-CSF：Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor

?！奘杉?xì)胞集落刺激因子

G-CSF：Granulocytecolony-stimulatingfactor粒—巨噬細(xì)胞集落刺激因子SCF：stemcellfactor干細(xì)胞因子IL-3：interlukin-3白介素-3IL-11：

interlukin-11白介素-11IL-8：interlukin-8白介素-8IL-1：

interlukin-8白介素-1MIP-1：MacrophageInflammatoryProteins巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1

PIXY321：重組人GM-CSF/IL-3融合蛋白37造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植（四）化療與造血因子聯(lián)合化療及G-CSF的聯(lián)合動員化療及GM-CSF的聯(lián)合動員化療及其他細(xì)胞因子的聯(lián)合動員

IL-3PIXY321SCF38造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植二外周血造血干/祖細(xì)胞采集（一）供者準(zhǔn)備患者用化療藥物及造血細(xì)胞因子聯(lián)合動員在白細(xì)胞數(shù)從最低點回升達(dá)到1X109/L時開始采集，有時延誤到4X109/L。常規(guī)使用ACD-A（acidcitratedexotrosesolutionA,酸性枸櫞酸鹽葡萄糖溶液）抗凝。39造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植血細(xì)胞分離機(jī)：全自動、全封閉、連續(xù)和不連續(xù)、間歇的血細(xì)胞分離機(jī)。如CS3000plus每天一次，每次10L全血，可連續(xù)2-3次(二)采集冷凍保存：分離外周血單個核細(xì)胞40造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植1采集的細(xì)胞數(shù)評價移植物是否足夠

有核細(xì)胞總數(shù)：2-6X108/kg

CFU檢測

CD34+

細(xì)胞數(shù)：1-3X106/kg

ACD-A：大量使用時致ACD中毒引起低鈣—少量。

容量不足：通過打斷采集程序即不斷減少流速來完成。血小板減少癥（thrombocytopenia）：由于血小板（platelet）粘附于設(shè)備表面引起的，通過回輸富含血小板的血漿(plateletrichplasma,PRP)或輸血小板來糾正。2采集并發(fā)癥41造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植3處理

細(xì)胞濃度：5X107/mlpH>74℃保存CFU最好。4進(jìn)一步處理

富集CD34+,去除腫瘤細(xì)胞，去除T細(xì)胞5冷凍保存

常溫液態(tài)下儲存幾天，通常冷凍。加入細(xì)胞保護(hù)劑DMSO。42造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

6長期儲存

在-196℃液氮中至少5年。在-80℃機(jī)械冰箱儲存的時間最長為2.5年。應(yīng)裝置24小時警備系統(tǒng)。避免交叉感染的因素如袋子之間用雙腔袋、冷存時液態(tài)蒸發(fā)等。43造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

四解凍與回輸

副反應(yīng)：DMSO誘導(dǎo)組胺釋放。措施：患者要經(jīng)過水化和用抗組胺藥抗休克。目的：減少血管塌陷和低血壓。44造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植第三節(jié)CD34+細(xì)胞的分選45造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植一CD34+細(xì)胞的分選的必要性

在體外純化和富集CD34+細(xì)胞。在APBSCT中，凈化殘留腫瘤細(xì)胞而減少復(fù)發(fā)。在allo-PBSCT中,去除T細(xì)胞,減輕GVHD發(fā)生。對難治性自身免疫性疾病，可純化除去異常免疫細(xì)胞?？商岣吒杉?xì)胞體外擴(kuò)增及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。

46造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植二造血干細(xì)胞移植物中腫瘤細(xì)胞的污染基因標(biāo)記實驗證實了一些腫瘤病人，自體移植后絕大數(shù)患者檢出基因標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞。用藥物體外凈化比未凈化的移植復(fù)發(fā)率低。殘留腫瘤細(xì)胞再輸入是腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素。因此，從自體移植物中清除污染的腫瘤細(xì)胞是十分必要的。

低倍鏡下腫瘤細(xì)胞47造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

免疫凈化（immunologicpurging）定義：在體外用免疫學(xué)的方法消除移植物中殘留的腫瘤細(xì)胞的措施。免疫正凈化（immunologicpositivepurging）：將正常造血干細(xì)胞從移植物中純化出來。免疫負(fù)凈化(immunologicnegativepurging)：將腫瘤細(xì)胞從自體移植物中清除。免疫雙凈化（immunologicdoublepurging）將免疫正、負(fù)凈化法結(jié)合起來。48造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植CD34+細(xì)胞正凈化的優(yōu)點

避免細(xì)胞毒性藥物和免疫毒素對正常HSC的損傷；無需抗腫瘤抗體凈化的多環(huán)節(jié)體外處理，減少污染機(jī)會；不會因腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒性藥物和免疫毒素的敏感性不同而影響凈化效應(yīng)；如聯(lián)合其它凈化方法，可進(jìn)一步提高凈化效應(yīng);可減少冷凍保護(hù)劑DMSO的使用量，減少其副作用。49造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植三CD34+細(xì)胞的分選的原理及方法

原理：CD34+細(xì)胞包含在單個核細(xì)胞組分中，在分選CD34+細(xì)胞前，常用一些非免疫學(xué)（如物理或功能）方法去除移植物中的紅細(xì)胞和成熟粒細(xì)胞等成分。

密度梯度離心法：它可獲得富含單個核細(xì)胞的白細(xì)胞層，從而初步富集了CD34+細(xì)胞。

臨床上采用血細(xì)胞分離機(jī)：按一定程序分離出經(jīng)造血生長因子動員的外周血單個核細(xì)胞，這樣大大減少了移植物體積，為進(jìn)一步用免疫學(xué)分選CD34+細(xì)胞做好準(zhǔn)備。50造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

ρp>ρm，S>0，顆粒順著離心方向沉降

ρp=ρm，S=0，顆粒達(dá)到某一位置后達(dá)到平衡

ρp<ρm，S<0，顆粒逆著離心方向上浮

離心后形成不同大小不同形狀、具有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。密度梯度離心51造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植Ficoll密速梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞（PMBC）

原理：利用密度梯度介質(zhì)-聚蔗糖-泛影葡胺（淋巴細(xì)胞分離液），相對密度1.077±0.001。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞密度大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。52造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植Systemix公司：高速熒光激活細(xì)胞分選系統(tǒng)（highspeedfluoresence-activatedcellsortingsystem），它先用一系列方法去除細(xì)胞各系標(biāo)志陽性的定向祖細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀高速分選。流式細(xì)胞儀分離法（FlowCytometry,FCM）-根據(jù)細(xì)胞表面抗原標(biāo)志CD34+CD34+53造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

將預(yù)分選的造血細(xì)胞與生物素化（biotinylated）的抗CD34的單克隆抗體一起孵育，然后洗去未結(jié)合的抗體，將樣本通過抗生物素蛋白包被的聚丙烯酸胺柱的親和素柱，CD34+細(xì)胞滯留在柱內(nèi)的聚丙烯酸胺球表面上，通過輕輕的機(jī)械搖動，沖洗出CD34+細(xì)胞。

Cellpro公司：Ceprate臨床型CD34+細(xì)胞分選機(jī)免疫吸附法（ImmunityAbsorption，IA）

—

根據(jù)生物素抗親和素柱分選系統(tǒng)Anti-CD34+biotinylatedAb

WashunboundAbsAnti-biotinyaffinitycolumnGentleshaking54造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植

原理：已包被一抗的磁珠與細(xì)胞表面相應(yīng)分子特異性結(jié)合，或已包被二抗的磁珠與預(yù)先已與細(xì)胞表面分子特異結(jié)合的一抗結(jié)合。磁珠攜帶與之結(jié)合的細(xì)胞吸附于分離柱/試管上，實現(xiàn)陽性細(xì)胞分離或陰性細(xì)胞的分離。

免疫磁珠分離法（magneticactivatedcellsorting,MACS

）55造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植四CliniMACS臨床細(xì)胞分選系統(tǒng)56造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植五自體外周血CD34+細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用具有移植后造血和免疫功能恢復(fù)快等的特點。有凈化污染腫瘤細(xì)胞效應(yīng)高的優(yōu)點。在治療不表達(dá)CD34抗原的惡性腫瘤臨床上廣泛應(yīng)用。包括：非何杰金氏淋巴瘤（NHL）多發(fā)性骨髓瘤乳腺癌神經(jīng)母細(xì)胞瘤

其它疾病,如自身免疫性疾病

57造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植HSCT已成為治療及治愈如下疾病的最佳選擇惡性血液病急性髓細(xì)胞性白血病急性淋巴細(xì)胞白血病慢性粒細(xì)胞性白血病毛細(xì)胞性白血病惡性組織細(xì)胞病重型再生障礙性貧血重型海洋性貧血骨髓纖維化

惡性腫瘤骨髓增生異常綜合癥多發(fā)性骨髓瘤非霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤惡性疾病非惡性疾病造血系統(tǒng)疾病遺傳性疾病先天性免疫缺陷病先天性造血異常癥先天性骨骼異常癥粘多糖儲蓄癥粘蛋白脂質(zhì)代謝病系統(tǒng)性紅斑狼瘡多發(fā)性硬化癥糖尿病放射病AIDS病自身免疫性疾病58造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植干細(xì)胞治療Ⅰ型糖尿病

采用自體干細(xì)胞移植＋T淋巴系統(tǒng)抑制的方法，可以重建免疫系統(tǒng)和胰腺功能根據(jù)國外5年長期隨訪跟蹤結(jié)果顯示，接受移植后的I型糖尿病病人有90％以上停用或減少了胰島素注射。59造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植六異基因外周血CD34+細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用

HLA相合的同胞間，減少或減輕GVHD；HLA不全相合（1-3個位點不合），不僅減輕GVHD，且可增加移植細(xì)胞量，減少移植物排斥反應(yīng)；從同一家族供體中輸注CD34+細(xì)胞，增強(qiáng)骨髓增生低下受體的造血功能；適用于HLA相合無關(guān)供受體間的移植；用于將供體CD34+細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分離后分別先后移植和輸注；適用于分選CD34+細(xì)胞后體外擴(kuò)增后的移植和輸注；用于體外產(chǎn)生和擴(kuò)增抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞(antigenspecificeffectorcell)和抗原遞呈細(xì)胞（antigenpresentingcell,APC），以進(jìn)行細(xì)胞治療。61造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植中國HSCT概況CSBMT(ChineseSocietyofBMT)62造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植中國不同城市的HSCT數(shù)量63造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植中國不同單位的HSCT數(shù)量64造血干細(xì)胞定向分化擴(kuò)增和移植中國HSCT適應(yīng)癥（2009）MMOtherleukemiaAutoimmunediseaseSolidtumorAAAML：acutemyelogenousleukemia急性髓性白血病ALL：acutelymphoblasticleukemia急性淋巴細(xì)胞白血病MM：MultipleMyeloma，多發(fā)性骨髓瘤AA：AplasticAnemia再生障礙性貧血CML：Chronicmyelogenousleukemia慢性粒細(xì)胞白血病M