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生物技術(shù)基因工程篇第1頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一基因工程(geneticengineering)基因工程又稱DNA重組技術(shù),即在體外把兩種或者兩種以上不同來源的DNA分子重新組合成新的DNA分子,通過載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi),將所需要的經(jīng)過修飾的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá),產(chǎn)生人類所需要的基因或產(chǎn)物,或轉(zhuǎn)基因生物。第2頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一基因工程的基本步驟分離/制備目的基因選擇載體使目標(biāo)基因與載體DNA連接形成重組體以重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(細(xì)菌或其他細(xì)胞)篩選出能夠表達(dá)重組DNA的宿主細(xì)胞,使這些細(xì)胞擴(kuò)增、繁殖獲得大量拷貝的目的基因使目的基因在宿主細(xì)胞表達(dá)出編碼的多肽第3頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一基因工程(原核表達(dá)系統(tǒng))操作的基本步驟第4頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一一、目標(biāo)基因的制備1、限制性內(nèi)切酶法(鳥槍法或散彈法)2、酶促合成法/反向轉(zhuǎn)錄法3、人工合成法4、通過PCR把目的基因擴(kuò)增出來第5頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一1、限制性內(nèi)切酶法(鳥槍法或散彈法)第6頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一優(yōu)點(diǎn):原理簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,具有一定的應(yīng)用范圍

基因組文庫(kù)(genomiclibrary)的制備:用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切成片段,每一段與一個(gè)載體連接成重組DNA,并引入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,得到分子克隆的混合體,稱基因文庫(kù)。缺點(diǎn):所獲得的DNA含有內(nèi)含子,不能在原核細(xì)胞中表達(dá)。第7頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一2、酶促合成法/反向轉(zhuǎn)錄法

mRNA→逆轉(zhuǎn)錄→cDNA第8頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一3、人工合成法蛋白質(zhì)的氨基酸序列※用于結(jié)構(gòu)清楚、分子量較小的基因核苷酸序列化學(xué)合成目的基因按密碼子推算第9頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一

利用化學(xué)合成法已成功合成人生長(zhǎng)激素釋放因子、胸腺素、血管升壓素、胰島素、α干擾素等基因,并進(jìn)一步生產(chǎn)出相應(yīng)的藥物。第10頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一4、通過PCR把目的基因擴(kuò)增出來第11頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一第12頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一二、載體的選擇

載體(vector):運(yùn)載外源性DNA有效地進(jìn)入到受體細(xì)胞內(nèi)的工具。

載體應(yīng)具備的條件分子相對(duì)較?。?~10kb),能進(jìn)行復(fù)制,且具有高拷貝數(shù);具有幾個(gè)單一的酶切位點(diǎn),酶切位點(diǎn)應(yīng)在復(fù)制子以外適當(dāng)?shù)奈恢?能接納盡可能大的外源性DNA。外源性DNA插入后,載體在受體細(xì)胞中的復(fù)制不受影響。第13頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一④必須有便于篩選的明顯標(biāo)志,如耐藥性和空斑形成等,以便于陽(yáng)性克隆細(xì)胞容易被選出;有促進(jìn)外源性DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū);對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害。

※天然載體有很多缺點(diǎn),遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到理想載體的要求,通常使用的載體都是經(jīng)過改造過的載體。第14頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一質(zhì)粒(plasmid)噬菌體(phage)病毒(vector)

載體的種類按來源分

克隆載體(cloningvector)按作用分表達(dá)載體(expressionvector)第15頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一1、質(zhì)粒載體質(zhì)粒的存在與否一般對(duì)細(xì)菌的生存沒有決定性的影響。帶有選擇性遺傳標(biāo)志,如基因的產(chǎn)物可能是降解某些抗生素的酶。在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后,可以構(gòu)建出能在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒(shuttleplasmid)。在基因工程中應(yīng)用廣泛

。實(shí)際應(yīng)用的都是人工構(gòu)建的質(zhì)粒,其中最常用的是pBR322,pUC19等。第16頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制有兩種類型嚴(yán)密型質(zhì)粒:復(fù)制需要蛋白質(zhì)合成和DNA聚合酶Ⅲ的存在,它的復(fù)制與宿主細(xì)胞的增殖密切相關(guān),每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)只有1~5個(gè)嚴(yán)密型質(zhì)粒。

松弛型質(zhì)粒:復(fù)制需要DNA聚合酶Ⅰ,可以在沒有蛋白質(zhì)合成的情況下繼續(xù)復(fù)制,每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)可存有10~200個(gè)以上的松弛型質(zhì)粒,在細(xì)胞蛋白質(zhì)合成及染色質(zhì)復(fù)制停止的情況下,可繼續(xù)大量擴(kuò)增至上千份。

利用此原理可在質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí),加入氯霉素抑制宿主菌蛋白質(zhì)合成,達(dá)到進(jìn)一步擴(kuò)增松弛型質(zhì)粒的目的。第17頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一PBR322抗氨芐青基因抗四環(huán)素基因第18頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一質(zhì)粒的構(gòu)建第19頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一質(zhì)粒攜帶外源基因第20頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一第21頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一(1)λ噬菌體2、噬菌體載體感染細(xì)菌的病毒特點(diǎn):雙鏈DNA分子(線性或環(huán)形)兩端具有12個(gè)nt單鏈互補(bǔ)粘性末端COS位點(diǎn)具非必需區(qū)(中間區(qū)約1/3長(zhǎng)度)可在體外包裝成病毒顆粒,可高效感染宿主細(xì)胞(大腸桿菌)容量大,可以插入23~25Kb左右的外源基因。第22頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一第23頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一根據(jù)生活周期分

溶菌性:在細(xì)菌中連續(xù)增殖直到細(xì)菌裂解,釋放噬菌體溶源性:將其DNA整合入細(xì)菌基因組DNA中,與宿主DNA一起復(fù)制,然后傳給子代,宿主細(xì)胞不發(fā)生裂解。**只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。第24頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一噬菌體的溶源周期和溶菌周期第25頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一類型:

插入型載體:只有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可供插入外源性DNA片段。替代型載體:含有某個(gè)限制性內(nèi)切酶的兩個(gè)切點(diǎn),這兩個(gè)切點(diǎn)間的片段可以被外源性DNA替代。第26頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一第27頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一藍(lán)白篩選載體中含一個(gè)LacZ基因

β-半乳糖苷酶

X-gal(無(wú)色)X(藍(lán)色)+gal(半乳糖)其中X為顯色底物:5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D半乳糖苷

在含X-gal和Lac操縱子誘導(dǎo)物IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)的培養(yǎng)基中

◆非重組的噬菌體轉(zhuǎn)化的宿主菌可以合成β-半乳糖苷酶,分解X-gal,菌落形成藍(lán)色噬菌斑。

◆重組的的噬菌體因LacZ基因被外源DNA插入而破壞,故其轉(zhuǎn)化的宿主菌不能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,因而菌落形成無(wú)色噬菌斑。編碼第28頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一第29頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一第30頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一(2)M13噬菌體(M13phage)特點(diǎn):?jiǎn)捂溇€性DNA分子大腸桿菌被感染后,并不死亡,只是生長(zhǎng)緩慢,而新的噬菌體被釋放到菌體外。感染大腸桿菌后,單鏈線性DNA分子可轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制型(RF)。從大腸桿菌中分離出雙鏈復(fù)制型的M13還可作為克隆雙鏈DNA的載體具非必需區(qū)(IS)第31頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一從宿主菌體中釋放出來的M13噬菌體粒子只含單鏈DNA,其中包含有被克隆的外源性DNA片段中兩條中的一條,因此可用來制備單鏈DNA探針,也可以用作DNA測(cè)序的模板。篩選:藍(lán)白篩選第32頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一

是指含有入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒。

由入噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成。

在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制,但不表達(dá)噬菌體的任何功能。(3)粘尾質(zhì)粒(cosmid)/粘性質(zhì)粒/粘粒/cos質(zhì)粒第33頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一cosmid的構(gòu)造特點(diǎn):

含有抗藥標(biāo)志和復(fù)制起始部位;

一個(gè)或多個(gè)單一酶的限制位點(diǎn);

帶有入噬菌體粘性末端;

分子小,可容納大的外源DNA片段。第34頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一將染色體端粒序列(TEL)、自主復(fù)制序列(ARS)、著絲粒(CEN)以及必要的選擇標(biāo)記(HISA4和TRP)基因和多克隆位點(diǎn)(MSC)的DNA片段克隆到pBR322中,轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞YAC。(1)酵母為宿主的載體3、真核細(xì)胞為宿主的克隆載體人工構(gòu)建的酵母質(zhì)粒

酵母人工微小染色體(YAC)第35頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一第36頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一(2)以植物細(xì)胞為宿主的基因克隆載體Ti質(zhì)粒第37頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一(3)DNA病毒載體1)SV40載體(猴腎病毒)完整的SV40載體利用SV40元件組建的穿梭質(zhì)粒載體,如pSVK3質(zhì)粒:由噬菌體三種載體構(gòu)建而成質(zhì)粒SV402)乳頭瘤病毒載體

如pBPV載體是在牛乳頭瘤病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建的穿梭載體。3)腺病毒載體

如pBPV載體是在牛乳頭瘤病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建的穿梭載體。第38頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一

克隆載體(cloningvector)用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。

表達(dá)載體(expressionvector)在受體細(xì)胞中表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)外源基因的載體。第39頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)大腸桿菌表達(dá)載體除克隆載體的特性外還含有:哺乳動(dòng)物表達(dá)載體除含有原核序列(在E-Coli中的復(fù)制起始點(diǎn)、便于篩選的抗性基因)還包括:?jiǎn)?dòng)子/增強(qiáng)子、克隆位點(diǎn)、終止信號(hào)和加poly(A)信號(hào)。第40頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一三、目標(biāo)基因與載體DNA連接形成重組體

工具酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

能識(shí)別DNA分子內(nèi)部的特異的對(duì)稱序列,水解磷酸酯鍵,切斷分子。

識(shí)別序列的特點(diǎn)

①專一;②常由4~6個(gè)堿基組成;③具有回文序列BamH1酶-GGATCC-

-CCTAGG-第41頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一

限制性內(nèi)切酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的。到目前為止已發(fā)現(xiàn)上千種限制性內(nèi)切酶,其中數(shù)十種被經(jīng)常使用。

水解磷酸二酯鍵,產(chǎn)生DNA片段的5′端為P,3′端為—OH第42頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一第43頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一限制酶的命名

EcoRⅠ細(xì)菌的屬名從該細(xì)菌中分離出的第幾個(gè)酶細(xì)菌種名細(xì)菌株系第44頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一切口類型:

(1)形成粘末端(cohesiveend):第45頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一目的基因第46頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一第47頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一

連接酶的作用是:將互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端連接起來,使之成為一個(gè)完整的DNA分子。第48頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一(2)形成平末端SmaⅠCCC↓GGG

GGG↑CCC第49頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一DNA連接酶(DNAligase)第50頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一四、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化(transformation)

以質(zhì)粒為載體,將攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)染(transfection)由噬菌體或病毒介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程。第51頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一受體細(xì)胞

大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞※受體細(xì)胞必須是限制性內(nèi)切酶缺陷型,即R-菌株,使載體或重組DNA不被水解第52頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一受體細(xì)胞

大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞

細(xì)菌細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)

優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單、增代時(shí)間短、價(jià)格低廉;

某些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平很高

缺點(diǎn):表達(dá)多肽分子常不能適當(dāng)?shù)卣郫B,蛋白質(zhì)常無(wú)生物活性;

異體蛋白質(zhì),常對(duì)細(xì)菌有毒性作用;

缺乏真核細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾的酶,例如使蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化

第53頁(yè),共59頁(yè),2023年,2月20日,星期一轉(zhuǎn)化的方法(1)化學(xué)轉(zhuǎn)化法Cacl2致敏轉(zhuǎn)化法宿主:大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(CompetentCell):E-coli經(jīng)Cac

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