生長(zhǎng)規(guī)律課件

第五章微生物的生長(zhǎng)規(guī)律及控制微生物的特點(diǎn)：個(gè)體微小肉眼看到或接觸到的微生物是成千上萬(wàn)個(gè)單個(gè)的微生物組成的群體。微生物接種是群體接種，接種后的生長(zhǎng)是微生物群體繁殖生長(zhǎng)。對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律的了解是對(duì)其進(jìn)行研究與利用的基礎(chǔ)一、微生物的個(gè)體生長(zhǎng)和同步生長(zhǎng)

1.

微生物個(gè)體細(xì)胞的生長(zhǎng)（1）細(xì)菌的生長(zhǎng)一個(gè)新生的細(xì)胞長(zhǎng)大到最后分裂為兩個(gè)子細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為細(xì)胞周期。在細(xì)胞周期內(nèi)主要的細(xì)胞學(xué)變化是細(xì)胞的表面生長(zhǎng)即細(xì)胞壁的增生、DNA的復(fù)制以及細(xì)胞分裂成子代細(xì)胞。（2）酵母菌的生長(zhǎng)酵母菌主要的繁殖方式是出芽，酵母菌細(xì)胞的生長(zhǎng)——芽細(xì)胞的生長(zhǎng)。酵母菌的細(xì)胞周期是兩次細(xì)胞分裂之間的時(shí)間，這個(gè)周期分為四個(gè)時(shí)期：間隔期G1、DNA合成期S、第二間隔期G2、有絲分裂期M.（3）霉菌的生長(zhǎng)絲狀真菌的生長(zhǎng)時(shí)從孢子萌發(fā)開(kāi)始的，以其菌絲頂端延長(zhǎng)的方式進(jìn)行的。當(dāng)菌絲伸長(zhǎng)到一定程度后就會(huì)出現(xiàn)分枝。2.微生物的同步生長(zhǎng)目前使用的方法：（1）電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超薄切片這種通過(guò)同步培養(yǎng)的手段而使細(xì)胞群體中各個(gè)體處于分裂步調(diào)一致的生長(zhǎng)狀態(tài)，稱(chēng)為同步生長(zhǎng)（synchronousgrowth）。獲得微生物同步生長(zhǎng)的方法：（1）環(huán)境條件誘導(dǎo)法氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成；細(xì)菌芽孢誘導(dǎo)發(fā)芽；藻類(lèi)細(xì)胞的光照、黑暗控制；用EDTA或離子載體處理酵母菌；短期熱休克（40℃）法等。（2）機(jī)械篩選法利用處于同一生長(zhǎng)階段細(xì)胞的體積、大小的相同性，用過(guò)濾法、區(qū)帶密度梯度離心法或膜洗脫法收集同步生長(zhǎng)的細(xì)胞。由于細(xì)胞的個(gè)體差異，同步生長(zhǎng)往往只能維持2-3個(gè)世代，隨后又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)生長(zhǎng)。二、單細(xì)胞微生物的典型生長(zhǎng)曲線生長(zhǎng)曲線（GrowthCurve）：

定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線，稱(chēng)為生長(zhǎng)曲線（growthcurve）。在微生物學(xué)中提到的“生長(zhǎng)”，均指群體生長(zhǎng)。細(xì)菌接種到定量的液體培養(yǎng)基中，定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。以培養(yǎng)時(shí)間為橫座標(biāo)以菌數(shù)為縱座標(biāo)作圖得到的一條反映細(xì)菌在整個(gè)培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線！根據(jù)微生物的生長(zhǎng)速率常數(shù)（growthrateconstant），即每小時(shí)的分裂次數(shù)（R）的不同，一般可把典型生長(zhǎng)曲線粗分為延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等4個(gè)時(shí)期。延滯期指數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期延滯期指數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期對(duì)于絲狀生長(zhǎng)的真菌和放線菌來(lái)說(shuō)，是一條“非典型”的生長(zhǎng)曲線，真菌的生長(zhǎng)曲線大致可分3個(gè)時(shí)期，即生長(zhǎng)延滯期、

快速生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)衰退期。分裂遲緩、代謝活躍①

生長(zhǎng)速率常數(shù)為零；②

細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng)，許多桿菌可長(zhǎng)成絲狀，Eg.巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）在延滯期末，細(xì)胞的平均長(zhǎng)度比剛接種時(shí)長(zhǎng)6倍；一般來(lái)說(shuō)處于遲緩期的細(xì)菌細(xì)胞體積最大！1.延滯期的特點(diǎn)細(xì)胞處于活躍生長(zhǎng)中，只是分裂遲緩。在此階段后期，少數(shù)細(xì)胞開(kāi)始分裂，曲線略有上升。③細(xì)胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性；④合成代謝十分活躍，核糖體、酶類(lèi)和ATP合成加速，易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶；⑤對(duì)外界不良條件如NaCI溶液濃度、溫度和抗生素等理化因素反應(yīng)敏感。

微生物接種到一個(gè)新的環(huán)境，暫時(shí)缺乏分解和催化有關(guān)底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。調(diào)整代謝2.遲緩期出現(xiàn)的原因種子的接種齡子代培養(yǎng)物的延滯期對(duì)數(shù)期短穩(wěn)定期居中延滯期或衰亡期長(zhǎng)（3）接種量

接種量的大小明顯影響延滯期的長(zhǎng)短。接種量小延滯期長(zhǎng)接種量大延滯期短（1）通過(guò)遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使延滯期縮短；（2）利用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作為種子；（3）盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；（4）適當(dāng)擴(kuò)大接種量；3.生產(chǎn)實(shí)踐中縮短延滯期的常用手段（二）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（Logarithmicphase

）又稱(chēng)指數(shù)生長(zhǎng)期（Exponentialphase）。指在生長(zhǎng)曲線中，緊接著延滯期的一段細(xì)胞數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)的時(shí)期。指數(shù)期1.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的特點(diǎn)①生長(zhǎng)速率常數(shù)R最大，因而細(xì)胞每分裂一次所需的時(shí)間——代時(shí)（generationtime，G，又稱(chēng)世代時(shí)間或增代時(shí)間）或原生質(zhì)增加一倍所需的倍增時(shí)間（doublingtime）最短；②細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)（balancedgrowth），菌體各部分的成分十分均勻；③酶系活躍，代謝旺盛；

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌個(gè)體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛、生長(zhǎng)迅速、代時(shí)穩(wěn)定，所以是研究微生物基本代謝及遺傳特性的良好材料。它也常在生產(chǎn)上用作種子，使微生物發(fā)酵的遲緩期縮短，提高經(jīng)濟(jì)效益。2.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3個(gè)重要參數(shù)（1）繁殖代數(shù)（n）x2=x1·2n

lgx2–lgx1n=————————=3.322（lgx2–lgx1）

lg2（2）生長(zhǎng)速率常數(shù)（R）n3.322（lgx2–lgx1）R=————————=————————————————

t2–t1t2–t1

（3）代時(shí)（G）1t2–t1G=————=————————————————R3.322（lgx2–lgx1）

在細(xì)菌個(gè)體生長(zhǎng)里，每個(gè)細(xì)菌分裂繁殖一代所需的時(shí)間為代時(shí)（Generationtime）；在群體生長(zhǎng)里細(xì)菌數(shù)量增加一倍所需的時(shí)間稱(chēng)為倍增時(shí)間（Doublingtime）。影響微生物增代時(shí)間（代時(shí)）的因素①菌種，不同的微生物及微生物的不同菌株代時(shí)不同；②營(yíng)養(yǎng)成分，在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)代時(shí)短，反之則長(zhǎng)；③營(yíng)養(yǎng)物濃度，營(yíng)養(yǎng)物的濃度可影響微生物的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)總量，在一定范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速率與營(yíng)養(yǎng)物濃度呈正比；凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長(zhǎng)速率的營(yíng)養(yǎng)物成分，就稱(chēng)為生長(zhǎng)限制因子（growyh-limitedfactor）。④培養(yǎng)溫度，在一定范圍，生長(zhǎng)速率與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)。（三）穩(wěn)定期（stationaryphase）又稱(chēng)恒定期或最高生長(zhǎng)期。其特點(diǎn)是生長(zhǎng)速率常數(shù)R等于0，即處于新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，或正生長(zhǎng)與負(fù)生長(zhǎng)相等的動(dòng)態(tài)平衡之中。穩(wěn)定期這時(shí)的菌體產(chǎn)量達(dá)到了最高點(diǎn)，而且菌體產(chǎn)量與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗間呈現(xiàn)出一定的比例關(guān)系，這一關(guān)系就是生長(zhǎng)產(chǎn)量常數(shù)Y（或稱(chēng)生長(zhǎng)得率，growthyield）。

x–x0

x–x0Y=——————=——————C0–CC0

x——穩(wěn)定期時(shí)的細(xì)胞干重（g／ml培養(yǎng)液），x0——?jiǎng)偨臃N時(shí)的細(xì)胞干重，C0——限制性營(yíng)養(yǎng)物的最初濃度（g／ml），C——穩(wěn)定期時(shí)限制性營(yíng)養(yǎng)物的濃度（由于計(jì)算Y時(shí)必須用限制性營(yíng)養(yǎng)物，所以C應(yīng)等于0）。進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞重要的分化調(diào)節(jié)階段，細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始積聚糖原、異染顆粒和脂肪等內(nèi)含物；芽孢桿菌一般在這時(shí)開(kāi)始形成芽孢或建立自然感受態(tài)等；有的微生物在穩(wěn)定期時(shí)還開(kāi)始合成抗生素等次生代謝產(chǎn)物（secondarymetabolites）——穩(wěn)定期產(chǎn)物（idiolites）。以指數(shù)期為主的菌體生長(zhǎng)期（trophophase）以穩(wěn)定期為主的代謝產(chǎn)物合成期（idiophase）生長(zhǎng)期穩(wěn)定期到來(lái)的原因①營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡；②營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如C／N比值不合適等；③酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產(chǎn)物的累積；④

pH、氧化還原勢(shì)等理化條件越來(lái)越不適宜等。以生產(chǎn)菌體或與菌體生長(zhǎng)相平行的代謝產(chǎn)物（SCP、乳酸等）為目的的某些發(fā)酵生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期；對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐的指導(dǎo)意義對(duì)維生素、堿基、氨基酸等物質(zhì)進(jìn)行生物測(cè)定（bioassay）來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定期是最佳測(cè)定時(shí)期；通過(guò)對(duì)穩(wěn)定期到來(lái)原因的研究，還促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝、技術(shù)的創(chuàng)建。可延長(zhǎng)穩(wěn)定生長(zhǎng)期，以獲得更多的菌體物質(zhì)或積累更多的代謝產(chǎn)物。生產(chǎn)上的措施補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）取走代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)pH調(diào)節(jié)溫度對(duì)好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩（四）衰亡期（declinephase或deathphase）在衰亡期中，個(gè)體死亡的速度超過(guò)新生的速度，整個(gè)群體呈現(xiàn)負(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)（R為負(fù)值）。衰亡期細(xì)胞形態(tài)發(fā)生多形化，例如會(huì)發(fā)生膨大或不規(guī)則的退化形態(tài)；有的微生物因蛋白水解酶活力的增強(qiáng)而發(fā)生自溶（autolysis）；有的微生物在這一期合成或釋放對(duì)人類(lèi)有益的抗生素等次生代謝產(chǎn)物；在芽孢桿菌中，芽孢釋放等。產(chǎn)生衰亡期的原因外界環(huán)境對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)越來(lái)越不利，Eg.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累等，從而引起細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過(guò)合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體死亡。該時(shí)期死亡的細(xì)菌以對(duì)數(shù)方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會(huì)使細(xì)菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。不同的微生物或同一種微生物對(duì)不同物質(zhì)的利用能力是不同的。有的物質(zhì)可直接被利用（Eg.葡萄糖或NH4+等）——稱(chēng)為速效碳源（或氮源）；有的需要經(jīng)過(guò)一定的適應(yīng)期后才能獲得利用能力（Eg.乳糖或NO3-等）——稱(chēng)為遲效碳源（或氮源）。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有這兩類(lèi)碳源（或氮源）時(shí)，微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)形成二次生長(zhǎng)現(xiàn)象。由于采用活菌計(jì)數(shù)比較麻煩，并要求嚴(yán)格進(jìn)行操作，否則不易得到準(zhǔn)確的結(jié)果，重復(fù)性也差，因此在實(shí)際工作中多采用分光光度計(jì)測(cè)定OD值的方法繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)生長(zhǎng)，最后一次收獲。分批培養(yǎng)（batchculture）or密閉培養(yǎng)（closedculture）培養(yǎng)基一次加入，不予補(bǔ)充，不再更換。連續(xù)培養(yǎng)（Continousculture）又稱(chēng)開(kāi)放培養(yǎng)（openculture），在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過(guò)一定的方式使微生物能以恒定的比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)并能持續(xù)生長(zhǎng)下去的一種培養(yǎng)方法。培養(yǎng)過(guò)程中不斷的補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物是實(shí)現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。控制連續(xù)培養(yǎng)的方法恒濁連續(xù)培養(yǎng)不斷調(diào)節(jié)流速而使細(xì)菌培養(yǎng)液濁度保持恒定恒化連續(xù)培養(yǎng)保持恒定的流速link1四、微生物的高密度培養(yǎng)微生物的高密度培養(yǎng)（highcell-densityculture，HCDC）也稱(chēng)高密度發(fā)酵，一般是指微生物在液體培養(yǎng)中細(xì)胞群體密度超過(guò)常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)。現(xiàn)代高密度培養(yǎng)技術(shù)主要是在用基因工程菌（尤其是E.coli）生產(chǎn)多肽類(lèi)藥物的實(shí)踐中逐步發(fā)展起來(lái)的。Eg.人生長(zhǎng)激素、胰島素、白細(xì)胞介素類(lèi)和人干擾素等。

提高菌體培養(yǎng)密度產(chǎn)物的比生產(chǎn)率（單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量）減少培養(yǎng)容器的體積培養(yǎng)基的消耗“下游工程”（down-streamprocessing）中分離、提取的效率生產(chǎn)周期設(shè)備投入生產(chǎn)成本重要的實(shí)踐價(jià)值高密度培養(yǎng)的具體方法：（1）選取最佳培養(yǎng)基成分和各成分含量。（2）補(bǔ)料，這是工程菌高密度培養(yǎng)的重要手段之一。（3）提高溶解氧的濃度，提高好氧菌和兼性厭氧菌培養(yǎng)時(shí)的溶氧量也是高密度培養(yǎng)的重要手段之一。（4）防止有害代謝產(chǎn)物的生成。還沒(méi)有完呢，稍等片刻！下節(jié)課再見(jiàn)了……（一）恒濁連續(xù)培養(yǎng)

恒濁器（turbidostat）是一種根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長(zhǎng)密度，并借光電控制系統(tǒng)來(lái)控制培養(yǎng)液流速，以取得菌體密度高、生長(zhǎng)速度恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)器。測(cè)定所培養(yǎng)微生物的光密度值自動(dòng)調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度當(dāng)培養(yǎng)室中的濁度超過(guò)預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速加快，使?jié)岫冉档?；?dāng)培養(yǎng)室中的濁度低于預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速減慢，使?jié)岫壬?；恒濁培養(yǎng)器的工作精度是由光電控