分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)8southern雜交邵2012年定

Southern印跡雜交醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心邵紅霞固相雜交Southernblot:DNANorthernblot:RNA原位雜交：組織、細(xì)胞、菌落斑點(diǎn)雜交核酸雜交的方法液相雜交核酸分子雜交示意圖核酸變性待檢基因雜交探針：

DNARNA

復(fù)性（雜交）雜交：堿基互補(bǔ)>連續(xù)4bp形成雙鏈>連續(xù)17bp人基因特異雜交實(shí)驗(yàn)原理互補(bǔ)的核苷酸序列通過(guò)堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過(guò)程稱為雜交。雜交過(guò)程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夂驼莆誗outhern雜交的基本原理和操作。實(shí)驗(yàn)流程圖基因重組與轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒提取與鑒定質(zhì)粒大量制備探針制備細(xì)胞培養(yǎng)基因組DNA制備DNA濃度測(cè)定酶切PCRSouthernblot酶切DNA片段凝膠電泳分離轉(zhuǎn)移并固定到膜上與標(biāo)記探針雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理Southern雜交是利用標(biāo)記的探針（probe）與膜上靶DNA片段進(jìn)行雜交的技術(shù)，檢測(cè)靶DNA片段中是否存在與探針同源的序列。主要步驟包括：（1）基因組DNA的限制性酶切（2）DNA酶切片段的電泳分離和轉(zhuǎn)移（3）雜交及檢測(cè)Southernblot探針酶催化顯色轉(zhuǎn)移示意圖：毛細(xì)管作用（向上轉(zhuǎn)移法）pSV-c-mycBamHIXbaIc-myc基因片段4.8kbpSV2載體片段3.5kb變性隨機(jī)引物DNA聚合酶IKlenow片段32P-dCTP(Dig-dUTP)，dNTPs隨機(jī)引物延伸法標(biāo)記探針Dig-HRPDAB/H2O2

（辣根過(guò)氧化物酶四氫氯化二氨基聯(lián)苯胺/過(guò)氧化氫）結(jié)果呈棕色。反應(yīng)穩(wěn)定，價(jià)廉，但靈敏度低。Dig-AKPBCIP/NBT（堿性磷酸酶5-溴4-氯3-吲哚磷酸鹽/四唑氮鹽）結(jié)果呈藍(lán)紫色。反應(yīng)不穩(wěn)定，昂貴，但靈敏度高。

酶標(biāo)抗體顯色系統(tǒng)主要實(shí)驗(yàn)材料尼龍膜（陽(yáng)性電荷）：400-500g核酸/cm2膠變性液：0.5mol/LNaOH、1.5mol/LNaCl轉(zhuǎn)移緩沖液：10×SSC預(yù)雜交液：5×SSC0.02%SDS0.1%十二烷基肌氨酸鈉

100g/mL經(jīng)變性并斷裂成片段的鮭魚(yú)精DNA1/10體積封閉溶液雜交液：預(yù)雜交液，探針實(shí)驗(yàn)流程基因組DNA經(jīng)酶切成小片段（EcoRⅠ或HindIII）電泳分開(kāi)各片段1％瓊脂糖凝膠電泳

變性

雙鏈經(jīng)堿變性解開(kāi)成兩條單鏈轉(zhuǎn)膜及固定DNA經(jīng)毛細(xì)管作用轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，紫外交聯(lián)固定預(yù)雜交

雜交

洗膜洗去未與靶DNA結(jié)合的探針檢測(cè)

雜交條帶通過(guò)抗-DIG-AP及其酶底物顯色減少標(biāo)記探針的非特異性結(jié)合，小分子鮭精DNA為競(jìng)爭(zhēng)性封閉劑靶DNA單鏈與DIG標(biāo)記的c-myc探針之間以堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行雜交Simplifiedrestrictionmapofthehumanc-mycgenelocus,including22kbofthe3’-flankingregeion

B,BamHI;Bg,BglII;C,ClaI;E,EcoRI;H,HindIII;K,KpnI;S,SstI;X,XbaISolidrectanglesrepresentthethreec-mycexonsC-myc基因由3個(gè)外顯子及2個(gè)內(nèi)含子組成，第一個(gè)外顯子不編碼，只起調(diào)節(jié)作用，只有外顯子2和3與V-myc相對(duì)應(yīng)，編碼一個(gè)439個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)步驟（1）HL60基因組DNA10μLEcoRⅠ

Buffer2μLEcoRⅠ

（10u/ml）2μLddH2O6μL總體積20μL（2）HL60基因組DNA10μL10×BufferR2μLHindIII（10u/ml）2μLddH2O6μL總體積20μL一.基因組DNA的限制性內(nèi)切酶酶切37℃保溫1.5小時(shí)。確保DNA量至少10ug二.1％瓊脂糖電泳兩組共用一塊凝膠，共7個(gè)樣1.基因組DNA10μg2.酶切樣品（1）3.酶切樣品（2）4.陽(yáng)性對(duì)照（4.8kbc-myc線性片段，300pg)5.酶切樣品（1）6.酶切樣品（2）7.基因組DNA10μg組1組2電泳80V直到溴酚藍(lán)到達(dá)離凝膠末端1cm處三.變性將凝膠浸在5倍體積的膠變性液中,慢慢搖動(dòng)20分鐘，ddH2O洗2次，每次5分鐘（搖），在膠中和液中慢慢搖動(dòng)15分鐘。同時(shí)將膜浸在10×SSC中四.轉(zhuǎn)移在搪瓷盤(pán)中加入300mL10×SSC，濾紙浸濕放上培養(yǎng)皿和小玻璃板將3張長(zhǎng)濾紙浸濕，逐張放在玻璃板上，用移液管的滾動(dòng)，趕走氣泡切除多余凝膠，小心地將凝膠（翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)）放在濾紙上，趕走濾紙與膠之間的氣泡再將與膠大小相同的尼龍膜放在膠上，同樣不能有氣泡，然后放上三張浸濕的短濾紙，趕走氣泡緊貼凝膠四周各放一張X光片小心蒙上一張比搪瓷盤(pán)大的保鮮膜。保鮮膜要緊貼濾紙，但不能讓濾紙移動(dòng)用刀片在離濾紙周圍約1-2mm處，輕輕割斷保鮮膜，但不能割破濾紙。取走濾紙上的保鮮膜整齊地放上草紙，數(shù)張草紙一折二，草紙堆要高出搪瓷盤(pán)邊約10cm。在草紙上放上玻璃板,壓上約500g重的重物,轉(zhuǎn)移過(guò)夜五.固定將膠和尼龍膜一起翻過(guò)來(lái),用鉛筆深入加樣槽在尼龍膜上畫(huà)上槽的位置（右上角做好組號(hào)標(biāo)記）將尼龍膜連同底下的濾紙統(tǒng)一放在一張A4紙上，正面朝上放在紫外交聯(lián)儀中（909室），raiseC3，150mJ，反復(fù)2次，交聯(lián)固定固定后放4℃保存至第二周，上課前一天取出，進(jìn)行后續(xù)預(yù)雜交和雜交六.雜交和洗膜將尼龍膜放入雜交管內(nèi),加預(yù)雜交液,65℃封閉6小時(shí)。倒出預(yù)雜交液（可回收）,加雜交液,65℃雜交過(guò)夜?；厥针s交液(可重復(fù)使用),將膜放在洗膜溶液I

(2×SSC,0.1%SDS)中,室溫洗2次,每次搖動(dòng)5分鐘。再在洗膜溶液II

(

0.5×SSC,0.1%SDS

)中,68℃洗2次,每次搖動(dòng)15分鐘。（需預(yù)熱到68℃）雜交液和預(yù)雜交液從冷凍保存中取出，100℃煮沸5min，立即放入冰浴隨后加入雜交管，倒入事先放好膜的雜交管內(nèi)七.檢測(cè)將膜在緩沖液1(馬來(lái)酸緩沖液)中漂洗3分鐘。在緩沖液2中室溫?fù)u動(dòng)封閉30分鐘。在含anti-DIG-AP的抗體溶液中室溫?fù)u動(dòng)，孵育30分鐘。（做密閉袋，先放膜，后封邊，再加入抗體溶液，以1.2μl加入5ml緩沖液配成，最后封口）用洗膜溶液III(馬來(lái)酸緩沖液，0.3%吐溫)洗2次,每次15分鐘。在緩沖液3（檢測(cè)緩沖液）中平衡3分鐘。將膜與新鮮配制的顯色溶液一起在黑暗中溫育0.5~16小時(shí)。（以60μl加入3ml檢測(cè)緩沖液配制）當(dāng)條帶顯色到合適的深度后,或在膜背景變深前,用ddH2O洗去底物液，拍照并干燥保存。預(yù)期結(jié)果基因組EcoRI600pg300pg4.8kb8.5kb預(yù)期結(jié)果影響雜交的因素核酸分子的濃度和長(zhǎng)度探針濃度溫度：適宜溫度為T(mén)m-20~25℃離子強(qiáng)度雜交液體積和雜交時(shí)間非特異性雜交反應(yīng)：預(yù)雜交的作用固相支持膜的選擇： 硝酸纖維素膜 尼龍膜雜交后膜的漂洗注意事項(xiàng)DNA限制性酶的用量為1-5U/

μgDNA,時(shí)間為1-20小時(shí)。若基因組DNA濃度低,可在酶切后用乙醇沉淀濃縮。標(biāo)記探針在加入雜交液之前,一定要加熱變性處理,并且要先在雜交液中混勻后加入,不要直接加在膜上