(18)-7-原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生物技術(shù)制藥

基因工程菌的構(gòu)建-原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)學(xué)習(xí)目標(biāo)熟悉并掌握如何構(gòu)建有效的原核表達(dá)系統(tǒng)理解并識記原核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點蛋白表達(dá)系統(tǒng)以實現(xiàn)外源基因在宿主中表達(dá)為目的，由宿主、外源基因、載體和一些輔助成分共同組成的體系1973年，S.Cohen等首次將含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒和含四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，使其獲得兩種抗性。外源基因在大腸桿菌中成功表達(dá)基因工程元年原核表達(dá)系統(tǒng)已建立原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌、沙門氏菌、蘇云金桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等主要優(yōu)點宿主菌遺傳背景清楚，商品化菌種齊全，方便購買原核細(xì)胞操作簡便、繁殖快和周期短大規(guī)模生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量較高下游純化工藝簡單，易于控制，生產(chǎn)效率高目的基因結(jié)構(gòu)與形式啟動子外顯子內(nèi)含子外顯子外顯子內(nèi)含子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)cDNA：在體外經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后與RNA互補(bǔ)的DNA鏈。與基因組DNA不同，cDNA沒有內(nèi)含子而只有外顯子的序列原核表達(dá)體系選取目的基因時，要選用cDNA目的基因結(jié)構(gòu)與形式密碼子偏愛性：只選用同一種氨基酸同義密碼子中的1~2種，稱為偏愛密碼子稀有密碼子：不被經(jīng)常利用的密碼子稱為稀有或利用率低的密碼子大腸桿菌稀有密碼子：AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC密碼子表表達(dá)載體選擇與構(gòu)建理想表達(dá)體系強(qiáng)而可控的啟動子核糖體結(jié)合位點轉(zhuǎn)錄終止信號較高拷貝數(shù)穩(wěn)定性好表達(dá)產(chǎn)物易純化常見啟動子：lac、trp、tac、PL/PR、T7基因工程常用工程菌：經(jīng)改造的限制系統(tǒng)和重組系統(tǒng)缺陷的細(xì)菌選擇菌株依據(jù)原則：菌株與表達(dá)載體配套外源表達(dá)蛋白穩(wěn)定性：考慮蛋白酶缺陷型菌株作為起始表達(dá)菌株外源基因的結(jié)構(gòu)目的蛋白的結(jié)構(gòu)宿主菌的選擇外源基因表達(dá)形式胞內(nèi)表達(dá)：融合型表達(dá)載體——融合蛋白非融合型表達(dá)載體——天然完整蛋白胞外表達(dá)：分泌型表達(dá)載體——產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙非融合表達(dá)載體非融合表達(dá)：外源基因的一種獨立表達(dá)形式，不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)或多肽融合在一起進(jìn)行表達(dá)，即將外源基因直接克隆與啟動子和SD序列的下游進(jìn)行表達(dá)易被蛋白酶降解可能形成不溶性包含體PSD目的基因終止序列融合表達(dá)載體融合表達(dá)：將一段特殊的蛋白質(zhì)或短肽的基因構(gòu)建入載體，使之與目的蛋白連接表達(dá)形成融合蛋白融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)較穩(wěn)定，表達(dá)效率提高原核短肽設(shè)計為可用于親和純化的標(biāo)簽，從而大大簡化融合蛋白的純化可以通過化學(xué)方法或蛋白酶法切除融合蛋白中特殊蛋白質(zhì)，形成具有活性的目的蛋白PSD目的基因終止序列編碼特殊蛋白基因胞外表達(dá)通過將外源基因融合至編碼原核蛋白信號肽序列的下游實現(xiàn)分泌分泌至周質(zhì)周質(zhì)腔中蛋白酶含量少，蛋白穩(wěn)定性高表達(dá)量較胞內(nèi)低可能形成包含體分泌至胞外（培養(yǎng)基中）可直接分析培養(yǎng)液中重組蛋白水平下游純化步驟簡單原核工程菌篩選個體水平篩選抗生素抗性篩選法α-互補(bǔ)篩選法營養(yǎng)缺陷性篩選法噬菌斑篩選法分子水平篩選核酸分子雜交法PCR方法限制性內(nèi)切酶譜法DNA序列測定法蛋白水平篩選酶聯(lián)免疫吸附