動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法課件

第五節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法一細(xì)胞分離1離心分離法

用于從含有細(xì)胞的體液如血液、羊水、胸腹水中分離細(xì)胞。一般用800～1000rpm離心5～10min。2消化分離法先從生物體取來組織塊，將其剪碎，并用消化液將其消化，使組織松散成細(xì)胞懸液，然后用緩沖液洗滌、離心、去除殘留的消化液而獲得所需的細(xì)胞。常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰酶－檸檬酸鹽、胰酶－EDTA、膠原酶、鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等。二細(xì)胞計(jì)數(shù)1血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)2自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)3結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)法4MTT染色計(jì)數(shù)法三細(xì)胞傳代1懸浮細(xì)胞的傳代

加入一倍或幾倍的生長液，然后分種兩只或多只培養(yǎng)瓶即可。2貼壁細(xì)胞的傳代消化前需用肉眼或鏡下觀察需消化的細(xì)胞，確認(rèn)細(xì)胞有無污染；加入消化液量要適當(dāng)，以搖動(dòng)時(shí)能蓋滿單層細(xì)胞為度；消化時(shí)間不宜過久，一般在室溫下靜置2～5min,當(dāng)見細(xì)胞層出現(xiàn)麻布樣網(wǎng)孔時(shí)，即可倒去消化液。終止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培養(yǎng)基。四細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇將細(xì)胞放入試管內(nèi)，在冰浴條件下加入預(yù)冷的冰凍保護(hù)劑（二甲基亞砜+山梨醇+甘油+蔗糖）。密封試管，繼續(xù)在冰浴中停留15min。然后試管以1℃/min的速度冷卻，降到-40℃，在-40℃停留2h后投入液氮罐（-196℃）。1細(xì)胞的凍存2細(xì)胞的復(fù)蘇復(fù)溫速率復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度。一般來說復(fù)蘇速度越快越好。常規(guī)的做法是，在37℃水浴中，于1～2min內(nèi)完成復(fù)溫。第六節(jié)動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式

已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細(xì)胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。依細(xì)胞種類：原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)依培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)依培養(yǎng)器和方式:靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、固定床或流化床培養(yǎng)。生產(chǎn)實(shí)際來看：懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和貼壁-懸浮培養(yǎng)。一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法1、懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）讓細(xì)胞自由的懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行生長繁殖。適用細(xì)胞類型：懸浮細(xì)胞，兼性貼壁細(xì)胞，雜交瘤設(shè)備：通氣攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器。生產(chǎn)藥物：單克隆抗體；干擾素。2、貼壁培養(yǎng)

必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。適用細(xì)胞類型：貼壁依賴型細(xì)胞，兼性貼壁細(xì)胞?；|(zhì)要求：具有凈陽電荷和高度表面活性。對(duì)微載體而言還要求具有一定電荷密度。優(yōu)點(diǎn)：a容易更換培養(yǎng)液，細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

b容易采用灌流培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的，因細(xì)胞被固定，不需過濾系統(tǒng)。

c當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時(shí)，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。

缺點(diǎn)：a操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積。b培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧效果差。c不能有效地監(jiān)控細(xì)胞的生長。貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：中空纖維；玻璃珠；微載體培養(yǎng)。3、貼壁-懸浮培養(yǎng)，或稱假懸浮培養(yǎng)將懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法。①微載體培養(yǎng)：細(xì)胞貼附在載體表面。創(chuàng)造大的貼附面積，供細(xì)胞貼附生長增殖；載體體積小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)。載體：葡聚糖、聚苯乙烯、膠原等。

②包埋或微囊培養(yǎng)：將細(xì)胞包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)。可用于包埋細(xì)胞的載體材料為：人工合成的高分子聚合物；糖類如纖維素等；蛋白質(zhì)如膠原、纖維蛋白等。包埋法：將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法。優(yōu)點(diǎn)：步驟簡單，條件溫和，負(fù)荷量大，細(xì)胞泄露少，抗機(jī)械剪切。③結(jié)團(tuán)培養(yǎng)：利用細(xì)胞本身形成結(jié)團(tuán)的特點(diǎn)，相互結(jié)團(tuán)后再用懸浮的方法培養(yǎng)，操作簡便，節(jié)省了用于微載體的成本。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式1、分批式操作將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，此后細(xì)胞不斷增長，產(chǎn)物不斷形成和積累，最后將條件培養(yǎng)基，即經(jīng)培養(yǎng)已含有細(xì)胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。

另一種是先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器，待細(xì)胞生長至一定密度后，向反應(yīng)器內(nèi)加入誘導(dǎo)劑或病毒等，經(jīng)一段時(shí)間作用后，將反應(yīng)物取出。2、半連續(xù)式操作

當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時(shí)間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞、載體一起，然后補(bǔ)充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。

該操作方式在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛采用，它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，而且可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。3、灌流式操作

當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞被固定，在取出部分條件培養(yǎng)基和補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞基本上都被保留在反應(yīng)器內(nèi)。第六節(jié)動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及

其基本結(jié)構(gòu)1、攪拌式生物反應(yīng)器2、氣升式生物反應(yīng)器3、中空纖維式生物反應(yīng)器4、透析袋或膜式生物反應(yīng)器5、固定床或流化床式生物反應(yīng)器機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器（1）罐體的高徑比一般采用1-1.5：1，利于增大與空氣的接觸面（2）為防止攪拌產(chǎn)生的切力損傷細(xì)胞，攪拌速度慢，一般在20-100r/min（3）采用無氣泡通氣系統(tǒng)，防止氣泡破裂時(shí)產(chǎn)生的應(yīng)力對(duì)細(xì)胞的損傷（4）高密度、長時(shí)間培養(yǎng)以及提高反應(yīng)器的生產(chǎn)效率考慮，反應(yīng)器常常需要配備有進(jìn)出液體系統(tǒng)，以便進(jìn)行灌流培養(yǎng)，并有使細(xì)胞與培養(yǎng)基分離使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)的裝置。氣升式生物反應(yīng)器

與攪拌式生物反應(yīng)器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和營養(yǎng)的傳遞好，由于沒有了機(jī)械攪拌的結(jié)構(gòu)，有利于設(shè)備的密封，降低了造價(jià)。高徑比一般在10：1左右。中空纖維反應(yīng)器由數(shù)百乃至數(shù)千根中空纖維集束組成的反應(yīng)器，纖維的材料為聚砜或丙烯共聚物，纖維壁厚為50-100m，呈多孔性，內(nèi)層為超濾膜，內(nèi)腔直徑為200m，兩端用環(huán)氧樹脂等材料將纖維粘和在一起，并使內(nèi)腔開口于外加的塑料圓筒，使形成兩個(gè)隔開的腔。①不能重復(fù)使用；②不能耐受高壓滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌；③難以取樣檢測(cè)。膜式生物反應(yīng)器在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，會(huì)產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，如乳酸和氨等，對(duì)細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的產(chǎn)生會(huì)產(chǎn)生抑制作用，因此有些學(xué)者設(shè)計(jì)了透析袋或膜式反應(yīng)器，它們可將這些有害代謝產(chǎn)物透析或過濾掉，從而使細(xì)胞生長至更高密度，同時(shí)可根據(jù)需要選用不同相對(duì)分子質(zhì)量的膜，使產(chǎn)物保留在膜內(nèi)或與細(xì)胞分離開。結(jié)構(gòu)較簡單，裝填的材料可以是一切對(duì)細(xì)胞無毒、又有利于細(xì)胞貼附的材料，有實(shí)心載體和有孔載體兩類。WaveBioreactor二、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的

檢測(cè)控制系統(tǒng)

1、培養(yǎng)過程需檢測(cè)的物化參數(shù)直接在線檢出取樣離線檢測(cè)檢測(cè)后計(jì)算2、主要參數(shù)的檢測(cè)和控制方法2、主要參數(shù)的檢測(cè)和控制方法①溫度②pHa在培養(yǎng)初期，偏堿，控制進(jìn)二氧化碳量b當(dāng)細(xì)胞密度提高后控制NaHCO3的量③溶氧④攪拌⑤進(jìn)出液流量第七節(jié)動(dòng)物細(xì)胞制藥的前

景與展望一、提高產(chǎn)量、降低成本和改進(jìn)質(zhì)量方面的研究二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究三、組織工程的研究一、提高產(chǎn)量、降低成本和改

進(jìn)質(zhì)量方面的研究

為了提高產(chǎn)量，要提高細(xì)胞表達(dá)水平。為降低成本，須改進(jìn)培養(yǎng)基配方。為改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量，關(guān)鍵是糖基化質(zhì)量。改進(jìn)工藝，生產(chǎn)設(shè)備等二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：通過實(shí)驗(yàn)方法，人工地把人們想要研究的動(dòng)物或人類基因，或者是有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥物蛋白質(zhì)基因，通常稱為外源基因，導(dǎo)入動(dòng)物的受精卵（或早期胚胎細(xì)胞），使之與動(dòng)物本身的基因組整合在一起，這樣外源基因能隨細(xì)胞的分裂而增殖，并能穩(wěn)定地遺傳給下一代的一類動(dòng)物。一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫動(dòng)物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器,動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。1動(dòng)物血液生物反應(yīng)器

外源基因在血液中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫血液生物反應(yīng)器。大家畜的血液容量較大，利用動(dòng)物血液生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)或多肽等藥物己取得了一定進(jìn)展。外源基因編碼產(chǎn)物可直接從血清中分離出來,血細(xì)胞組分可通過裂解細(xì)胞獲得。2動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器外源基因在膀胱中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器,叫動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器。膀胱尿乳頭頂端表面可表達(dá)一組尿血小板溶素的膜蛋白,這種蛋白在膀胱中表達(dá)具有專一性,而且它的基因是高度保守的,將外源基因插入5′端調(diào)控序列中,就可以指導(dǎo)外源基因在尿中表達(dá)。3動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器利用哺乳動(dòng)物乳腺特異性表達(dá)的啟動(dòng)子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,指導(dǎo)外源基因在乳腺中表達(dá),并從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳液中獲取重組蛋白。牛、羊的乳中蛋白質(zhì)大多為酪蛋白、β-乳清蛋白、酸性蛋白、表達(dá)時(shí)需由特定的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)分泌出來，該啟動(dòng)子定位在乳腺細(xì)胞中?，F(xiàn)將該啟動(dòng)子克隆出來用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中。在山羊奶中生產(chǎn)ATT顯微注射儀示意圖自1982年P(guān)alimiter提出用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來生產(chǎn)藥用蛋白以來，發(fā)展迅速。優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量高成本低，質(zhì)量與天然一樣。缺點(diǎn)：外源基因與動(dòng)物本身的基因組整合率低，外源基因應(yīng)有的性質(zhì)得不到充分表現(xiàn)或不表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)如牛、羊和豬的整合率一般為1%左右。外源基因?qū)?dòng)物本身也有影響，它影響了動(dòng)物的健康。三、組織工程的研究

組織工程：通過對(duì)大量細(xì)胞的培養(yǎng)，并用細(xì)胞直接作為一種治療手段用于臨床，或用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)一步加工構(gòu)成一種組織，如人造皮膚、人造肝臟、人造胰腺、人造血管、人造骨等并用于臨床治療。3.2動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)和生理特點(diǎn)3.3生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得3.4動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基3.5動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法和操作方式3.6動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器及其檢測(cè)控制系統(tǒng)3.7動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景和展望一章回顧1、離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞分為那些類型及各自特點(diǎn).2、生產(chǎn)用的動(dòng)物細(xì)胞的種類及特點(diǎn)？3、常用的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類？4、如何進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)？5、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器有哪些類型？特點(diǎn)是什么？6、動(dòng)物細(xì)胞制藥有哪些新進(jìn)展？7、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)劑為什么加入小牛血清？7、請(qǐng)舉一例說明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物的方法8、生產(chǎn)類淋巴細(xì)胞干擾素的細(xì)胞是來自淋巴瘤患者，藥物經(jīng)人服用會(huì)致癌嗎？請(qǐng)分析原因。對(duì)其質(zhì)量有什么要求？1、離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞分為那幾類（）（）（）2、真核基因的表達(dá)載體分為那兩類（）和（）3、常用的載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法（）和（）4、按世界衛(wèi)生組織的規(guī)定，檢測(cè)產(chǎn)品的純度，必須使用（）（

）方法。懸浮細(xì)胞貼壁細(xì)胞兼性貼