蛋白質(zhì)的分離與純化

一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)與氨基酸相似，也具有兩性電離的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的基團(tuán)，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，因此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)。它的兩性電離比氨基酸復(fù)雜?，F(xiàn)在是1頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五

對(duì)某一蛋白質(zhì)而言，在某一pH下，當(dāng)它所帶正負(fù)電荷相等的時(shí)候，該溶液的pH就稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的大小與蛋白質(zhì)的氨基酸組成有關(guān)。

現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五二、蛋白質(zhì)的大小與形狀現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五π:滲透壓R:氣體常數(shù)T：絕對(duì)溫度c:溶質(zhì)的濃度（g/m3）π/c對(duì)c作圖，在c趨近于零時(shí)得出Mr現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五菲克第二定律擴(kuò)散不僅與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)，還與分子形狀有關(guān)由于濃度差異引起的溶質(zhì)分子的凈遷移成為平衡遷移或者遷移。菲克第一定律現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五離心機(jī)類別低速離心機(jī)高速離心機(jī)超速離心機(jī)現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五①離心力“F”

當(dāng)一個(gè)粒子（生物大分子或細(xì)胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時(shí)，此離心力“F”由下式定義，即：a-粒子旋轉(zhuǎn)的加速度，m-沉降粒子的有效質(zhì)量，ω-粒子旋轉(zhuǎn)的角速度，r-粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)?，F(xiàn)在是8頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五②相對(duì)離心力“RCF”相對(duì)離心力是指在離心場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”（980cm/sec2）,“RCF”相對(duì)離心力可用下式計(jì)算：RCF=1.119×10－5×(rpm)2r(rpm—revolutionsperminute每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min)現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五③離心機(jī)轉(zhuǎn)速與離心力列線計(jì)算圖一般情況下，低速離心時(shí)常以轉(zhuǎn)速“rpm”來(lái)表示，高速離心時(shí)則以“g”

表示。在報(bào)告超離心條件時(shí)，通?？偸怯玫匦囊Φ谋稊?shù)“×g”代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“rpm”.轉(zhuǎn)速與離心力的換算:先在r標(biāo)尺上取已知的半徑和在rpm標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，與圖中RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)即為相應(yīng)的相對(duì)離心力數(shù)值?，F(xiàn)在是10頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五超離心法類別1#密度梯度離心法（densitygradient）2*沉降速度法（sedimentationvelocity）3*沉降平衡法（sedimentationeguilibrium）現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五密度梯度離心法#

生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個(gè)小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。蔗糖密度梯度蔗糖濃度離心管現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五顆粒物質(zhì)或溶質(zhì)在超速離心場(chǎng)中的沉降速率。用小寫斜體s表示。s=v/a，其中a為重力或離心加速度，v為沉降速度，即沉降系數(shù)為每單位離心力場(chǎng)的沉降速度?，F(xiàn)在是13頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五在較低速度（8,000-20,000r/min）的離心場(chǎng)中，離心開始時(shí)，分子顆粒發(fā)生沉降，由于沉降的結(jié)果造成濃度梯度。因而產(chǎn)生了擴(kuò)散作用，擴(kuò)散力的作用方向正與離心力相反，當(dāng)凈離心力與擴(kuò)散平衡時(shí)，在離心池內(nèi)從液面到池低形成一個(gè)由低到高的恒定濃度梯度。如果測(cè)得相關(guān)參數(shù)即可算出生物分子的分子量。離心力x1軸心液面離心軸擴(kuò)散力x2現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五原理示意圖現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五Vt：柱床“總?cè)莘e”，Vo：即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相容積Vi：即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的容積。Vg：凝膠本身的容積；Vt＝Vo十Vi十Vg或Vt-Vo=Vi十Vg，凝膠床總體積

現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五分配系數(shù)（Kd）

0＜Kd＜1，Ve在Vo與Vo十Vi之間變化Ve：為實(shí)際測(cè)得的洗脫容積，自樣品加入到組分最大濃度(峰)出現(xiàn)時(shí)所流出的容積Ve＝Vo十KdVi現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五

Ve=K1-K2lgMK1、K2為常數(shù)，Ve可用如下表達(dá)式代替，Ve-Vo（分離體積），Ve/Vo（相對(duì)保留體積），Ve/Vt（簡(jiǎn)化洗脫體積），Keff（相對(duì)洗脫體積）在不同型號(hào)凝膠上蛋白質(zhì)的選擇曲線的差異Ve與相對(duì)分子量的關(guān)系現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五排阻范圍的選擇現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五凝膠裝柱

①將層析柱垂直裝載支架上，將下端輸液管夾緊；②向柱中加入約1/3體積的0.9％NaCl溶液；③將一細(xì)玻棒伸入柱內(nèi)，靠近管內(nèi)壁，順著玻棒緩慢的向管內(nèi)加入混勻的凝膠溶液；④凝膠加至層析柱頂端約3cm時(shí)，打開柱下端2·nim。④連續(xù)而緩慢的加凝膠直到穩(wěn)定在離管口約5cm處。（防止空氣進(jìn)入凝膠床）

現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五柱層析系統(tǒng)的安裝現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五凝膠層析中的分離行為

藍(lán)葡聚糖（蘭色）、血紅蛋白（紅色）、鉻酸鉀(黃色)

現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五電泳現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)的沉淀現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五

使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀，方法有：1.鹽析：在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五2.有機(jī)溶劑沉淀法：在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五3.重金屬鹽沉淀（條件：pH稍大于pI為宜）：在蛋白質(zhì)溶液中加入重金屬鹽溶液，會(huì)使蛋白質(zhì)沉淀。重金屬沉淀法的機(jī)理：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。重金屬沉淀蛋白質(zhì)會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性，長(zhǎng)期從事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，以防止重金屬離子被機(jī)體吸收后造成對(duì)機(jī)體的損害?，F(xiàn)在是33頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五4.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI）生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀?！笆潦Y”的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固變性而成為不能被消化的“柿石”?，F(xiàn)在是34頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五5.弱酸或弱堿沉淀法：用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH處于等電點(diǎn)處，使蛋白質(zhì)沉淀。弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷?，F(xiàn)在是35頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五分離純化蛋白質(zhì)的一般原則研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：要求純度高，不變性；提取活性的酶或蛋白質(zhì)：必須保持天然活性狀態(tài)；作為藥物或食品添加劑：純度要求一般。蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟材料的選擇→原料的預(yù)處理→蛋白質(zhì)的抽提→從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)→純化→蛋白質(zhì)的結(jié)晶現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五1.原料的選擇：要求含待分離的蛋白質(zhì)豐富，廉價(jià)，易得，容易收集，新鮮無(wú)腐敗。2.原料的預(yù)處理：如果待分離蛋白質(zhì)為胞外蛋白質(zhì)，材料破碎后，用適當(dāng)?shù)娜軇┲苯映樘?；若待分離蛋白質(zhì)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)，則需要破碎細(xì)胞膜，再用適當(dāng)?shù)娜軇┏樘帷?.從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)：常用鹽析法、低溫乙醇沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法。現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五4.純化：將沉淀的蛋白質(zhì)溶解，再選擇適當(dāng)?shù)募兓椒ǎ玫郊兌缺容^高的蛋白質(zhì)溶液。純化方法：透析或超濾、電泳法、凝膠過(guò)濾法、離子交換層析、吸附層析法、超速離心法等。5.蛋白質(zhì)的結(jié)晶：從溶液中重新沉淀蛋白質(zhì)。現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五五蛋白質(zhì)分離純化的方法

（一）據(jù)分子量大小不同的方法1透析與超濾現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五利用壓力、抽濾（A）或離心力（B）等多種形式，強(qiáng)行使水和其它小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)。為了避免被膜截留的蛋白質(zhì)在膜表面上堆積，現(xiàn)常用截向流過(guò)濾的方法，即液體在泵驅(qū)動(dòng)下沿著與膜表面相切方向流動(dòng)，在膜上形成壓力，使部分液體透過(guò)膜，而另一部分液體切向地流過(guò)表面將被膜截留的蛋白質(zhì)分子沖走。濾膜抽氣濾膜離心現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五2密度梯度離心3凝膠過(guò)濾以上兩種方法既可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，又可以用來(lái)分離蛋白質(zhì)現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五（二）利用溶解度的差別1等電點(diǎn)沉淀現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五2鹽溶與鹽析現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五無(wú)機(jī)鹽的種類及選擇Ks取決于鹽的性質(zhì)，與離子價(jià)數(shù)成正比，與離子半徑和溶液介電常數(shù)成反比。常見陰離子的鹽析作用順序：PO43-＞SO42-＞CHCOO-＞Cl-＞N03-＞Cl04-＞I-＞SCN-

陽(yáng)離子的鹽析作用順序?yàn)镹H4+＞K+＞Na+＞Mg2+鹽類必須溶解度大、受溫度影響小，而且鹽溶液密度不高?，F(xiàn)在是49頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五飽和溶液調(diào)整的計(jì)算V:需要加入飽和硫酸銨溶液的體積V0:原溶液的體積S1,S2:分別為原溶液和所需達(dá)到的硫酸銨飽和度現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五固體直接加入的計(jì)算W：將一升S1提高到S2時(shí)需加入的硫酸銨克數(shù)G和A為常數(shù)，受溫度影響現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五有機(jī)溶劑用量的計(jì)算

V=V0(S2-S1)/(100-S2)

V＝需加入有機(jī)溶劑的體積；V0＝蛋白溶液的原始體積；Sl＝蛋白溶液中有機(jī)溶劑的濃度；S2＝蛋白溶液中欲達(dá)到的有機(jī)溶劑濃度。

現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五3、溫度和pH對(duì)有機(jī)溶劑沉淀的影響現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五有機(jī)溶劑沉淀時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題低溫下操作中性鹽的鹽溶作用可減少變性多價(jià)陽(yáng)離子可降低蛋白質(zhì)的溶解度防止過(guò)量有機(jī)溶劑引起共沉淀沉淀應(yīng)盡快分離，并溶于緩沖液中現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五熱沉淀根據(jù)蛋白質(zhì)間的熱穩(wěn)定性的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)的熱沉淀，分離純化熱穩(wěn)定性高的目標(biāo)產(chǎn)物。熱沉淀是一種變性分離法，帶有一定的冒險(xiǎn)性，使用時(shí)需對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物和共存雜蛋白的熱穩(wěn)定性有充分的了解。

現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五（三）根據(jù)電荷不同的純化方法1電泳電泳分離蛋白質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移的差別達(dá)到分離目的的。蛋白質(zhì)樣品加到一塊預(yù)先制好的凝膠介質(zhì)上，只要在凝膠的兩端加上電場(chǎng)，就可以達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳（gelelectrophoresis）。凝膠可以是淀粉凝膠（starchgel）、瓊脂糖凝膠（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）。一般凝膠介質(zhì)中的pH被維持在堿性區(qū)，目的是使大多數(shù)蛋白質(zhì)都帶有負(fù)電荷，這樣它們可以向陽(yáng)極遷移。蛋白質(zhì)的遷移與蛋白質(zhì)的質(zhì)量和帶電荷的多少有關(guān)?，F(xiàn)在是57頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五電泳技術(shù)分類毛細(xì)管電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五2.聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,簡(jiǎn)稱PAGE)，也稱圓盤凝膠電泳或圓盤電泳(discgelelectrophoresis)，它是在區(qū)帶電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。它以聚丙烯Ift胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的二部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分是分離膠），這二部分凝膠的濃度（孔徑大?。?、緩沖液組分和離子強(qiáng)度,pH以及電場(chǎng)強(qiáng)度都是不同的，即不連續(xù)的。這樣,電泳時(shí)樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶（厚度約為0.1mm），然后再進(jìn)行電泳分離?，F(xiàn)在是59頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五

PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應(yīng)的催化系統(tǒng)有兩種。化學(xué)聚合:催化劑過(guò)硫酸銨(AP)，加速劑TEMED光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED不連續(xù)PAGE三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五3毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離，分離后的樣品依次通過(guò)設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測(cè)器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了快速和高效分離。毛細(xì)管電泳是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測(cè)定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等?，F(xiàn)在是61頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五4.等電聚焦（isoelectricfocusing）原理:在一定抗對(duì)流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過(guò)時(shí)，便形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過(guò)程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點(diǎn)得到分離。應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-pH10pH3+線性梯度現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五5離子交換層析通過(guò)改變離子強(qiáng)度和pH來(lái)完成低現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五陽(yáng)離子交換層析，洗脫液pH應(yīng)該從低到高，陰離子交換層析，pH應(yīng)該從高到低。蛋白質(zhì)濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管收集樣品的管帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管NaCl現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五C=CB-（CB-CA）（1-V2/V1）B1/A1

CA、CB＝梯度混合器A瓶、B瓶的濃度；A1、B1＝A瓶、B瓶的橫切面積；V2＝流經(jīng)層析柱的體積，V1＝梯度洗脫液的總體積?，F(xiàn)在是65頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五6層析聚焦法是在等電點(diǎn)聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點(diǎn)的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過(guò)程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時(shí)，由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出。在聚焦層析過(guò)程中，一種樣品分次加入時(shí)，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的時(shí)間進(jìn)行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚焦過(guò)程都能順利完成?，F(xiàn)在是67頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）層析時(shí)的聚焦效應(yīng)示意圖現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有74頁(yè)\編輯于星期五（四）利用選擇性吸附的純化方法

1.羥磷灰石層析

2.疏水作用層析

某些稱為吸附劑的固體物質(zhì)具有吸附能力，能夠?qū)⑵渌N類的分子吸附在自己的表面，吸附力的強(qiáng)弱因被吸物質(zhì)的性質(zhì)而異。吸附過(guò)程涉及范德華相互作用和氫鍵這些非離子吸