利用甜菜堿提升賴氨酸發(fā)酵及其代謝通量分析

利用甜菜堿提升賴氨酸發(fā)酵及其代謝通量分析洪銘;李巖;張?zhí)K龍;李雪松;封彬;陳波;王俊杰【摘要】賴氨酸發(fā)酵后期會(huì)產(chǎn)生很高的滲透壓.甜菜堿可以有效提高大腸桿菌對(duì)滲透壓的耐受性,大腸桿菌菌體自身對(duì)滲透壓的耐受機(jī)制反而會(huì)受其抑制.激活菌體自身的滲透壓耐受機(jī)制，可以提高發(fā)酵指標(biāo)?實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在菌體生長(zhǎng)到OD562為19.5后添加甜菜堿，可以使賴氨酸的發(fā)酵強(qiáng)度從5.6g/(L?h)提升至6.3g/(L?h),轉(zhuǎn)化率從65%提升至68.5%?提高初糖質(zhì)量濃度也能激活菌體滲透壓耐受性，可以進(jìn)一步提高發(fā)酵強(qiáng)度至6.6g/(L?h).代謝通量分析結(jié)果表明:高轉(zhuǎn)化率工藝條件下6-磷酸果糖的逆向轉(zhuǎn)化進(jìn)入磷酸戊糖途徑的通量較對(duì)照提高43%,而TCA循環(huán)通量較對(duì)照降低18.6%.研究結(jié)果表明:除去發(fā)酵初期的甜菜堿并提高初糖質(zhì)量濃度有利于提高賴氨酸發(fā)酵水平,要提高轉(zhuǎn)化率需將更多6-磷酸果糖導(dǎo)入磷酸戊糖途徑并降低TCA循環(huán)通量.期刊名稱】《發(fā)酵科技通訊》年(卷),期】2019(048)003【總頁(yè)數(shù)】7頁(yè)(P125-131)【關(guān)鍵詞】賴氨酸;大腸桿菌;滲透壓;甜菜堿;代謝通量分析【作者】洪銘;李巖;張?zhí)K龍;李雪松;封彬;陳波;王俊杰【作者單位】廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】Q819賴氨酸是一種重要的氨基酸，大量用作營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和飼料添加劑［1］。目前全世界賴氨酸產(chǎn)量約220萬t/年，市場(chǎng)規(guī)模約達(dá)到15億美元［2］。鑒于賴氨酸巨大的市場(chǎng)價(jià)值，研究人員對(duì)賴氨酸的生物合成和發(fā)酵優(yōu)化進(jìn)行了大量研究［3-7］。大腸桿菌是一種重要的賴氨酸生產(chǎn)菌，它對(duì)滲透壓較為敏感［8］。在大腸桿菌發(fā)酵賴氨酸的過程中，滲透壓會(huì)超過2000mOsm，為了維持發(fā)酵后期菌體活性，必須通過添加甜菜堿來提高菌體對(duì)滲透壓的耐受性［9-12］。然而，在單純依賴甜菜堿的條件下，菌體已經(jīng)無法很好地抵抗外界高滲透壓環(huán)境。要提高菌體對(duì)外界高滲透壓的耐受性，必須激發(fā)菌體其他的抗高滲透壓機(jī)制。目前關(guān)于賴氨酸發(fā)酵滲透壓調(diào)控方法未見報(bào)道。Ishida等［13］發(fā)現(xiàn)將大腸桿菌放在高滲透壓條件下處理30min，可以提高大腸桿菌在高滲透壓條件下的生長(zhǎng)速度，說明大腸桿菌在高滲透壓條件下可以自發(fā)產(chǎn)生高滲透壓耐受性；S3vin等［14］發(fā)現(xiàn)在高滲透壓環(huán)境條件下，大腸桿菌會(huì)積累輔酶Q8，并證明了輔酶Q8可以提高大腸桿菌對(duì)滲透壓的耐受性，其機(jī)制在于輔酶Q8的長(zhǎng)異戊二烯側(cè)鏈可以提高細(xì)胞壁強(qiáng)度。在一定的高滲透壓條件下，細(xì)胞會(huì)失去水分，同時(shí)會(huì)積累海藻糖，而在向培養(yǎng)基中添加甜菜堿的條件下，細(xì)胞內(nèi)的水分會(huì)恢復(fù)到正常水平，同時(shí)并未出現(xiàn)海藻糖的積累［15］。上述研究表明，大腸桿菌在高滲透壓的條件下會(huì)發(fā)生一系列的生理變化，失去水分，菌體會(huì)通過吸收外界滲透壓相容物（如甜菜堿）或提高細(xì)胞壁強(qiáng)度來提高菌體對(duì)環(huán)境高滲透壓的耐受性菌體在吸收甜菜堿后胞內(nèi)水分會(huì)恢復(fù)到正常水平，此時(shí)菌體不需要調(diào)整代謝來適宜外界高滲透壓環(huán)境，因而不會(huì)提高輔酶Q8或甜菜堿的合成來對(duì)抗外界高滲環(huán)境?？梢詫⒕w對(duì)高滲透壓耐受分為兩個(gè)主要機(jī)制：1)吸收環(huán)境中的滲透壓相容物；2)菌體自身發(fā)生變化(合成滲透壓相容物如海藻糖或提高細(xì)胞壁強(qiáng)度如合成輔酶Q8)，提高對(duì)外界高滲透壓的耐受性。在機(jī)制1)條件下會(huì)削弱機(jī)制2)的形成，而提高細(xì)胞壁強(qiáng)度等措施只有在細(xì)胞分裂過程中才會(huì)生效，因而最合適的時(shí)機(jī)是在菌體快速生長(zhǎng)階段。筆者通過調(diào)整甜菜堿的添加時(shí)機(jī)，使菌體在發(fā)酵初期能經(jīng)歷較高滲透壓環(huán)境，自身產(chǎn)生對(duì)滲透壓的耐受性，在發(fā)酵后期可以吸收甜菜堿，獲得進(jìn)一步的滲透壓耐受性。代謝通量分析是解析菌內(nèi)微觀代謝特點(diǎn)的重要方法［16］。通過代謝通量分析可以對(duì)底物代謝去向和比例進(jìn)行定量分析，從而找到新的代謝靶點(diǎn)或者對(duì)上游代謝改造的結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。相較于酶活或者轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，代謝通量分析能更加直觀地反映菌體的真實(shí)代謝情況［17］。主要通過發(fā)酵工藝的改進(jìn)，改變甜菜堿的添加時(shí)機(jī)，使菌體本身產(chǎn)生滲透壓耐受性，從而與吸收甜菜堿獲得的滲透壓耐受性相疊加，最終提高大腸桿菌對(duì)發(fā)酵過程中高滲透壓的耐受性，使發(fā)酵強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率有所提高。在得到高轉(zhuǎn)化率工藝后，對(duì)其胞內(nèi)代謝通量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了高轉(zhuǎn)化率發(fā)酵過程的代謝特點(diǎn)。1材料與方法菌種與培養(yǎng)基賴氨酸發(fā)酵菌種為基因工程改造的大腸桿菌，保存在本實(shí)驗(yàn)室中。種子培養(yǎng)基(g/L):淀粉水解糖30,玉米漿15，酵母粉40,硫酸銨10,磷酸氫二鉀1,硫酸鎂0.5，碳酸鈣10,pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甜菜堿2，葡萄糖30,糖蜜20,玉米漿20,硫酸銨30,磷酸氫二鉀1,硫酸鎂0.5。滲透壓測(cè)定滲透壓采用Osmomatbasic3000(德國(guó)gonotec)冰點(diǎn)滲透壓儀進(jìn)行測(cè)定。取2mL樣品轉(zhuǎn)入離心管中，12000r/min離心2min,取上清50pL,轉(zhuǎn)入1.5mLEP管中，放入冰點(diǎn)滲透壓儀中進(jìn)行測(cè)定。賴氨酸測(cè)定高效液相色譜儀為Agilent1200HPLC（AgilentTechnologies）;色譜柱為KromasilC18（200x4.6mm,5pm）;流動(dòng)相為V（乙腈）：V（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的醋酸鈉，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6.8）=42:58;檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm;流速為1mL/min。葡萄糖濃度測(cè)定葡萄糖濃度采用生物傳感分析儀（SBA-40C,山東省科學(xué)院生物研究所）進(jìn)行測(cè)定。取樣，稀釋10倍后，取25pL稀釋液測(cè)定葡萄糖濃度。菌濃測(cè)定菌濃采用722E型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）測(cè)定。取1mL樣品，稀釋50倍，在波長(zhǎng)562nm條件下測(cè)定樣品OD562。游離銨濃度測(cè)定游離銨采用凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定。賴氨酸發(fā)酵方法賴氨酸發(fā)酵用百倫50L發(fā)酵罐進(jìn)行；接種量為10%（按體積分?jǐn)?shù)計(jì)）；加入氨水，控制發(fā)酵pH為6.8±0.2;流加硫酸銨，控制游離銨質(zhì)量濃度為1±0.1g/L;流加葡萄糖，控制發(fā)酵過程中糖的質(zhì)量濃度為2~4g/L;通過調(diào)整通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速使得發(fā)酵過程中溶氧＞30%;發(fā)酵溫度為37°C。代謝通量分析研究所采用的代謝通量分析基于化學(xué)計(jì)量的方法進(jìn)行。代謝通量分析過程中所用代謝網(wǎng)絡(luò)如表1所示。該代謝網(wǎng)絡(luò)由糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)、賴氨酸合成反應(yīng)和能量代謝反應(yīng)等23個(gè)代謝反應(yīng)組成，其中r1~r19為速率未知的代謝反應(yīng)，r20~r23是經(jīng)過測(cè)定的已知代謝速率的反應(yīng)。表1大腸桿菌產(chǎn)賴氨酸代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)Table1ReactionnetworkofE.coliproducinglysine編號(hào)代謝反應(yīng)r1葡萄糖+ATP—6-磷酸葡萄糖r26-磷酸葡萄糖-6-磷酸果糖r36-磷酸果糖+ATP-2x3-磷酸甘油醛r43-磷酸甘油醛-3-磷酸甘油酸+ATP+NADHr53-磷酸甘油酸-丙酮酸+ATPr66-磷酸葡萄糖-6-磷酸葡萄糖酸+NADPHr76-磷酸葡萄糖酸-5-磷酸核酮糖+CO2+NADPHr83x5-磷酸核酮糖-2x6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛r9丙酮酸-乙酰輔酶A+NADH+CO2r10乙酰輔酶A+草酰乙酸-檸檬酸r11檸檬酸-a-酮戊二酸+NADPH+CO2r12a-酮戊二酸—琥珀酸+NADH+CO2+ATPr13琥珀酸—草酰乙酸+FADH2+NADHr14丙酮酸+ATP+CO2-草酰乙酸r15草酰乙酸+丙酮酸+4xNADPH+ATP-賴氨酸+CO2r16NADH+0.5xO2-2.5xATPr17FADH2+0.5xO2-1.5xATPr18檸檬酸—檸檬酸.extr19ATP-ATP.extr20O2.ext-O2r21CO2-CO2.extr22葡萄糖.ext-葡萄糖r23賴氨酸-賴氨酸.ext基于表1中的代謝網(wǎng)絡(luò)，由19個(gè)中間代謝物通過化學(xué)計(jì)量平衡得到的化學(xué)計(jì)量矩陣如表2所示，該矩陣每一行代表一個(gè)代謝物的平衡式，每一列代表一個(gè)代謝反應(yīng)，其中未知反應(yīng)r1~r19構(gòu)成的矩陣記作S，已知反應(yīng)r20~r23構(gòu)成的矩陣記作B，需要求解的代謝反應(yīng)向量記作V,已知反應(yīng)組成的列向量[r20,r21,r22,r23]T記作V0。根據(jù)化學(xué)計(jì)量守恒有SxV=(-B)xV0,利用矩陣除法可以計(jì)算出需求解的代謝反應(yīng)向量V=S\[(-B)xV0]。2結(jié)果與討論提高發(fā)酵液滲透壓對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響由于賴氨酸發(fā)酵后期的滲透壓超過2000mOsm，這種高滲透壓環(huán)境可能對(duì)菌體生長(zhǎng)造成較大影響，這些滲透壓的主要來源是賴氨酸。為了研究高滲透壓對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響，在初始培養(yǎng)基中添加300mmol的賴氨酸或氯化鈉，觀察不同類型的高滲透壓來源是否帶來相同的影響，以考察高滲透壓是否是后期發(fā)酵效率下降的主要因素。初始培養(yǎng)基中添加賴氨酸或氯化鈉對(duì)發(fā)酵的影響如圖1所示。在賴氨酸發(fā)酵過程中，初始滲透壓為718mOsm，發(fā)酵前期，由于葡萄糖等成分的濃度不斷下降，導(dǎo)致滲透壓不斷下降；發(fā)酵中后期，隨著賴氨酸等的濃度不斷提高，滲透壓會(huì)不斷升高，最終到達(dá)2350mOsm。在初始培養(yǎng)基中添加300mmol的賴氨酸后，雖然前期發(fā)酵液中賴氨酸質(zhì)量濃度比對(duì)照組高(0h，對(duì)照賴氨酸6g/L，添加賴氨酸的組賴氨酸61g/L)，但是12h后與對(duì)照組的賴氨酸質(zhì)量濃度差越來越小，36h放罐時(shí)的賴氨酸質(zhì)量濃度甚至略低于對(duì)照組，如圖1(a)所示。培養(yǎng)基中添加賴氨酸后，初始滲透壓比對(duì)照高，而到放罐時(shí)，其滲透壓比對(duì)照略低，如圖1(b)所示，對(duì)照組2350mOsm，添加賴氨酸組2312mOsm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：通過添加賴氨酸來提高發(fā)酵液中滲透壓強(qiáng)度后，對(duì)發(fā)酵前期影響較小，菌體對(duì)中等濃度的滲透壓有一定的耐受能力，而到發(fā)酵后期菌體無法耐受太高的滲透壓，導(dǎo)致賴氨酸合成的速度越來越慢，最終在添加賴氨酸的實(shí)驗(yàn)組的賴氨酸濃度較對(duì)照偏低。表2大腸桿菌產(chǎn)賴氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝物化學(xué)計(jì)量平衡矩陣Table2ThestoichiometricmatrixofthemetabolicnetworkofE.coliproducinglysine中間代謝物「1r2r3r4r5r6r7r8r9r10r11r12r13r14r15r16r17r18r19r20r21r22r23葡萄糖-116-磷酸葡萄糖1-1-16-磷酸果糖1-123-磷酸甘油醛2-113-磷酸甘油酸1-16-磷酸葡萄糖酸1-15-磷酸核酮糖1-3乙酰輔酶A1-1檸檬酸1-1-1a-酮戊二酸1琥珀酸1-1草酰乙酸-111-1賴氨酸1-1O2-O.5-O.51CO21111-11-1NADPH111-4FADH21-1ATP-1-1111-1-12.51.5-1丙酮酸1-1-1-1由于賴氨酸本身也有可能抑制賴氨酸的合成，為了驗(yàn)證上述抑制作用主要是來自滲透壓，筆者在另一個(gè)發(fā)酵罐的初始培養(yǎng)基中添加了300mmol氯化鈉。添加氯化鈉后，發(fā)酵過程中滲透壓變化趨勢(shì)與添加賴氨酸的實(shí)驗(yàn)組基本相同，見圖1(b);而賴氨酸質(zhì)量濃度在發(fā)酵前期與對(duì)照組相當(dāng)，發(fā)酵后期比對(duì)照組低。在賴氨酸發(fā)酵過程中，無論是添加賴氨酸或者氯化鈉，提高發(fā)酵液滲透壓的措施后，發(fā)酵后期的發(fā)酵液的滲透壓都趨近2300mOsm,說明菌體難以在更高的滲透壓條件下繼續(xù)高效合成賴氨酸，無法繼續(xù)提高發(fā)酵液中賴氨酸的質(zhì)量濃度。圖1初始培養(yǎng)基中添加賴氨酸或氯化鈉對(duì)發(fā)酵的影響Fig.1EffectofaddinglysineorNaClonlysinefermentation甜菜堿添加時(shí)機(jī)對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響大腸桿菌對(duì)滲透壓的耐受性主要來自兩個(gè)方面：1）吸收環(huán)境中滲透壓相容物；2）提高自身滲透壓耐受性。若這兩種功能可以同時(shí)發(fā)揮作用則可以進(jìn)一步提高菌體對(duì)高滲透壓的耐受性。賴氨酸發(fā)酵前期（即菌體的生長(zhǎng)階段）發(fā)酵液中的滲透壓較低，發(fā)酵后期滲透壓則會(huì)很高。大腸桿菌在生長(zhǎng)階段通過提高細(xì)胞壁的強(qiáng)度可以提高對(duì)滲透壓的耐受性，而當(dāng)初始培養(yǎng)基中含有滲透壓相容物后，菌體就不會(huì)自發(fā)提高細(xì)胞壁強(qiáng)度。要在賴氨酸發(fā)酵過程中進(jìn)一步提高滲透壓耐受性，應(yīng)該將底料中的甜菜堿除去，保證菌體在生長(zhǎng)階段無法吸收甜菜堿，從而自發(fā)提高細(xì)胞壁強(qiáng)度；到穩(wěn)定期后再將甜菜堿投入發(fā)酵罐中，這樣大腸桿菌就能擁有兩種提高耐受滲透壓的方式，從而更好地抵抗后期滲透壓的影響。除去底料中的甜菜堿，然后在不同批次的賴氨酸發(fā)酵過程中OD562分別達(dá)到9.7，19.5和30.1時(shí)將等量的甜菜堿倒入發(fā)酵罐中，觀察不同甜菜堿添加時(shí)機(jī)對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響，對(duì)照組的甜菜堿在底料中添加，如圖2所示。在正常發(fā)酵過程中（對(duì)照組），菌體OD562在10h前快速生長(zhǎng),10-20h菌體生長(zhǎng)速度變慢,20-28h菌體濃度趨于穩(wěn)定,28-36h菌體濃度略有下降。當(dāng)在菌體OD562分別為9.7,19.5,30.1時(shí)，添加甜菜堿，添加甜菜堿前，菌體OD562比對(duì)照組略低，添加甜菜堿后，菌體OD562開始快速增長(zhǎng)，36h時(shí)菌體OD562均比對(duì)照組高，在菌體生長(zhǎng)到OD562越高的時(shí)候添加甜菜堿則下罐OD562越高。上述結(jié)果表明，在菌體生長(zhǎng)到一定程度后再添加甜菜堿可以促使菌體形成對(duì)滲透壓的耐受性，進(jìn)而促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，并提高后期菌體OD562。圖2在菌體生長(zhǎng)到不同OD562條件下添加甜菜堿對(duì)生長(zhǎng)的影響Fig.2EffectofaddingbetaineatdifferentOD562oncellgrowth推遲添加甜菜堿，除了能促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，還能提高發(fā)酵強(qiáng)度。在不同OD562時(shí)添加甜菜堿，能提高下罐賴氨酸的濃度，OD562為9.7，19.5和30.1時(shí)添加甜菜堿，下罐賴氨酸質(zhì)量濃度分別為171,177，185g/L，添加甜菜堿的時(shí)候OD562越大，下罐賴氨酸質(zhì)量濃度越高，同時(shí)菌體耐受的滲透壓也越高，分別為2380，2410，2490mOsm(見表3)。推遲添加甜菜堿使發(fā)酵強(qiáng)度較對(duì)照組有了較大提高，如表3所示，OD562為9.7，19.5和30.1時(shí)添加甜菜堿，對(duì)應(yīng)發(fā)酵強(qiáng)度分別較對(duì)照組提高了3.6%，8.9%和12.5%，說明推遲添加甜菜堿可以有效提高菌體活力，從而提高賴氨酸的生產(chǎn)效率。表3在菌體生長(zhǎng)到不同OD562時(shí)添加甜菜堿后的發(fā)酵結(jié)果Table3FermentationresultsafteraddingbetaineatdifferentOD562項(xiàng)目對(duì)照組添加甜菜堿時(shí)OD562值9.719.530.1最高OD56238.2±0.839.8±0.740.5±0.941.5±0.836h時(shí)OD56234.3±0.735.5±0.837.2±0.838.5±0.9賴氨酸/?L-1)165±4171±3177±4185±4滲透壓/mOsm2350±612380±412410±522490±45轉(zhuǎn)化率/%65±0.467.4±0.368.5±0.568±0.4產(chǎn)率/?L-1?h-1)5.6±0.25.8±0.16.1±0.26.3±0.2在不同OD562時(shí)添加甜菜堿不僅能夠提高菌體生長(zhǎng)速度和發(fā)酵強(qiáng)度，還能提高發(fā)酵轉(zhuǎn)化率，如表3所示。在OD562為9.7,19.5,30.1時(shí)添加甜菜堿，轉(zhuǎn)化率分別較對(duì)照組提升了2.4%,3.5%,3%;在OD562為19.5時(shí)添加甜菜堿時(shí)的轉(zhuǎn)化率最高；繼續(xù)提高OD562至30.1后，轉(zhuǎn)化率反而開始降低，這可能是因?yàn)楫?dāng)繼續(xù)提高添加甜菜堿時(shí)的OD562值后菌體最終生長(zhǎng)的OD562過高，反而需要消耗更多能量用于菌體生長(zhǎng)和維持，如圖2。因此，從轉(zhuǎn)化率的角度看，最佳甜菜堿添加時(shí)機(jī)是OD562為19.5時(shí)。提高發(fā)酵初期滲透壓對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響在2.2中，通過除去底料里的甜菜堿并在OD562生長(zhǎng)到一定階段后再將等量甜菜堿投入發(fā)酵罐中，成功提高了發(fā)酵強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期基本相符，在一定程度上證明了在菌體生長(zhǎng)初期除去甜菜堿可以使得菌體獲得對(duì)滲透壓的耐受性。既然在沒有甜菜堿的條件下，菌體在生長(zhǎng)過程中可以獲得滲透壓耐受性，那么提高初期發(fā)酵液的滲透壓強(qiáng)度可能使得菌體對(duì)滲透壓的耐受性進(jìn)一步強(qiáng)化。在2.3中，移除發(fā)酵底料中的甜菜堿，然后在OD562生長(zhǎng)到20左右，將甜菜堿倒入發(fā)酵液中，接著提高發(fā)酵0h時(shí)葡萄糖質(zhì)量濃度(見圖3(a))，提高發(fā)酵初期的滲透壓強(qiáng)度(見圖3(b))，觀察提高發(fā)酵初期滲透壓強(qiáng)度對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響。除去底料中甜菜堿后(OD562到20左右將甜菜堿倒入發(fā)酵罐)，將初糖質(zhì)量濃度從30g/L提高到40g/L，8h之前OD562會(huì)略微降低，發(fā)酵12h后，OD562比對(duì)照組高，下罐時(shí)OD562也高于對(duì)照組，見圖3(c);同時(shí)，36h時(shí)發(fā)酵液中的賴氨酸質(zhì)量濃度從177g/L提高到185g/L，見圖3(d)，發(fā)酵強(qiáng)度從6.1g/L/h提高到6.6g/(L?h),見表4。然而，提高初糖質(zhì)量濃度后，轉(zhuǎn)化率從68.5%下降到67.5%，這可能是提高了菌體OD562后增加了能量消耗造成的。圖3提高初糖濃度對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響Fig.3Effectofincreaseinitialglucoseconcentrationonlysinefermentation目前，國(guó)內(nèi)已報(bào)道的大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)賴氨酸的最高轉(zhuǎn)化率為70%，最高賴氨酸質(zhì)量濃度為194.4g/L[18]。由于菌株存在差異，本實(shí)驗(yàn)中采用的菌株培養(yǎng)36h即可下罐，雖然最終賴氨酸質(zhì)量濃度比國(guó)內(nèi)最高水平(194.4g/L,48h)略低，但是發(fā)酵效率卻高得多。表4提高初糖質(zhì)量濃度對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響Table4Effectofinitialglucoseconcentrationonlysinefermentation項(xiàng)目初糖30g/L初糖40g/L最高OD56240.5±0.941.1±0.836h時(shí)OD56237.2±0.838.5±0.7賴氨酸/?L-1）177±4185±3滲透壓/m0sm2410±522490±60轉(zhuǎn)化率/%68.5±0.567.5±0.4產(chǎn)率/?L-1?h-1）6.1±0.26.6±0.2賴氨酸高轉(zhuǎn)化率條件下代謝通量分析賴氨酸屬于大宗氨基酸，全世界年產(chǎn)量高達(dá)220萬t。隨著市場(chǎng)的飽和，對(duì)大部分生產(chǎn)廠家而言轉(zhuǎn)化率是影響生產(chǎn)成本的最關(guān)鍵的因素，為了分析在高轉(zhuǎn)化率的賴氨酸發(fā)酵過程中大腸桿菌的代謝特點(diǎn)，筆者計(jì)算了高轉(zhuǎn)化率工藝條件下大腸桿菌的胞內(nèi)代謝通量，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。當(dāng)OD562達(dá)到19.5時(shí)向培養(yǎng)基中加入甜菜堿可以將轉(zhuǎn)化率由對(duì)照組的65%提升至68.5%（為筆者本次研究中的最高轉(zhuǎn)化率），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胞內(nèi)代謝通量分析結(jié)果見圖4，圖中代謝反應(yīng)旁的數(shù)字為相對(duì)代謝通量，其中葡萄糖吸收速率設(shè)定為100，其他速率根據(jù)與葡萄糖吸收速率的關(guān)系歸一化得到。雖然無法利用代謝通量分析發(fā)現(xiàn)甜菜堿在賴氨酸發(fā)酵過程中的作用，但是通過高/低轉(zhuǎn)化率發(fā)酵條件下代謝通量的比較仍然可以分析賴氨酸發(fā)酵過程中微觀代謝的特點(diǎn)，從而找到影響轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素，為高轉(zhuǎn)化率菌株的代謝改造指明方向。圖4高/低轉(zhuǎn)化率條件下大腸桿菌相對(duì)代謝通量分布Fig.4RelativemetabolicfluxdistributionofE.coliunderhigh/lowyield賴氨酸發(fā)酵過程中反應(yīng)r2（6-磷酸葡萄糖-6-磷酸果糖）的代謝通量數(shù)值為負(fù)數(shù)，說明該反應(yīng)的代謝方向與定義方向相反，即由磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的6-磷酸果糖會(huì)逆流生成6-磷酸葡萄糖，并再次進(jìn)入磷酸戊糖途徑。由于賴氨酸合成過程中需要消耗4個(gè)NADPH，而磷酸戊糖途徑是NADPH的主要來源，r2代謝流方向與正常糖酵解途徑方向相反是賴氨酸發(fā)酵過程中的一個(gè)重要特征。果糖吸收后會(huì)生成1,6-二磷酸果糖，無法通過該反應(yīng)進(jìn)入磷酸戊糖途徑，因此確保葡萄糖原料在發(fā)酵前不轉(zhuǎn)化成果糖是保證賴氨酸高轉(zhuǎn)化率的條件之一?？梢钥闯?，高轉(zhuǎn)化率條件下，r2的代謝通量較對(duì)照組提高了43%，因此通過提高反應(yīng)r2來提高磷酸戊糖途徑的通量比例是高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵之一。賴氨酸發(fā)酵過程中另一個(gè)特點(diǎn)是TCA循環(huán)通量較低，見圖4。賴氨酸發(fā)酵過程中，由于大量丙酮酸被用作賴氨酸合成的前體，只能產(chǎn)生較少的乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)，最終限制了TCA循環(huán)的通量。而高轉(zhuǎn)化率條件下TCA循環(huán)較對(duì)照組降低了18.6%(見圖4,r11:檸檬酸-a-酮戊二酸)。上述現(xiàn)象說明要保證賴氨酸發(fā)酵的高轉(zhuǎn)化率必須降低TCA循環(huán)的通量，同時(shí)還要保證TCA循環(huán)有一定的活性以確保菌體的正常生長(zhǎng)。如果能夠設(shè)計(jì)出一種在生長(zhǎng)結(jié)束后大大降低TCA循環(huán)通量的生物組件，必然能夠極大提高賴氨酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率。3結(jié)論主要研究了賴氨酸發(fā)酵過程中滲透壓對(duì)賴氨酸生產(chǎn)的影響，并通過調(diào)整菌體對(duì)滲透壓的耐受性來提高發(fā)酵強(qiáng)度(從5.6g/(L?h)提升至6.6g/(L?h))和轉(zhuǎn)化率(從65%提升至68.5%)。首先，在發(fā)酵0h時(shí)添加賴氨酸或者氯化鈉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高滲透壓會(huì)在一定程度上抑制賴氨酸的合成。然后，在不同OD562條件下添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)表明改變甜菜堿的添加時(shí)機(jī)可以改善菌體對(duì)滲透壓的耐受性，當(dāng)OD562為19.5時(shí)添加甜菜堿可以較對(duì)照組提高1.5%的轉(zhuǎn)化率。為了進(jìn)一步提高發(fā)酵指標(biāo)，通過提高發(fā)酵0h時(shí)糖的質(zhì)量濃度來提高初始滲透壓。結(jié)果表明：提高發(fā)酵初期滲透壓有利于提高菌體對(duì)后期高滲透壓的耐受性，有利于提升發(fā)酵強(qiáng)度(從6.1g/(L?h)提高至6.6g/(L?h)),然而，由于菌體質(zhì)量濃度的提高，最終轉(zhuǎn)化率略有下降。最后，為探索高轉(zhuǎn)化率條件下大腸桿菌的代謝特點(diǎn)，對(duì)高轉(zhuǎn)化率發(fā)酵條件下菌體胞內(nèi)代謝進(jìn)行了代謝通量分析，發(fā)現(xiàn)6-磷酸果糖的逆向轉(zhuǎn)化和低的TCA循環(huán)通量是賴氨酸高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素。參考文獻(xiàn)：相關(guān)文獻(xiàn)】王洪，喻書文,張福安?結(jié)晶葡萄糖母液對(duì)賴氨酸發(fā)酵過程的影響[J].發(fā)酵科技通訊,2018,47(3):184-188.SANCHEZS,RODRGUEZ-SANOJAR,RAMOSA.etal.Ourmicrobesnotonlyproduceantibiotics,theyalsooverproduceaminoacids[J].Thejournalofantibiotics,2018,71(1):26-36.LOTHARE,MICHAELB.Agiantmarketandapowerfulmetabolism:L-lysineprovidedbyCorynebacteriumglutamicum[J].Appliedmicrobiologyandbiotechnology,2015,99(8):3387-3394.HENDRIKR,REINHARDK,SUSANNEM.Impactofosmoticstressonvolumeregulation,cytoplasmicsolutecompositionandlysineproductioninCorynebacteriumglutamicumMH20-22B[J].Journalofbiotechnology,2003,104(1):87-97.XUJZ,XIAXH,ZHANGJL,etal.Anoverlookedeffectofglycinebetaineonfermentation:preventscaramelizationandincreasestheL-lysineproduction[J].Journalofmicrobiologyandbiotechnology,2014,24(10):1368-1376.⑹陳寧，范曉光?氨基酸生產(chǎn)菌株的研究熱點(diǎn)及發(fā)展動(dòng)向[J].發(fā)酵科技通訊,2016,45⑴:1-6.王健，路鵬，張昕?氨基酸及衍生物生產(chǎn):生物制造重要組成部分[J].發(fā)酵科技通訊,2016,45⑴:7-11.AKIRAI,RIET,CHIEK,etal.Improvedproductionofl-lysinebydisruptionofstationaryphase-specificrmfgeneinEscherichiacoli[J].Journalofbiotechnology,2005,117(1):111-118.CSONKAL.Physiologicalandgeneticresponsesofbacteriatoosmoticstress[J].Microbiologicalreviews,1989,53(1):121-147.KEMPFB,BREMERE.Uptakeandsynthesisofcompatiblesolutesasmicrobialstressresponsestohigh-osmolalityenvironments[J].Archivesofmicrobiology,1998,170(5):319-330.UNDERWOODS,BUSZKOM,SHANMUGAMK,etal.LackofprotectiveosmolyteslimitsfinalcelldensityandvolumetricproductivityofethanologenicEscherichiacoliKO11duringxylosefermentation[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,2004,70(5):2734-2740.ZHOUS,GRABART,SHANMUGAMK,etal.Betainetripledth