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文檔簡介
生物競賽課件實驗技術(shù)第1頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一本章內(nèi)容提要第一節(jié)顯微技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡二、電子顯微鏡三、顯微操作技術(shù)第二節(jié)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交第2頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一第一節(jié)顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡:以可見光(或紫外線)為光源。電子顯微鏡:以電子束為光源。第3頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一—、光學(xué)顯微鏡第4頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一1.構(gòu)成:①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機械裝置2.原理:經(jīng)物鏡形成倒立實像,經(jīng)目鏡放大成虛像。(一)普通光學(xué)顯微鏡第5頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一第6頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一LightPathwayofMicroscope第7頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一3.分辨力:指分辨物體最小間隔的能力。。光學(xué)顯微鏡的分辨力R=0.61λ/N.A.其中λ為入射光線波長;N.A.為鏡口率
=nsinα/2,n=介質(zhì)折射率;α=鏡口角(樣品對物鏡鏡口的張角)。第8頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一表一、幾種介質(zhì)的折射率第9頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一顯微鏡的幾個光學(xué)特點:介質(zhì)折射率越接近鏡頭玻璃的(1.7)越好。sinα/2的最大值小于1;油鏡介質(zhì)為香柏油,鏡口率可接近1.5。普通光線的波長為400~700nm,光鏡分辨力約為0.2μm,人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000X。第10頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(二)熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點:光源為短波光;有兩個特殊的濾光片;照明方式通常為落射式。第11頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一第12頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途:免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。第13頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(三)激光共聚焦掃描顯微境
Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源,逐點、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡,但能掃描不同層次,形成立體圖像。第14頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一laserconfocalscanningmicroscope,LCSM第15頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖第16頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/第17頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(四)暗視野顯微鏡
darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片,照明光線不直接進人物鏡,只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進入物鏡,因而視野背景是黑的,物體邊緣是亮的??捎^察4~200nm的微粒子,分辨率比普通顯微鏡高50倍。第18頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度,使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上,相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。環(huán)形光闌(annulardiaphragm):位于光源與聚光器之間。相位板(annularphaseplate):物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。(五)相差顯微鏡第19頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一原理第20頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一用途:觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本第21頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(六)偏光顯微鏡polarizingmicroscope用于檢測具有雙折射性的物質(zhì),如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。光源前有偏振片(起偏器),使進入顯微鏡的光線為偏振光,鏡筒中有檢偏器(與起偏器方向垂直的偏振片)。載物臺是可以旋轉(zhuǎn)。淀粉第22頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(七)微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope(DIC)1952年Nomarski發(fā)明,利用兩組平面偏振光的干涉,加強影像的明暗效果,能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點,折射率差別更大,故影像的立體感更強。第23頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(八)倒置顯微鏡inversemicroscope
物鏡與照明系統(tǒng)顛倒;用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞,通常具有相差或DIC物鏡,有的還具有熒光裝置。第24頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(九)當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢采用組合方式,集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。自動化與電子化。第25頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一二、電子顯微鏡(一)透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM第26頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一以電子束作光源,電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。分辨力0.2nm,放大倍數(shù)可達百萬倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)(小于0.2μm)。1.原理第27頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一表二、不同光線的波長第28頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一TEMLIGHTPATHWAY第29頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一透射電子顯微鏡TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE,TEM第30頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一2、制樣技術(shù)1)超薄切片用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片,用超薄切片機(ultramicrotome)制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品,丙酮逐級脫水,環(huán)氧樹脂包埋,以熱膨脹或螺旋推進的方式切片,重金屬(鈾、鉛)鹽染色。第31頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一第32頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一2)負(fù)染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色;吸去染料干燥后,樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽,而凸的出地方?jīng)]有染料沉積,從而出現(xiàn)負(fù)染效果,分辨力可達1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria第33頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一3)冰凍蝕刻freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開,升溫后,冰升華,暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉,把碳和鉑的膜剝下來,此膜即為復(fù)膜(replica)。第34頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一anonionroottipcellwithnoetching.斷面的三種處理方法:蝕刻(etching)、不蝕刻(noetching)、深度蝕刻(deepetching)第35頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片,示
Clathrin衣被第36頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一20世紀(jì)60年代問世,用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。分辨力為6~10nm,由于人眼的分辨力(區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力)為0.2mm,掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。(二)掃描電子顯微鏡第37頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一Scanningelectronmicroscope(SEM)第38頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一工作原理:是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品,在樣品表面激發(fā)出次級電子,次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān),次級電子由探測器收集,信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度,顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子,標(biāo)本在固定、脫水后,要噴涂上一層重金屬膜,重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。第39頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一SEMLIGHTPATHWAY第40頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一人類紅細(xì)胞第41頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一酵母第42頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一人類精子第43頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(三)掃描隧道顯微鏡
scanningtunnelingmicroscope,STM原理:根據(jù)隧道效應(yīng)設(shè)計,當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時,此處電子云重疊,外加一電壓(2mV~2V),針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系,將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像,即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率:橫向為0.1~0.2nm,縱向可達0.001nm。用途:三態(tài)(固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài))物質(zhì)均可進行觀察。第44頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一掃描隧道顯微鏡原理引自http://www.iap.tuwien.ac.at第45頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一STMimageofaDNAmolecule第46頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一SchematicdrawingofAFM第47頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一三、顯微操作技術(shù)
micromanipulationtechnique是在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史,1952年,Briggs和King等將不同階段的蛙胚細(xì)胞核注入去核的蛙卵,構(gòu)建核移植胚。Gordon(1962)證明原腸胚以后的細(xì)胞核移植能發(fā)育到成體。1997年,Wilmut等克隆了綿羊Dolly。第48頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一顯微操作儀第49頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一轉(zhuǎn)基因顯微操作過程
第50頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一第二節(jié)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)第51頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法用于對某些細(xì)胞成分進行定性和定位研究。(一)固定物理固定:血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。化學(xué)固定:如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定,顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。第52頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(二)顯示方法金屬沉淀法:如磷酸酶分解磷酸酯底物后,反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀,而顯示出酶活性。Schiff反應(yīng):醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸(Feulgen反應(yīng))。聯(lián)苯胺反應(yīng):過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧,后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍,進而變成棕色化合物。脂溶染色法:借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反應(yīng):顯示蛋白質(zhì)。第53頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一二、免疫細(xì)胞化學(xué)immunocytochemistry是利用抗體同特定抗原專一結(jié)合的原理,對抗原進行定位測定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。免疫熒光法(immunofluorescenttechnique):如異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標(biāo)免疫法(enzyme-labeledantibodymethod):如辣根過氧化物酶。第54頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一三、放射自顯影術(shù)用于研究標(biāo)記化合物在機體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。原理:將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi),經(jīng)過一段時間后,制取切片,涂上鹵化銀乳膠,經(jīng)放射性曝光,使乳膠感光。一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA,用3H-UDR顯示RNA;用3H氨基酸研究蛋白質(zhì),用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年,3H為12.5年。第55頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一四、分子雜交技術(shù)具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段,在適當(dāng)條件下,通過氫鍵結(jié)合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關(guān)系。(一)原位雜交(insituhybridization)。用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探針,后來又發(fā)明了免疫探針法。第56頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片第57頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(二)Southern雜交是體外分析特異DNA序列的方法,操作時先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段,經(jīng)凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上,再用探針雜交,通過放射自顯影,即可辨認(rèn)出與探針互補的特殊核苷序列。將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上,用探針雜交,則稱為Northern雜交。第58頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一六、PCR技術(shù)PCR即:polymerasechainreaction。反應(yīng)體系:①樣品DNA;②引物(primer),約15-20個核苷酸;③4種dNTP;④TagDNA聚合酶,來自于嗜熱水生菌Thermusaquaticus,最適作用溫度75~80℃,短時間在95℃下不失活。⑤緩沖體系和Mg2+。反應(yīng)過程:①變性:約90-95℃;②復(fù)性:約60℃左右;③延伸:70-75℃;④重復(fù)“變性——復(fù)性——延伸”過程20-30次循環(huán)。第59頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一PCR原理第60頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一第三節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)第61頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一一、離心技術(shù)是分離細(xì)胞器及各種大分子基本手段。轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機稱為高速離心機。轉(zhuǎn)速>25kr/min,離心力>89Kg者稱為超速離心機。超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min,離心力超過500Kg。第62頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(一)差速離心Differentialcentrifugation特點:介質(zhì)密度均一;速度由低向高,逐級離心。用途:分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序:核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體——核蛋白體??蓪⒓?xì)胞器初步分離,常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。第63頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation第64頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(二)密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,通過離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。類型:速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì):氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求:1)能產(chǎn)生密度梯度,且密度高時,粘度不高;2)PH中性或易調(diào)為中性;3)濃度大時滲透壓不大;4)對細(xì)胞無毒。第65頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一1、速度沉降velocitysedimentation
用途:分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。特點:介質(zhì)密度較低,介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。原理:介質(zhì)密度梯度平緩,分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。第66頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一2.等密度沉降isopycnicsedimentation用途:分離密度不等的顆粒。特點:介質(zhì)密度高,陡度大,介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。力場比速率沉降法大10~100倍,需要高速或超速離心。原理:樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處,并停留在那里達到平衡,從而將不同密度的成分分離。第67頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation第68頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一二、流式細(xì)胞術(shù)用途:對單個細(xì)胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。原理:包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴,形成包含單個細(xì)胞的液滴,在激光束的照射下,這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光,經(jīng)探測器檢測,轉(zhuǎn)換為電信號,送入計算機處理,輸出統(tǒng)計結(jié)果,并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群,分離純度可達99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液,所用儀器稱為流式細(xì)胞計(flowcytometer)。第69頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一第70頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一三、細(xì)胞電泳原理:在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷,能在外加電場的作用下發(fā)生泳動。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同,故在一定的電場中的泳動速度不同。用途:檢測細(xì)胞生理狀態(tài)、分離不同種類的細(xì)胞。第71頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交一、細(xì)胞培養(yǎng)第72頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一(一)動物細(xì)胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)(massculture):將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中,讓細(xì)胞貼壁生長,匯合(confluence)后形成均勻的單細(xì)胞層;克隆培養(yǎng)(clonalculture):培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液,細(xì)胞貼壁生長,每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落,稱為克隆。第73頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一群體培養(yǎng)(左)和克隆培養(yǎng)(右)
第74頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一原代培養(yǎng)(primaryculture):即:培養(yǎng)來自動物機體的細(xì)胞群。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的容器中培養(yǎng)稱為傳代或傳代培養(yǎng)(passage),每代細(xì)胞分裂約3-6次。細(xì)胞系(cellline):原代培養(yǎng)細(xì)胞成功傳代即為細(xì)胞系。細(xì)胞株(cellstrain):從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。克?。╟lone):亦稱無性系。指由同一個祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。第75頁,共83頁,2023年,2月20日,星期一表三、實驗室中常用的幾種細(xì)胞系細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞HenriettaLacks
BHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP2/0骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國地鼠HenriettaLacks,American
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